Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l.-продуцент моноклонального антитела к с-концевому участку а @ - цепи фибриногена человека

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения содержания фибриногена в плазме крови человека. Цель изобретения - получение штамма гибридомы, продуцирующей монАТ, взаимодействующие с фибриногеном, но не взаимодействующие с продуктами его деградации под действием плазмина. Штамм получают гибридизацией клеток миеломы X63, AG8.653 с клетками селезенки и мышей BALB/C, иммунизированных частично очищенными фрагментами фибриногена. Штамм культивируют в среде RPMI 1640 с 10% сыворотки эмбриона коровы, 4 мМ L - глутамина, 0,05 мМ меркаптоэтанола и антибиотиками, в атмосфере с 5% CO<SB POS="POST">2</SB>. Штамм прививается в брюшную полость сингенных мышей. МонАТ относится к субклассу IGGI. Специфичность связывания с А α - целью фибриногена определена методами твердофазного иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга. Штамм депонирован под номером ВСКК (П) N 323 D.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4663268/13 (22) 20-03.89 (46) 23. 08 ° 91 ° Бюл . t"- 3 1 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр (72) Г.П.Самохин, О.В.11итькевич, 3.А.Стрельцова, Т.H.Âëàñèê, Г.Ф.Калантаров и И.Н.Трахт (53) 578.085.23(088.8) (56) Thurlow P.I° .,, Соппе11ап I.È

Кеппеа11у D.À. — Thrombosis Res., 1987, 47, р. 427-439. (54) ШТАММ ГИБР1ЩНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ 11US tfUSCULUS L

ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА

К С-КОНЦЕВОМУ УЧАСТКУ Аа(-ЦЕПИ ФИБРИНОГЕНА ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения содержания Аибриногена в плазме крови человека.

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для определения содержания фибриногена в плазме кром человека.

Цель изобретения — получение штамма гибридомы, продуцирующей МонАТ, взаимодействующие с фибриногеном, но не взаимодействующие с продуктами его деградации под действием плазмина.

111тамм гибридомы 5А2 ВСКК (II)

N - 323D получают следующим образом.

Мьппей линии RALВ/с иммунизируют внутрибрюшинным введением 100 мкг препарата частично очищенных бромциано— вых фрагментов йибриногена человека

ÄÄSUÄÄ 1671687 А 1

Р1)5 С 12 Н 5/18, С 1? Р 21/08

Цель изобретения — получение штамма гибридомы, продуцирующей МонАТ, взаимодействующие с фибриногеном, но не взаимодействующие с продуктами его деградации под действием плазмина.

Штамм получают гибридизацией клеток миеломы Х63 A@8.653 с клетками селезенки и мышей BALB/с, иммунизированных частично очищеннып фрагментами фибриногена. Штамм культивируют в среде RP .fl 1640 с IOZ сыворотки эмбриона коровы, 4 мМ L-глутамина, 0,05 м11 меркаптоэтанола и антибиотиками, в атмосфере с 57 СО . Штамм прививается в брюшную полость сингенных мьппей. МонАТ относится к субклассу IpG1. Специфичность связывания с A0L-цепью *ибриногена определена методами твердобазного иммунойерментного анализа и иммуноблоттинга. Штамм депонирован под но- С мером ВСКК (II) 9 323D. (фракция от 20 до 70 кД) в 0,5 мл физиологического раствора, забуберенного фосйатами (ЗФР) (5 мЧ Na — фосфатный буфер; рН 7,2 — 7,4; 150 мМ 1)аС1), в полном адъюванте Фрейнда. Иммунизацию повторяют через 23 дня, вводя ннутрибрюшинно 100 мкг того же прела рата в ЗФР без адъюванта. Через три дня после этого 1х108 клеток селезенки иммунных мышей гибридизируют с бх х10 клеток миеломы мьппи Х63-Ag 8.653

7 с помощью 0,4 мл 45Х-ного раствора лолиэтиленгликоля (ПЭГ) мол.массы

2000, содержащего 107 диметилс ульфоксида, в течение t мин. После гибри167 1687

JtIt 311Itttl 11 ) T !I п3 к1? !, t l 3 )?с От 11 )1 клет ки выса I3;1!)ò в 96-лу;аа) аlliк 1?а)аеа?аt по

