Способ отбора мутантов парафинусваивающих дрожжей
Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам отбора мутантов микроорганизмов для получения биомассы. Целью изобретения является ускорение селекции дрожжей, обладающих повышенной способностью усваивать короткоцепочечные н-парафины. Суспензию клеток исходного штамма обрабатывают мутагеном и высевают на плотную и жидкую селективные питательные среды, содержащие каприлат натрия в концентрации , полностью подавляющей рост исходного штамма. Выжившие в этих условиях и образовавшиеся отдельные колонии мутантов после очистки рассевом на той же среде проверяют на скорость роста и на уровень наполнения биомассы при культивировании на жидкой парафинсодержащей среде. 1 табл. сл С
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 15/01
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4429461/13 (22) 23.05,88 (46) 15.12,91. Бюл. N 46 (71) Институт микробиологии АН БССР (72) С.П,Коваленко, А.Н.Щербина и Н.M,Ãîðнак. (53) 575.224.4.08(088.8) (56) Исследование возможности получения . п рафинусваивающих дрожжей, отличающихся большей продуктивностью на легких фракциях н-парафинов (Отчет о НИР)/ВНИИсинтеэ белок. — N ГР 01829047329, M., 1984, с, 10. (54) СПОСОБ ОТБОРА МУТАНТОВ ПАРАФИНУСВАИВАЮЩИХ ДРОЖЖЕЙ (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к споИзобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам отбора мутантов микроорганизмов для получения биомассы.
Целью изобретения является ускорение селекции дрожжей, обладающих повышенной способность|о усваивать короткоцепочечные н-парафины.
Отбор мутантов проводят как на плотных, так и на жидких питательных средах. содержащих селектирующий агент, каприлат натрия. Концентрацию подбирают таким образом, чтобы основная масса клеток исходного штамма не способна была образовывать колонии. Этой способностью обладают лишь немногие мутантные клетки дрожжей, приобретшие ее в результате действия мутагена. На каждом этапе селекции . концентрацию каприлата натрия увеличивают, а мутагенной обработке подвергают луч„„5U „„1698290 А1 собам отбора мутантов микроорганизмов для получения биомассы, Целью изобретения является ускорение селекции дрожжей. обладающих повышенной способностью усваивать короткоцепочечные н-парафины.
Суспензию клеток исходного штамма обрабатывают мутагеном и высевают на плотную и жидкую селективные питательные среды, содержащие каприлат натрия в концентрации, полно тью подавляющей рост исходного штамма, Выжившие в этих условиях и образовавшиеся отдельные колонии мутантов после очистки рассевом на той же среде проверяют на скорость роста и на уровень наполнения биомассы при культивировании на жидкой парафинсодержащей среде. 1 табл. ший из мутантов, полученных на предыдущем этапе селекции, Суспензию клеток исходного штамма обрабатывают мутагеном и высевают на плотную или жидкую селективные питательные среды, содержащие каприлат натрия в концентрации, полностью подавляющей рост исходного штамма (применительно к нашему обьекту концентрация селектирующего агента постепенно повышалась от 0,02 до (,15 p). Выжившие в этих условиях и образовавшие отдельные колонии мутанты после очистки рассевом на той же среде проверяют на скорость роста и на уровень накопления биомассы при культивировании на жидкой парафинсодержащей среде.
Г1 р и м е р 1. Суспензию клеток дрожжей
Сапб да maltose BC5-899 (лучшего из известных промышленных прпдуцентов кормоного белка на основе н-парафинов) 1698290
ГМЫРЯ!ЦИВЯIOт В СПГЦИ31!ЬHb!Х К3 (ЯЛОЧНЫХ колбах емкостью 500 мл на ВысОкОскОрОстчой качалке (240 об/мин) при 3.1 С в жидкой итагельной сред;-; (по 50 1!(! следующего
Оставя, мяс. уo, Пара!{!1(лны HOÐoïoëoLIKOÃО !
ПЗ 0,4 (Cg следы, С10 2.5; C,I .3,á; С 12 13,8.
С (з 18, I,С, 19,5; С1{; 1<(,h . ",.!8 !0.7; С!7 7,4;
С1ц 2 0; C1g 0,2; !2!-!гРО . ЗН)О 0,38; НЯН2РО:(, 32Н20 0,35; М<)С!р О, !1; (Ч! I<)) эО4 0,422, Во {опроводная вода — Остальное, рН 5,0 — 5,5.
