Способ получения фосфолипидного носителя холестерина

 

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии, и касается способа получения фосфолипидного носителя холестерина . Целью изобретения является повышение специфической активности. Способ осуществляется путем обработки липидной дисперсии, представляющей смесь лецитина из соевых бобов и холестерина при молярном соотношении 1:2, дополнительно содержащую дицетилфосфат или фосфатидилсерин, или фосфатидную кислоту, или жирную кислоту, содержащую Cia, или С14, или Cie, или Cis, ультразвуком при охлаждении , центрифугирования и последующей фильтрации через ядерный фильтр диаметром 0,2 мм. 1 табл

сОюэ сОВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю А 61 К 37/22, 31/685

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4072425/14 (22) 08.04.86 (46) 15.11.91. Бюл. hL 42 (71) Научно-исследовательский институт физико-химической медицины (72) А.С. Иванов, Т.С. Захарова, Э.M. Халилов, Т.И. Торховская, Г.И. Бачманова, С.С. Маркин, Ю.M. Лопухин и А.И. Арчаков (53) 612.015 (088,8) (56) Y. Membrane Biol., 1971, ЬЬ 4, р.252 — 269. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОЛИПИДНОГО НОСИТЕЛЯ ХОЛЕСТЕРИНА (57) Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии, и касается способа полИзобретение относится к медицине, а именно к биохимии, и касается способа получения фосфолипидного носителя холестерина.

Целью изобретения является повышение специфической активности.

Способ осуществляется следующим образом, В качестве липидной дисперсии используют смесь высоконенасыщенного фосфолипида и холестерина в молярном соотношении 1:2, дополнительно содержащую вещество, придающее отрицательный заряд, обрабатывают ультразвуком мощно-. стью 280 — 300 Вт в течение 9/10 мин при

0 — 4 С и фильтруют через ядерный фильтр диаметром пор 0,2 мкм.

Пример 1. К 1 мл хлороформного раствора (100 мгl мл) хромато графически чистого лецитина из соевых бобов (фирма

Nattermann, ФРГ) добавляют 1 мл хлороформного раствора холестерина (100 мгlмл) и 125 мкл раствора дицетилфосфата

„„ЯЦ „„1690769 А1 учения фосфолипидного носителя холестерина. Целью изобретения является повышение специфической активности. Способ осуществляется путем обработки липидной дисперсии, представляющей смесь лецитина иэ соевых бобов и холестерина при молярном соотношении 1:2, дополнительно содержащую дицетилфосфат или фосфатидилсерин, или фосфатидную кислоту, или жирную кислоту. содержащую Ct2, или С14, или Сы, или С1в, ультразвуком при охлаждении, центрифугирования и последующей фильтрации через ядерный фильтр диаметром 0,2 мм. 1 табл. (25 мг/мл) в смеси хлороформ — метанол 2:1 по объему. Смесь высушивают на роторном испарителе в течение 40 мин. В колбу добавляют 20,4 мл забуференного физиологического раствора, рН 7,4.

Смесь инкубируют в встряхивающем термостате в течение 1 ч при 37 С. Далее смесь обрабатывают ультразвуком на диспергаторе "Соник-300" (Fisher, США) мощностью 300 Вт в течение 10 мин при охлаждении (температура охлаждения40 С), температура в пробе не выше 4 С).

Пробу центрифугируют на центрифуге К-24 (lanetzki, ГДР) для осаждения многослойных липосом и частиц титана. Полученную суспензию продавливают через ядерный фильтр (диаметр фильтра 47 мм) с порами

0,2 мкм (Nuckleopore, США). Полученный фосфолипидный носитель холестерина (ФНХ) анализировали на холестерин и фосфолипиды на биохимическом анализаторе

"Центрифихем-400" (Baker, США). Для измерения холестерина использовали набор ре1690769

25 получается целевой продукт в виде стери- 30 ального ФНХ с молярным отношением хо35

Физико-химические свойства липосом, 40 полученных по описанному способу, прове45

50 активов. Монотест Холестерол (Boekringer, Австрия). Состав реактива . трис 100 мМ, рН

7,7; магний аспартат 50 мМ, 4-аминофенаэон 1 мМ, натрий халат 10 мМ, фенол 6 мМ, 3,4-дихкорфенол 4 мМ, холестеринэстераза

0,4 едlмл, холестериноксидаэа 0,25 ед/мл, пероксидаза 0,2 ед/мл. Анализ проводился путем смешивания 5 мкм пробы и 350 мкл реактива, инкубировали при 37 С в течение

5 мин и фотометрии при 510 нм. В качестве стандарта использовали стандартный растворр хол естери на (200 м г!100 мл) (Boekringer, Австрия). Для измерения фосфолипидов использовали набор реактивов

Комбинированный Тест фосфолипиды (Boekringer, Австрия). Состав реактива: трис

50 мМ, рН 8,0, фенол 20 мМ, фосфолипаза

Д 1,0 ед/мл, холиноксидэза 1,4 ед/мл, пероксидаза 0,8 ед/мл, 4-аминофеназон 8 мМ.