2х10 клет<)к 33 лунку ., ?ця культивироя

Г

Ва ния lt е а . ? tilt)IH гибридОВ испОль э чют 5 среду RP?11.-1640 с дебавлением 107. лошадиной и 10 ."7 та) ?я 3?.ей эмбриональной — 1, сь?воротки, 10 .1 гипоксантина, 4х х10 ?1 attltttollrvt)tt?ta и 1,6х10 . 11 тимидина. Гибриды-продуценты клонируют

2 раза методом предельных разведений, вьасевая пО 1 клетке в лчнкч содерЪ

;кащую 4х10 к.?с ток селезенки. После двух клонирований практически 1007. субклонов процчцирчют антитела к аЬиб — 15 риногену. 11родукц3?я антител сохраняется как минимум в течение 40 пассажей в культуре.

11тамм характеризуется следующими свойствами. 20

Среда для культивирования — среда

RP?fI-1640 с добавлением 107 телячьей эмбриональной сыворотки,4 мМ ?. — ãëþ— тамина, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептоми??ина и 0,05 мМ 25 меркаптоэтанола при 37 С в атмосфере 57 углекислоты.

Посевная доза — 10 клеток в 1 мл.

Через 3 — 4 дня концентрация антитела в культуральной жидкости достигает 30

20 — 30 мкг/мл. Кон-.,аминация бактериями, грибками и микоплазмой не обнаружена. Для длительного хранения гибридомные клетки морозят в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением

107. диметилсульа3)оксида. Режим замораживания — 4 С в 1 мин до +4 С, а затем — 1 С в 1 мин до -40 С, после чего клетки переносят в жидкий азот.

Клетки размораживают, перенося ампулу 40 из жидкого азота в водяную баню на

+370С. ,3?ля выращивания гибридомного штамма в асцитной hopMe клетки вводят внутрибрю?ш?ннО мышам БА?Я/с, обрабо- 45 таиным пристаном, в количестве 2

5х10 клеток на мьппь. Асцит созревает

6 через 12 — 14 дней. Секреция МонАт гибридомным штаммом сохраняется на протяжении 3 пассажей в асцитной форме. 1?oHAT, продуиируемое клетками штамма 5A?, относится к IgG1-подклассу и связьп3ается с эпитопом, расположенным в С-концевом участке А?)с ;цепи г)ибри)аоге??а человека.

СПЕГИ)ЬИЧНОС ГЬ ВЗаИМОдЕйетВИя МОНАТ определяют способом, при котором в качестве антигенов используют *ибри— ноген чеа?а)века или его фрагменты, ИММОб??Л??ЗО?3 Ill!Il,)Е На IT1 1(тtttt< а та)а 1)д,— фазный иммуноаЬерментный «)Зализ) илн разделенные электрофоре «и в полиакриламидном геле и перенесенные на лист нитроцеллюлозы (иммуноблоттинг).

Д)?я получения препарата МонАт в количестве, необходимом для проведения иммунохимических исследований, асцитную жидкость освобождают от клеток центрифугированием и добавляют сульаЬат натрия до конечной концентрации

187. Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 0,02 ?1 ??аН, РО (pH 8,0) и диализуют против этого же буаЬера. После диалиэа раствор наносят на колонку 16х200 мм с DFAE-Toyopearl

650 М, уравновешенную тем же буфером.

Антитела элюируют линейным градиентом

??аН РО (рН 8,0 — 1 10 — 160 мМ).

Иммуноглобулины класса IgG1 элюируют в интервале 60 — 80 мИ, чистота препарата по данным электрофореза в полиакриламидном геле составляет не менее 957.

Тестирование специфичности взаимо" действия МонАТ с антигенами методом твердофазного иммуноферментного анализа.

На полихлорвиниловую 96-ячеечную панель (Flow) для микротитрования сорбируют антиген — 2 мкг на ячейку в 50 мкл ЗФР при 4 С в течение ночи.

После этого в ячейках панели в течение 1 ч инкубируют по 200 мкл раствора казеина (2 мг/мл), содержащего

0,1Х твин-20 в ЗФР, для уменьшения неспецифического связывания антител с пластиком. Затем в ячейки вносят по 50 мкл раствора антител 5А2 в

0,05 M трис-буфере (рН 7,4), содержащем 0,15 М NaCI и 2. мг/мп казеина, и инкубируют 1 ч при 20 С.