Полученную суспензию обрабатывают химическим мутагеном нитризогуанлдином концентрацией 1i мг/мл 15--60 мин. затем отмывают мутаген фосфя-ным б1фером, рН
7,0.
Суспензию микроорганизмов высеваюг по О,". Мл н3 чашк(л Пе! ри с TI!1TBT83üHOÉ
СОЕДОЙ, ИМЕК) Щ Й С!,{1У ;..:I:Ь; СОСТЯВ, 13c.%: этилОВый cliiiip i 0,4,: " .:!,HepBIlbHI: компоненты, как B сс с-. яво c,:"fbi, приьеденНоМ Выше, каприлат натрия 0,01-0,03; нодоhpoBopная вода — остальное.
На стадии селекции использу!от водо. раствори(иыЙ источни:< углерода этанол, так
Как пути его ассимиляции бг!изки с таков! 1-!!и!л Ялканов. Исходный штамм ВСЬ-899 очень чувствителен к каприляту натрия, да;хе концентрация 200 MI" /л полностью подавляет е! о рост. Ус1ойчивые; э-. ой концентрации мутанты образовывали видиые ко loH!ëè ToflbKO че;;ез 7 сут. Бол . вь:.окие концентрац! .i (0,03,,) настолько повгвляют рост, ITO даже Отдельных коло(!ий ня ср8де не Воз ч({!".3!i о, Ь ьш ie ко!1 ! ! ц е н т р я ц и и (О., 0 1 % ) н е о б л а д я !о селе. .Tè01/þùIIM дейс!Вием — н3 чашк х В-,:—
pocT3f! сплошнОЙ Гя "OH, Устойчивь 8 к; ОтСЕВа!От И ОЧИЬЦаат РЯСС{ТВОМ РЯЗВЕДЕННь(Х суспен зий на среде ТОГО же co{:1 3 Вгь Очи Щен н ые:of! o H ë If! !;c! п РилатУстойчивых мутBHTOB г!роверякзт на продуктивнссть как по биомассе .:: с(<0(эос1и роста, так и исходным материа,-ом для даль-, åé{Liåé сеГ!8КЦИИ HB ПОВЫШОНИЕ С (Еi!8!4!A УСТОИЧИВОСти к каприлату !.31риг!. Проверку кЯГ1 !рилат) с Гойя и Зых м/TB н" тов l а продукт I(RHocть Г!О б!!О(ассе и определение удельных скорое(eé pocl а ПРОВОДЯ Г НЯ {.РЕДЯ,"., ГДЕ М,11!8PBflbHble КОМпоненты бь ли, как !3 примере 1, а источниК0М угл родя 5 ь1Л vl од HОM ОRучае парафины в количес гве ".,:! мас:."",, (достаточном для измерения), я В др, гам — смесь парафинов с октаном ll додеканом (2 (:1)— 0.4 MBC.%. Резу
MOI НЯ С! ЯДИ!Л СЕЛ С !< .{! и (! {:i,".":;3Ь Ва IОТ, Ч TÎ м /та ! ты В 3 р ьи р л01 Г! с В; хе,1у ГН1{1масс l! От 90 до 115% от исходного штамма. причем повышенной продуктивностью обладают около 45% проверенных вариантов. ll этап — селекция на устойчиг:Ость ;. 5 возрастающим концентрациям каприлатя натрия. Ее осуществляют двумя путямл. Параллельно с селекцией на плотных селекти вн ых средах (с KOH öåHTpBöìÿ Mè каприлата натрия 0,05 и 0,08%) проводят 10 BciòocåëåKÖèþ ДРожжей (с конЦентРаЦией каприлата натрия 0,1%) длительным культивированием их (в течение 2 «ec) в глубинных условиях — в колбах на качалке (условия культив!лрования в колбах описывались вы15 ше), Селекция íà -редах co Bce возрастающими концентрациями каприлата натрия г:pecfiepye следующие цели, На первом ее этапе, где кэприлат натрия с концентрацией 20 0,02% используют В качестве селектирующего фактора, отбирают формы, имеющие устолчлвость !< каприловой кислоте, HB следующем этапе селекции, где ед(лнственным источником углерода в среде служит капри25 лят натрия, возникают мутанты, способные расти на повышенной концентрации этого вещества. IIo-видимому, автоселекция на среде с каприлатом натрия как единственным ис30 1ичн иком углерода приводит к отбору форм с повышенной активность!о ацил-КОА-синтетазы, На каждой ступени повышения усгойчиво:ти дрожжей к каг!рилату натрия возникают мутации различных генов, в ре3". зул,TBTc чего отбирают формы с активацией нескольких ферментативных стадий процесса ассимиляции алканов, Пример 2. Селекцию каприлатустойчивых мутантов HB повышение степени ус(О, ойчивости к возрастающим дозам ;<априлата натрия 0;05 (л 0,08 % проводят как в примере 1, Минеральные компоненты средь! были такими же, KBK (л B среде примера 1„, d в качестве единственного источника уг45 лерода служил каприлат натрия, соответстВенно 0,05 и 0,08%. Все процедуры ьь!