Способ выделения растительных клеточных ядер
Изобретение относится к физиологии и биохимии растений и может быть применено при анализе механизмов молекулярной биологии развития, а именно в исследовании взаимосвязи структурно-функциональных элементов клеточных ядер в процессе развертывания генетических программ. Цель изобретения - повышение выхода очищенных клеточных ядер с одновременным сохранением внутриядерной ферментативной активности и физиологических свойств структурно-функциональных элементов клеточных ядер. Для достижения цели первоначально производят консервацию растительных тканей в 80-90% глицерине с последующей гомогенизацией в ззбуференной 20% глицериновой для выделения клеточных ядер, очистку которых производят через пятислойный (50, 60, 70, 80, 90 мае. %/объем) забуференный глицериновый градиент.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 и 9/50
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР— - ..
4.. ;;
> "-., >
c>>- > + г
i"„,-, ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ г (21) 4785582/13 (22) 13.02.90 (46) 30.12.91. Бюл. М 48 (71) Институт биологии Башкирского научного центра Уральского отделения АН СССР (72) 3. А. Иванова и Г. Х. Вафина (53) 581.143.17(088.8) (56) Маринова Е. и Калева С. Современни методи за изолиране на ядра от висши растения. Физиология на растенията, 1983, т. 9, Рв 3, с. 89-90. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РАСТИТЕЛЬН ЫХ КЛ ЕТОЧ Н ЫХ ЯДЕР (57) Изобретение относится к физиологии и биохимии растений и может быть применено при анализе механизмов молекулярной биологии развития, а именно в исследоваИзобретение относится к физиологии и биохимии растений и может быть применено при анализе механизмов молекулярной биологии развития, а именно в исследовании взаимосвязи структурно-функциональных Элементов клеточных ядер в процессе развертывания генетических программ.
Цель изобретения — повышение выхода очищенных клеточных ядер с одновременным сохранением их нативности.
Пример осуществления изобретения.
Работа проводилась на покоящихся, I—
2-дневных проростках, а также 3-4-дневных тканях колеоптилей, листьев, корней пшениц Мироновской яровой и озимой, Московской — 35, ржи Чишминской озимой и сорта
Чулпан. Проростки и ткани консервировали при t — - 250С в 80 — 90; глицерине.
„>5LJ«> 1701747 А1 нии взаимосвязи структурно-функциональных элементов клеточных ядер в процессе развертывания генетических программ.
Цель изобретения — повышение выхода очищенных клеточных ядер с одновременным сохранением внутриядерной ферментативной активности и физиологических свойств структурно-функциональных элементов клеточных ядер. Для достижения цели первоначально производят консервацию растительных тканей в 80-907, глицерине с последующей гомогениэацией в забуференной 20% глицериновой среде для выделения клеточных ядер, оч .::стку которь>х производят через пятислойный (50, 60, 70, 80, 90 мас./p/обьем) забуференный глицериновый градиент.
Ядра из растительн х тканей выделяли путем трехступенчатой омогенизации ткани 7 с, 15 с, 45 с при 15000 об/мин в 207 глицерине, содержащем 0,02 M триэтаноламин (T3A). HCI pH 6,8; 0,005 M М9С!2;.
0,025 M KCI; 0,003 СаС!;; 0,005 M NaCI;
0,004 M н-октиловый спирт и 0,004 M Â-меркаптоэтанол. Растительный материал, отфильтрованный через 4 слоя капрона размером пор в 70 мк, центрифугировали при 00 об/мин в течение 5 мин с целью освобождения от грубых неразоушенных тканей и целых клеток, затем надосадок центрифугировали при 2700 об/мин в течение 20 мин. Осадок ядер бь1л очищен через пятислойный глицериновый градиент (50, 60, 70, 80, 90 мас./объем), приготовленный на ТЗА HCI рН 6,8 со всеми перечисленными компонентами гомогенизационной сре1701747
Формула изобретения
Составитель H.Ðîäîâà
Редактор Т.Пилипенко Техред M.Mîðãåíòàë Корректор М, Шароши
Заказ 4513 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5 .
Производственно.издательский комбинат "Патент", r, Ужгород, ул.Гагарина, 101 ды, исключая 20 глицерин. Градиентное центрифугирование проводили при 2000 об/мин в течение 1 ч. Прохождение ядер через пятислойный глицериновый градиент контролировали микроскопически. Осадок ядер промывали 0,5 тритоном Х-100 на среде гомогенизации, без глицерина, с последующим центоифугированием при 700 об/мин в течение 15 мин, после чего
° ° ° дра промывали трижды в среде следующе,о состава: 0,005М М9С!г, 0,025 MKCI; 0,003
М CaClz, 0,005 М NaCI; 0,01 М трис-HCI pH
9,8, с последующим центрифугированием при указанных условиях, Степень чистоты выделенных препаратов клеточных ядер определяли микроскопически, сп ектрофотометрически и по компонентному составу белок/ДН К, Р Н К/ДН К.
Способ выделения растительных клеточных ядер, включающий консервацию
5 растительных тканей при температуре минус 25 С в присутствии глицерина, гомогенизацию, фильтрование и низкоскоростное центрифугирование гомогената и последующую очистку ядерной фракции методом rna10 диентного центрифугирования, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения выхода очищенных клеточных ядер с одновременным сохранением их нативности, для консервации используют 80-90 глице15 рин, гомогенизацию проводят в буфере, содержащем 20 глицерина, а очистку ядер осуществляют в градиенте плотности глицерина 50, 60, 70, 80, 90 мас, .