После этого панель отмывают 3 раза струей воды и вносят по 50 мкл раствора конъюгата щелочной фосфатазы с антителами кролика против иммуноглобулинов мьппи, разведенного в 1000 раз тсм же буфером, и инкубируют в течение i ч. После 3-кратной промывки в ячейки вносят по 100 мкл раствора п-нитрофенилфосфата (1 мг/мл) в I07.-ном растворе диэтаноламина (рН

9,8), содержащем 1 мМ хлорида магния, и инкубируют до развития желтого окрашивания раствора в ячейках. Оптическую плотность раствора при длине волны

Eti7 EF>

405 tt t оыр .((.г((I 11 < t(i è ".II.IO t. t«:ð tспекrpohuтомстра.

В к а ч c T 13 o к О ((т Р о.((ь t t o t Î а 1 (т ы Г p t t u используют Лыброне(.ти((.

Результат((((о(.аз((вают, что антитела э(((Лективно связываются с фибриногеном человека, практически не взаимодействуя с фибронектином.

Определение специфичности антител

5А2 по отношению к цепям фибриногена.

Препарат фибриногена человека разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле с экспоненщ альным градиен— том концентрации полиакриламида от 7 15 до 187. в восстанавливающих условиях, и разделенные цепи *ибриногена электрофоретически переносят на нитроцеллюлозную мембрану. Иембрану окрашивают методом иммуноблоттинга, используя концентрацию антител 5A2i равную

5 мкг/мп. При этом наблюдают окрашивание полосы с мол. массой 70 к(, что соответствует Л ;цепи фибриногена.

Таким образом, полученное антитело взаимодействует с детерминантой, находящейся на А0 -цепи фибриногена.

Изучение специфичности антител 5А2 по отношению к протеолитическим фрагментам Йибриногена. 30

К раствору фибриногена (3 мг/мл) в 0,05 И трис-хлорида, 0,15 И хлорида натрия и 5 мИ хлорида кальция (pH 7,4) добавляют плазмин до 0,2 ед/мл и инкубируют при комнатной температуре. Че- 35 рез 1,2, 10,30 и 60 мин расщепление останавливают добавлением апротинина до 100 калликреиновых единиц на 1 мп.

Полученные препараты фибриногена различных степеней расщепление разделяют 40 гель-электрофорезом, переносят на нит-. роцеллюпозу и окрашивают методом иммуноблоттинга с использованием антител 5А2. При этом наблюдают окрашивание полос с мол .массами 340,45,22, 45

20,17 и 15 кД. Первая из них соответствует интактному, нерасщепленному фибриногену, остальные — продуктам его деградации. При этом через 30 мин остается лишь полоса с мол.массой 50

15 кД, а через 60 мин и она практически исчезает. В соответствии с известными данными, что наиболее чувствительным к действию плазмина является

С-концевой участок Аф;цепи, делают вывод о том, что антигенная детерминанта, узнаваемая антителом 5А2, находится именно в этом участке. Характерной особенностью детерминанты яв87 .((ted t Гя т i (то tttttt 1(Р ° tt."! (((еc t ы (t (toe T E>t0 рис (((епля(-тс я IT. (((э((1(в (°

П р и и е р 1. )3. вtttttt(v;at(rttxc. t;t

5Л2 на сшивку О -цег(е t ttt!iptt (ted (((а(,т 1— ром XIIIa.

При образовании тромба в ппа i.tt активируется специ(((ическая трд((сг(утаминаза (фактор XII I) которая еltllt вает -цепи Ьибрина с образованием

1 — /-димера и 0 -цепи с образованием полимеров, мол.масса которых может превышать 1000 к((. Участок сшивки

EEL-цепей находится в С вЂ” концевой част(( ((,— цепи, поэтому изучают влияние антитела 5А2 на этот процесс.

К 500 мкл донорской плазмы добавляют равный объем раствора антител 5А2 (? мг/мп) в 0,05 11 трис-хлорыдном буфере (РН 7,4), содержащем 0,15 И хло— рида натрия. Затем в плазму добавляют хлорид кальция до 20 мИ и тромбин до

1 ед/мл и инкубируют в течение ночи при 37 С. Образовавшийся сгусток измельчают и промывают несколько раз буфером. После этого проводят электро—

Ьоретический анализ полученного препарата в восстанавливающих условиях.