полняют так, как описано В примере 1. Пример 3, Автоселекцию каприлатугтойчивых мутантов, отобранных в примере 50 1, осуществляют длительным культивированием их в глубинных условиях в колбах на 3H3flK (/CfiOBN5I K1/ЛЬТИВИРОВЯНИЯ OONCBHb(В примере 1). Все минеральные компоненть среды как в примере 1, а каприлат натрия в 55 количестве 0,1 % служит единственным ис10 !ником углерода. Все жизнеспособные в селективных условиях мутанты после очистки проверяют на продуктивность. !,QOM8 Тогo, продолжа OT селекцию на устойчивость к 8!Це большим кОн Цен TpBlj(! яM Kап pил3> 3 !iатрия тех мутантных форм„которые были выделены в результате эвтоселекции, Пример 4. Селекцию на повышение степени устойчивости к каприлату натрия в концентрациях 0,12; 0,15; 0,18 и 0,20 g, про- 5 водят как в примере 1, первые два режима селекции (0,12 и 0,15;(каприлатэ натрия) дают множест во мутантов. На среде с 0.18;/ образуется несколько колоний, однако после пересева жизнеспособных форм не бы- 10 ло выделено, На максимальной из испол ьзова нных концентраций кап рилата натрия не обнаруживают ни одной колонии спустя 3 недели культивирования. В таблице показаны основные характе- 15 ристики исходной культуры и выделенных мутантов. Как видно из таблицы, некоторые выделенные мутанты, про1ведшие селекцию в н-..сколько этапов, на 327; продуктивнее. чеьисходная культура и их предшественники. Сравнение способности по накоплению биомассы и удельных скоростей роста в периодическом культивировании на качалке исходного штамма дрожжей Candida maltoda ВСБ-899 и мутантов, полученных селекцией на каприлате натрия разными способами Опыт Штамм дрожжей культивирование на средах с 4 c/ë н-парафинов за 72 ч парафины (С,о -C< ) Те же парафины с октачоми додеканом (2:1:1) Ф мутантов, превосхо" дяцих исход ный штамм Биомасса, г/л Удельная скорость, 1 >1 мутантов> превосходящих исходный штамм Биомасса,г/л Урельная скорость, 45,0 0,06 1,92+0,10 70,0 ь,05 1,40 0,01 селекцией на плотных средах (в скобках указана концентрация каприлата 2>02 0,63 1>89 0>20 2,14И> 09 1 >99i0,120,06 6,06 0,07 0,06 1,54+0,11 I,51+ О, 16 1>57+0,сб l,85+0,35 0,06 с,сб 0,06 0,07 «;-трия (0,13) среде с каприлатом 2,26 0,46 1,91+ 0,26 2,54+0,58 2,46+0,58 автоселекцией на жидкой 1>54+0,15 1,57+0,02 0,98+0,53 1,45+0,10 0,06 0,06 0,03 0,05 0,07 0Ä06 0,09 0 09 Составитель Н.Кузенкова Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Н.Ревская Редактор T.Ëàçoðåíêo Заказ 4368 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям пои ГКНТ СССР 113035. Москва, Ж-35. Раушская наб„4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагэоина. 101 1 Исходный штамм Candida maltosa ВСБ-899 Мутанты, полученные натрия в среде) 2 31 (0,05 ь) 3 65 (О, 121) 75 (0>123) 5 92 (О, 153) Мутанты, полученные 6 44 .7 46 8 54 9 56 Формула изобретения Способ отбора мутантов парафинусваивающих дрожжей, включающий обработку культуры мутэгеном, рассев и выращивание на питательной среде с селектирующим агентом, отличающийся тем, что, с целью ускорения селекции дрожжей, обладающих повышенной способностью усваиBGTb хороткоцепочечные н-парафины, в качестве селектирующего агента используют каприлат натрия
