Питательная среда для культивирования штамма рsеudомоnаs sтuтzеri вкпм в-4724 - продуцента рестриктазы ps и 1
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
1 ,д@@Яфй
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 4724816/13 (22) 27,07.89 (46) 15.12.91. Бюл. N. 46 (71) Научно-производственное обьединение
"Биолар" и Научно-производственное обьединение "Вектор". (72) Ю.Н.Бойков, B,Е.Репин, С.Х.Дегтярев и Н.В.Бойкова (53) 577.15(088,8) (56) Аркадьева 3.А., Трифонова Т.В., Агапова Н.С. и Козлова Е.И, — Научн. докл, высшей школы биол. науки, 1976. N7,,с. 113-115, Gingегоs T,R., Greenough L„Lehi}dkraut
I., Roberts R, j. Two new restriction endonucieases from Protew vulgar - J. Nucleic
Acids Res„1981, vol. 9, ¹ 18, р. 4525-4536. (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВ А Н И Я ШТАММА PSEUDDViQNAS
STUTZERl ВКПM В-4727 — ПРОДУЦЕНТА
РЕСТРИКТАЗЫ PSU l (57) Изобретение относится к микробиологии и касается состава питательных сред, Изобретение относится к микробиологии, в частности к составам питательных сред, предназначенных для культивирования продуцентов рестриктазы PSU l.
Цель изобретения — повышение выхода фермента и его активности.
Сущность изобретения заключается в
ТоМ, что питательная среда для культивирования продуцента рестриктазы — штамма
Pseudomonas stutzeri ВКПМ В-4727 содержит s качестве питательной основы и источника аминного азота панкреатический почечный гидролизат и минеральные соли.
„, Й2„„1698286 Al (я)5 С 12 К 1/20, 9/22//(С 12 N 1/20, С 12 R 1:38) гредназначенных для культивирования гродуцентов растриктазы Psu l, С целью повышения выхода фермента и его активности предлагают использовать для выращивания продуцента рестриктазы Psu i—
Pseudomonas stutzeri ВКПМ вЂ” 4727 питательную среду, содержащую в качестве питательной основы и источника аминного азота панкреатический почечный гидролизат с содержанием, %; общий азот 11,2; аминный азот 6,7; зола 9;7; влажность 4,1, при следующем соотношении компонентов, г/л: панкреатический гочечный гидролизат 15,020,0; аммоний сернокислый 1,0 — 2,0; натрий лимоннокислый 0,5-0,7; хлористое железо
0,001 — 0,002; вода до 1 л. При этом выход биомассы достигает 12,5 — 13,0 г/л культуральной жидкости, выход ре триктазы
10000 — 15000 ед,/г биомассы, а активность увеличивается до 125000 — 195000 ед./л культуральной . жидкости. что в 2 — 5 раз превышаетаналогичные показатели на известной сре,де. 1 табл, Панкреатический почечный гидролизат производят путем ферментативного гидролиза отходов (в данном случае почек животных) с последующим высушиванием на распылительной сушилке.
Панкреатический почечный гидролизат представляет собой порошок светло-коричневого цвета. Он богат важными жизненно необходимыми элементами для нормального роста, развития бактерий, проявления биосинтетической активности, Почечный гидролизат содержит, : общий азот 11,2; аминный азот 6,7: зола 9,7; влажность 4,1. Кроме того, так как в почках
1698286 живогных содержатся и другие биологически активные вещества (витамины, микроэлементы и др.), то при приготовлении гидролизата, он обогащается этими веществами.
Введение панкреатического почечного гидрализата способствует активизации роста, стимулированию жизнедеятельности бактерий и накоплению рестриктазной активности.
Введение сернокислого аммония способствует дополнительному плтанию бактерий аминным азотом и серой. В качестве источника углеродистого питания в питательную среду вводят лимоннокислый натрий.
В результате совместного использования лимоннокислого натрия и сернокислого аммония происходит поддержание рН во время выращивания культуры в оптимальных предзлах (7,2). Ионы натрия совместна с ионами железа, входящими в состав хлорида железа, воздействуют на дыхательные центры бактерий.
При введении пакреатическаго почечного гидролизата в количествах менее 15,0 г/л (например, 12,5 г/л) снижается выход биомассы и фермента, так ак не хватает аминного азота для роста и развития бактерий
Рseudomonas stutzeri и, соответственна, для биосинтеза рестриктазы Psu I, При введении панкреатического почечного гидролизэта в количествах балee 20,0 Г/л (например, 22,5 г/л) снижается выход биомассы и фермента, так как происходит репрессия раста бактерий и биосинтезэ рестриктазы Psu I.
При введении сернокислага аммония в количествах менее 1,0 г/л (например, О 5 i-/л происходит снижение выхода биомассы и рестриктэзы Ры I, так кэк количества ионов аммония н",,дсстэточно для подщелачивания среды и поддержания рН. При введении сернокислого аммочия в количествах более 2,0 г/л (например, 2,5 г/л) снижается выход биомассы и рестриктазы Psul, так как происходит ингибираванAe роста бактерий M 6liocMHTeзэ фермента.