В качестве контролей служат образцы, в которые вместо антител 5А2 добавляют антитела, не взаимодействующие с компонентами сгустка, или антител не добавляют.

В препарате без добавленных антител или с антителами, не взаимодействующими со сгустком, электрофореграмма содержит две основных полосы. Первая с мол . массой около 90 кД соответствует - -димеру, вторая с мол. массой 53 к 1 соответствует Р -цепи фибрина.0(. -Цепь фибрина представлена высокомолекулярными полимерами, не входящими в гель. В присутствии антител 5А2 на электройореграмме появляются три дополнительные полосы. Полосы с мол. массами 50 и 25 кД соответствуют тяжелой и легкой цепям иммуноглобулина мьппи. Полоса с мол.массой

67 (с(соответствует несшитой(((,-цепи фибрина.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что антитело 5А2, специфически взаимодействуя с фибрином, включается в состав сгустка и при промывках не удаляется. Кроме того, это антитело ингибирует сшивку ф — цепей фибрина фактором XIIIa, не влияя на сшивку f-цепей. Поскольку предполагается, что сшивка 0(-цепей происходит с

1671687 формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Миз musculus T..

BCKK(II) 9 323D — продуцент моноклонального антитела к С-концевому участку А -цепи фибриногена человека.

Составитель Г.Игнатьева

Редактор И.дербак Техред М,яндык Корректор Л.Патай

Заказ 2803 Тираж 365 Подписное

ВН ЯПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 участием глутаминов 328 и 366, то можно полагать, что детерминанта для антитела 5А2 находится между этими остатками, так что антитело, связываясь с фибриногеном (фибрином), блокирует доступ фактора Kills к обоим глутаминам.

Пример 2. Определение изменения концентрации интактного фибриноге-,0 на в плазме человека.

В плазму человека вносят плазмин так, что его концентрация составляет

1,7 мг/мл, и инкубируют при комнатной температуре. Отбирают пробы плазмы: 15 до внесения плазмина через 5,20,60, 1800 и 3600 с. Для остановки реакции в пробы добавляют апротинин до

100 калликреиновых единиц на 1 мп.

В полихлорвиниловую 96-ячеечную па- 20 нель для микротитрования, покрытую предварительно антителами 5А2 (1 мкг в лунке) с последующим блокированием участков неспецифического связывания, вносят по 50 мкл отобранных проб, раз25 веденных в 100 раэ в трис-NaC1 буфере с казеином (рН 7,6), и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре.

После тщательной промывки ячеек пане° ли в ячейки, в которых инкубировали 30 плазму, разведенную в 100 раз, добавляют по 50 мкл конъюгата антител 5А2 с пероксидазой и инкубируют в течение

1 ч при комнатной температуре. Ячейки тщательно промывают и заполняют раст- 35 вором субстрата (в 2 мл 0,02 М цитратного буфера; рН 4,7), растворяют

20 мкл раствора ортофенипендиамина в метаноле концентрации 10 мг/мл и

1 мкп 30 перекиси водорода (по 100 мк 40 н ячейку) . Через 20 мин реакцию останавливают добавлением 507.-ной серной кислоты по 50 мкл в ячейку. Оптическую плотность растворов определяют с помощью автоматического микроспектрофотометра. Параллельно в этих же пробах (но с разведением в 5000 раз) провоДят определение концентрации фибриногена с помощьл иммуноферментного диагностикума. основанного на использовании поликлональных антител к фибриногену человека.

Результаты измерений оптической плотности при 492 нм показывают, что уже за 5 с инкубации с ппазмином концентрация фибриногена, определяемого с помощью МонАТ 5А2, падает в 2 раза, тогда как,по данным, полученным с использованием диагностикума, основанного на поликлональньм антителах, концентрация фибриногена эа 5 с практически не снижается. При времени инкубации более 3 мин в пробах практически не остается йибриногена, определяемого с помощью антител 5А2, тогда как поликлональный диагностикум дает снижение концентрации не более чем на 30 — 40X. Таким образом, антитела АА2 могут быть использованы для определения интактного фибриногена в плазме.