Способ определения пригодности микроносителя для культивирования клеток животных

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается культивирования клеток животных на микроносителях. Целью изобретения является сокращение времени определения пригодности микроносителя для культивирования клеток животных и повышение достоверности результатов. Для этого инкубируют микроноситель в растворе соли кальция, а вывод о его пригодности осуществляют на основании отсутствия связывания им ионов кальция. 1 табл.

их ,ИГ,,(1ИС:1L1HF F.ИХ

i à г t F;."1ltlК (.-,5 С 12 f. 5/00

l ССУД/ РГТРЕ! ((Ь(И ",4!Ит(„т (1О ИЗСE F Е1F >< 1 «Ь . il .,: ЫTИЯM

llF Vl I KF / ((Г:

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (2 1) 44 8601 5/1 3 (22) 23.09.88 (46) 07.01.92. Бюл. N. 1 (71) Всесоюзный научно-исследовательский проектно-конструкторский институт прикладной биохимии (72) В.В.Туркин. В.С.Фаустов. С.В Сорокин.

А.Д.Украинцев и В.А.Макаров (53) 578.085.23 (088.8) (56) F.Ñ.М, Van Meel et. al. Innovation in

BithechnoI. Ê 125. N. 5 р. 229 — 236, 1984.

Сергеев В.A. Репродукция и выращивание вирусов животных. М.: Колос. 1976. с. 303.

Изобретение относится к биотехнологии и касается культивирования клеток животной ткани на микроносителях.

Принцип выращивания клеток животной ткани на микроносителях является одним из наиболее перспективных. поскольку позволяет значительно повысить Bûходы клеток, по сравнению с традиционными способами монослойного культивирования.

При практической реализации этого принципа встречаются определе(-ные трудности. связанные, в частности с тем. что при одинаковых условиях культивирoBания выходы клеток могут значительно варьировать. Весьма ощутимо могут изменяться выходы клеток и при использовании микроносителей разных классов и при использовании различных серий одного и того же микроносителя. По этой причине освоение метода культивироваHия клеток животной ткани на микроносителях требует широко ласштабных предварительных исследоваий по подбору приемлемых микроносителей для каждой клеточной линии.

° . О. » 170368!> Al (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРИГОДНОСТИ МИКРОНОСИТЕЛЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается культивирования клеток жиBoTHых на микроносите lslx. Цегью изобретения является сокращение времени оп ределения пригодности микроносителя для культивирования клеток животных и повышение достоверности результатов. Для этого инкубируют микроноситель в растворе соли кальция, а вывод о его пригодности осуществляют на основании отсутствия связывания им ионов кальция. 1 табл.

Известен способ определения пригодности микроносителей для культивирования клеток животной ткани, заключающийся в том. что клетки выращивают на микроносителе и в зависимости от полученного результата делают вывод о пригодности или непригодности данного микроносителя.

Однако этот прямой метод определения является длительным. так как осуществлчется в течение 2-3 сут (время цикла культивирования) и не позволяет во всех случаях делать однозначный вывод о непригодности микроносителя, поскольку отсутствие клеточного роста или слабый клеточный рост могут обуславливаться причинами. не связанными с качеством и природной испытуемого микроносителя.

Цель изобретения — сокращение времени определения пригодности микроносителя для культивирования клеток животнь(х и повышение достоверности результатов.

Поставленная цель достигается в результате того, что испытуемый микроноситель подвергают инкубации в растворе соли

1703685 кальция определенной концентрации, отделяют взвешенные частицы микроносителя, в фильтрате определяют концентрацию ионов кальция, определяют количество сорбированных ионов и по этой величине судят о степени пригодности микроносителя для культивирования клеток животной ткани, Сущность предложенного способа заключается в том, что предварительно готовят раствор соли кальция определенной концентрации и диспергируют в этом растворе навеску испытуемого микроносителя.

После некоторого времени инкубации взвешенные частицы удаляют фильтрованием, центрифугированием или иным методом, а в фильтрате определяют концентрацию ионов кальция. Вычисляют убыль кальциевой соли за счет адсорбции на микроносителе и полученную величину рассматривают как показатель пригодности микроносителя для культивирования клеток животной ткани, Используемый раствор соли кальция может иметь различную концентрацию, но удобнее готовить 0,1 М раствор.

Испытание можно проводить в различном объеме, но наиболее оптимальным является объем 50 мл.

Количество микроносителя, предназначенное для исследования, может колебаться в самых различных пределах, в среднем на объем 50 мл раствора кальциевой соли достаточно 1,5 г микроносителя.

В качестве кальциевой соли может быть использована любая водорастворимая соль.