При введении лимоннокислога натрия в количествах менее 0,5 г/л (например, 0.4 г/л) происходит снлжение выхода биомассы бактерлй и рестриктазы Psu I вследствие того, чта не хватает ионов натрия в среде для активации клеточного дыхания бактерий. Введение лиманнокислаго натрия в количествах более 0,7 г/л (например.
0,8 г/л) вызывает снижение выхода биомассы бактерий и рестриктазы Рва I, тэк кэк происходит ингибирующее воздействие на дыхательные центры клеток.
Введение хларида железа,в количествах менее 0,001 г/л (например, 0,0005 гlл) приводит к снижению выхода биомассы и рестриктазы Psu I, так как не хватает ионов
5 железа в среде для активации клеточного дыхания бактерий и ионов хлора для питания куль;уры, При введении хлорида железа в количествах более 0,002 г/л (например, 0,0025 ",/ë) происходит снижение выхода
10 биомассы бактерий и рестриктазы Psu I вследствие того, чта происходит репрессивн-; воздействие на дь,хательные центры и избыток ионов хлора ингибирует рост, развитие и биосинтетическую активность куль15 Tvpbi
Пример 1, Питательная среда содержи1 г/л
Пэнкреатический почечный гидр олизат 20,0
20 Сернокислый амманий 2,0
Лимоннокислый натрий 0,7
Хлорид железа 0,002
Вода До 1,0n
Оживление штамма Pseudomonas
25 stutzer< 131 ВКПМ В вЂ” 4727 осуществляют на сухом питательном агаре (сухой питательный агар 35,0 г/л; вода 1,0 л) в чашках
Петри. Инкубируют в термокамере при 28 С в течение 24 ч, 30 С поверхности агара в чашках Петри культуру переносят бактериологической петлей в качалачные колбы с. питательной средой данного состава, рН 7.,2.
Выращивают посевной материал при
35 28 С в течение 18 ч на качалке,.
Ферментацию культуры проводят на питательной среде данного состава при рН 7,2, температуре 28 С, перемешивании
200 об/мин, подаче воздуха: 2 сбъема ваз40 духа на 1 обьем питательной среды, выращива от до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 1,7 опт,ед. (ЗЭК, фильтр N 6, кювета 0,5 см).
Выход биомассы 13,0 г/л культуральной
45 жидкОСти.
Выход рестриктазы Psu I 15000 ед,/г биомассы; .95000 ед./г культуральной жидкости.
Для определения активности фермента
50 используют метод электрофсреза в геле.
Активность фермента определяют в грубом экстракте биомассы бактерий
Рвeudomonas stutzeri 131 ВКПМ В вЂ” 4727 и в,îíöå выделения (после хроматографии на
5 колонке g фосфоцеллюзай).
За единицу активности рестриктазы
Psu Iп,ринимают минимальное количество фермента, которое требуется для полного расщепления 1 мкг ДНК фага л. в течение 1 ч при 37ОС, 1698286
Выделение фермента проводят следу.ощим образом.
50 г биомассы бактерий Pseudcmonas
stutzeri суспендируют в 100 мл 10 м1Л трисНС)-буфера, рН 7,2, содержащего 0 <;,Ì 2меркаптозтанола, 1 мУ, азида натри, 1 м1.1 трилона Б (буфер А), и доводят зтим же буфером дс об ема 150 мл, К суспензии добавляют 1," мл 10%-ного.тритона X-100 и
150 мгл лизсцима. Лизис проводят ч пр" постоянном перемешивании. Дальнейшее фракционирование лизата проводят в системе двухфазного разделения, Полученный лизат добавляют к смеси, состоящей из 37,0 мл l5 -ного водного раствора декстрана Т-500, 56 мл 30%-ного водного раствора полизтиленгликсля (ПЗГ) и 35 мл 4,0 М хлористого натрия (рН смеси
6,5), Тщательно перемешивают в течение 15 мин и центрифугируют на центрифуге
"Hlqh speed" (20000 g 20 мин), Верхнюю
ПЗГ-фазу объемом 120 мл, содержащую фермент, отбирают, разбавляют двухкратным обьемом буфера А, добавляют тритон
Х вЂ” 100 (0,1%-ный) и наносят на колонку с фосфоцеллюлозой, уравновешенную буфером А, содержащим 0,1%-ный тритон Х100 (буфер Б), Фермент элюируют 0-1,0 M линейным градиентом концентрации хлористого натрия в буфере Б. Фракции, содержащие рестриктазу Psu I, концентрируют диализсм против буфера Б, содержащего
55 -ный глицерин.
Получают очищенный фермент Psu (в виде прозрачной бесцветной жидкости.
Рестриктаза Psu 1 расщепляет ДНК фага Л на 3 сайта, Содержание неспецифических экзо- и эдонуклеаз после выделения отсутствуют.
Хранят рестриктазу Psu l при -10 С в течение 1 года.
Пример 2. Питательная среда, содержит, г/л:
Панкреатический почечный гидролизат 17,5
Сернокислый аммоний 1 1
Лимсннокислый натрий 0,6
Хлорид железа ОЯ015
Вода До 1,0л
Выращивание биомассы: адаптацию культуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводят аналогично примеру 1.