Анализ проводили путем смешивания 10 мкл пробы с 350 мкл реактива, инкубировали при 37 С в течение 10 мин и фотометрии при 510 нм. В качестве стандарта использовали прилагаемый к набору стандартный раствор холинхлорида (54,1 мг/100 мл) Анализы холестерина и фосфолипидов в полученном ФНХ дали следующие результаты: холестерин 361 мг/100 мл, фосфолипиды 424 мг/100 мл. В результате лестерин/фосфолипиды 1,7, учитывая, что средний молекулярный вес фосфолипидов в

2 раза больше холестерина. При повторении описанного способа получается целевой продукт с содержанием холестерина

340-370 мг/100 мл и фосфолипидов 407440 мг/100 мл, что дает колебания отношения холестерин/фосфолипиды от 1,5 до 1,8. рялись с помощью стандартного метода преципитации (ЛПНП) и флотации в сыворотке крови при центрифугировании.

Проверка активности препарата.

К 1 мл сыворотки крови добавляли

0,4 мл ФНХ, полученного по предлагаемому способу или по известному способу. инкубировали при 37ОС в течение 1 ч. Преципитацию проб проводили путем добавления раствора фосфовольфрамовой кислоты (0,55 мМ) и хлористого магния (25 мМ} в соотношении проба:преципитант 1:2 по объему, Смесь стояла при комнатной температуре и затем центрифугировалась 10 мин при 4000g, При ЛПНП преципитируют иудаляются вместе с осадком, в супернатанте и остаются только ЛПВП. Супернатант отделяли и анализировали вместе с пробой исходной сыворотки на холестерин и

15 фосфолипиды, как описано в примере 1. Результаты приведены в таблице, Из данных, приведенных в таблице, видно, что ФНХ, полученный по предлагаемому способу., имеет более высокий холестерин (фосфолипидный индекс 1,67), чем

ФНХ, полученный по известному способу (0,99) и практически полностью преципитирует вместе с ЛПНП в отличие от прототипа, что подтверждает взаимодействие ФНХ с

ЛПНП.

Сыворотку крови смешивали с ФНХ и инкубировали как описано, в микропробирку наливали пробу и центрифугировали на ультрацентрифуге с воздушным приводом (Аэрофуга, Bekman. Австрия) с ротором А100 в течение 2,5 ч при 300 000g. С помощью ручного фракционатора азрофуги содержимое пробы фракционировали по вертикали на 11 фракций и в каждой фракции определяли концентрацию холестерина, как описано в примере 1, Для каждой фракции получали свое значение концентрации холестерина, Аналогичные процедуры проводили и с контрольной пробой, где к сыворотке крови вместо ФНХ добавляли физиологический раствор. Для каждой фракции из значений холестерина, полученных в опытной пробе, вычитали значения холестерина, полученные в контрольной пробе.

В результате проведенных исследований выявлено, что ФНХ, полученный таким образом, флотирует в области ЛПНП, в то время как ФНХ, полученный по известному способу, гетерогенен по удельной плоскости и флотирует как в области ЛПНП, так и в области липопротеидов высокой плотности.

Пример 2. Способ осуществляется аналогично примеру 1, эа исключением того, что вместо дицетилфосфата используется фосфатидилсерин в тех же соотношениях. В результате был получен целевой продукт с концентрацией 8,2 мг липидаlмл. Полученный продукт не уступал продукту, полученному по примеру 1.

fl р и м е р 3. Способ осуществляется аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо дицетилфосфата используют фосфатидную кислоту в тех же соотношени- ях. В результате был получен целевой продукт в концентрации 8,5 мг липида/мл, не уступающий по своим свойствам продукту, полученному по примеру 1.

fl р и м е р ы 4.5,6,7.

Способы осуществляются аналогично примеру 1, за исключением того, что вместо дицетилфосфата используют жирную кислоту С12, или С14, или Сы, или С1а в тех же соотношениях, в результате были получены

1690769

Составитель С.Мельникова

Редактор М.Васильева . Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор А.Осауленко

Заказ 3876 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 продукты с концентрацией соответственно

8,0,8,0,8,3 и 8,5 мг липида/мл, не уступающие по своим свойствам продукту, полученному по примеру 1, Предлагаемый фосфолипидный носи- 5 тель холестерина позволяет повысить холестерин/фосфолипидный индекс с 0,99 до .1,67, а также практически полностью взаимодействует с липопротеидом низкой плотности в отличие от известного, который 10 такой специфичностью не обладает.

Формула изобретения

Способ получения фосфолипидного носителя холестерина, включающий обработ15 ку липидной дисперсии ультразвуком при охлаждении и центрифугировании, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения специфической активности и взаимодействия с липопротеидом жидкой плотности в качестве липидной дисперсии используют смесь лецитина из соевых бобов и холестерина при молярном соотношении 1:2, дополнительно содержащую дицетилфосфат или фосфатидилсерин, или фосфотидную кислоту, или жирную кислоту, содержащую

С12, или С14, или С16, или С18, и затем фильтруют через ядерный фильтр диаметром

0,2 мкм,