Длительность инкубации. как и другие количественные характеристики, не имеет особого значения, однакодля исследования достаточно 60 мин, Метод определения от раствора взвешенных частиц микроносителя не имеет принципиального значения.

Инкубация микроносителя в растворе желательна в условиях, близких к условиям культивирования клеток животной ткани на микроносителе, т.е. ее можно проводить при оптимальных для культуры клеток температуре и режиме перемешивания, Однако это условие не является обязательным.

Количественное определение ионов кальция в фильтрате можно выполнить любым аналитическим методом, например методом пламенной фотометрии, но чувствительность метода не должна быть очень низкой.

Микроноситель, не сорбирующий ионы кальция, наиболее пригоден для культивирования клеток животной ткани.

В случае сорбции микроносителем 10 и более ионов кальция из раствора он полностью непригоден для использования.

При адсорбции микроносителем до 10 Д относительная пригодность его для практического использования тем выше, чем в меньшей степени он связывает ионы кальция.

Пригодность некоторых микроносителей для культивирования клеток животной ткани и способность этих микроносителей связывать ионы кальция даны в таблице.

Результирующие данные содержат в числителе величину, характеризующую степень сорбции микроносителем ионов кальция (в процентах), а в знаменателе — урожай клеток в расчете на 1 л среды. Во всех случаях культивирование клеток проводилось в одинаковых условиях на модифицированной среде Игла в течение 72 ч. Посевная концентрация составляла 0,4 10 кл/мл. Коб личество использованного микроносителя

1,5 г. Культивирование проводилось в обьеме 500 мл.

Пример 1. Микроноситель N. 14

ВНИИОЧБ в количестве 1,5 г инкубируют B течение 60 мин в 50 мл раствора 10 — M хлористого кальция. После инкубации микроноситель отделяют фильтрованием. в фильтрате с помощью пламенного фотометра AAs-3 "Карл Пейс" определяют концентрацию ионов кальция, равную 0,29 г/л.

Следовательно, микроноситель сорбировал

0,09 г/л ионов кальция, что соответствует

23,7 (,.

Этот микроноситель используют для культивирования клеток ВНК-21, С этой целью в объем модифицированной среды

Игла, равный 500 мл, вносят 1,5 г микроносителя и 0,4 10 кл/мл ВНК-21 в качестве посевного материала, Инкубирование продолжают 72 ч при температуре 36+1 C и интенсивности перемешивания 100 об/мин.

Урожай клеток составил 0,8 10 кл/Mfl. б

Пример 2. Микроноситель Цитодекс-1 (Cytodex 1, Pharmacia Fch) в количестве

1,5 г инкубируют в течение 60 мин в 50 мл раствора хлористого кальция в концентрации 10 М. После инкубации микроноситель отделяют фильтрованием, а в фильтрате методом пламенной фотометрии определяют концентрацию ионов кальция, равную

0,38 г/л, Следовательно, микроKîñèòåëü практически не связан ионами кальция.

Клетки ВНК-21, Vего инкубируют с этим микроносителем в условиях примеоа 1.

Урожай клеток составил 2,2 10 кл/мл.

Как следует из изложенного, предложенный способ позволяет в сроки, не пре1703685 ностей клеточной линии и прирсды ми роносителя.

Микроноситель

ЦИТОДЕ КС-1

ЦИТОДЕКС-3

ЦИТОЛАР

N. 50 ВНИИОЧБ

N. 14 ВНИИОЧБ

ВС-Ж ВНИИОЧБ

N 33 ВНИИОЧБ

N. 27 ВНИИОЧБ

Составитель С, Светлышев

Техред М.Моргентал Корректор Т. Малец

Редактор Л. Гратилло

Заказ 40 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва. Ж-35. Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 вышаюгцие 2 ч, определить пригодность конкретного микроносителя для культивирования клеток животной ткани Благодаря этому сокращаются сроки исследований и получаются надежные результаты.

Предлагаемый способ особенно пригоден для оценки качества отдельных партий микроносителей, что позволяет исключить большие колебания в урожаях клеток, зависящие от особенностей отдельных партий микраносителя.

Способ универсален в том смысле, что позволяет оценить пригодность носителя для культивирования различных клеточных линий, хотя, естественно, абсолютная урожайность клеток будет зависеть от особенФормула изобретения

5 Способ определения пригодности микроносителя для культивирования клеток животных, включающий анализ микро носителя с последующим суждением о его пригодности для культивирования клеток

10 животных, отл и ч а ю щи и с я тем, что, с целью сокращения времени определения и повышения достоверности результатов, анализ микроносителя осуществляют путем его инкубирования в растворе соли кальция, 15 а суждение выносят на основании отсутствия связывания им ионов кальция.