Выход биомассы 12.75 г/л. культуральной жидкости, Выход рестриктазы Psul 12500 ед,/г биомассы; 160000 ед./л культуральной жидкости.
Определение активности, выделение фермента Psu l и хранение осуществляют аналогично примеру 1, Пример 3, Питательная среда содер жит, r/л:
Панкоеатический почечный гидролизат 15,0
5 Сернскислый аммоний 1,0
Лимоннокислый натрий 0,5
Хлсрид железа 0,001
Вода До 1,0л
Выращивание биомассы: адаптацию
10 кул ь.| уры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводят аналогично r,римеру 1.
Вь:.".oä биомассы 12,5 г/Ji культуральной жидкости.
15 Выход рестриктизы Psu 10000 ед./ биомассы; 125000 ед. /л культурал ьной жидкости, Определение активности, выделени-= фермента Psu l и хранение осуществляют
20 аналог очно примеру 1.
Пример 4, Питательная среда содержит, г/л:
Панкреатический почечный гидоолизат 12,5
25 Сернокислый аммоний 0,5
Лимоннокислый натрий 0,4
Хлорид железа 0,0005
Вода До 1,0л
Выращивание биомассы: адаптацию
30 культуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводят аналогично примеру 1.
Выход биомассы 5,1 г/л культуральной жидкости.
35 Выход рестриктазы Psu l 2300 ед,/г бис" массы; 11730 ед./л кул ьтуральной жидкости.
Определение активности, выделение фермента Psu l и хранение осуществл;от как в примере 1, 40 Пример 5, Питательная среда содержит, г/л;
Панкреатический почечный
Гидролизат 22,5
Сернскислый аммоний 2,5
45 Лимоннокислый натрий 0,8
Хлорид железа 0,0025
В ода До 1,0л
Выращивание биомассы: адаптацию . ку> ьтуры, инокуляцию посевного материа50 ла, ферментацию культуры проводят как в примере 1.
Выход биомассы 5,7 г/л культуральной жидкости.
Выход рестриктазы Psu (3100 ед,/г
55 биомассы.
Определение активности, выделение фермента Psu l и хранение осуществляют как в примере 1, Пример 6, В таблице представлены данные по сопоставительному анализу вы1698286
Формула изобретения
Питательная среда для культивирования штамма Pseudomonas stutzeri ВКПМ В—
4727 — продуцента рестриктазы Psu включающая источник аминного азота, ми15,0 — 20,0 1,0-2,0
0,5-0,7
0,001-0,002
Да1л
Питательная среда
П редл а гаемая ая е, г/л
0,0 трий 5,0 а 1,0л
Панкреатический почечный гидролизат 2
Сернокислый аммоний 2,0
ЛMMOHPIOKViCnblA HBTpNA 0,7
Хлорид железа 0,002
Вода 1,0 л массы ной жидкости иктазы амассы; льной жидкости
12,5-13.0 г/л культуральной жидкости
10000-15000 ед./г биомассы;
125000-195000 ед./л культуральной жи кости
Составитель В. Саина
Техред M.Ìoðãåíòàn Корректор И. Муска
Редактор А, Огар
Заказ 4367 1 ираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета па изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035. Москва. Ж-35. Раушская наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, yn,Гагарина, 101 ращивания штамма продуцента Pseudomona stutzeri ВКПМ В-4727 на известной и предлагаемой средах, При выращивании на предлагаемой среде продуцента рестриктазы Psu 1—
Pseudomonas stutzet i ВКПМ В вЂ” 4727 выход биомассы бактерий возрастает в 2 раза, а выход и активность рестриктазы увеличиваются в 3 — 5 раз по сравнению с известной средой, неральные соли и воду, о т л и ч а ю щ а яс я тем, что, с целью повышения выхода фермента и его активности, в качестве источника аминного азота среда содержит
5 панкреатический почечный гидролизат. а в качестве минеральных солей — сернакислый аммоний, лимоннокислый натрий и хлористое железо при следующем соотношении компонентов, в г/л:
Панкреатический почечный гидролизат
Аммоний сернокислый
Натрий лимоннокислый
Хлористое железа
Вода
![Питательная среда для культивирования штамма рsеudомоnаs sтuтzеri вкпм в-4724 - продуцента рестриктазы ps и 1](https://img.findpatent.ru/img_data/735/7355017-s.jpg)
![Питательная среда для культивирования штамма рsеudомоnаs sтuтzеri вкпм в-4724 - продуцента рестриктазы ps и 1](https://img.findpatent.ru/img_data/735/7355018-s.jpg)
![Питательная среда для культивирования штамма рsеudомоnаs sтuтzеri вкпм в-4724 - продуцента рестриктазы ps и 1](https://img.findpatent.ru/img_data/735/7355019-s.jpg)
![Питательная среда для культивирования штамма рsеudомоnаs sтuтzеri вкпм в-4724 - продуцента рестриктазы ps и 1](https://img.findpatent.ru/img_data/735/7355020-s.jpg)