Способ аэробной и анаэробной ферментации

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности Цель изобретения - повышение активности продуцента, снижение затрат на приготовление носителя и унифицировэние оборудования. Цепь изобретения - увеличение выхода продукта и упрощение способа. Для этого закрепление клеток производят е пене на межфазной поверхности газ - жидкость при удельных затратах мощности на создание межфэзной поверхности от 0,5 до 3.0 кВт/м3 ч. При этом для проведения аэробной ферментации используют бзрботаж воздухом, а анаэробной - бароотзж рецирку.лируемым в ферментаторе газом. 2 тэбл.

СО 03 COEiETÑÊÈÕ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

PE СПУБЛИК (5! ) 5 С 12 N 1/00, 11 /00

ГОСУДАР Ст Е Е ННЫ И КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4645361/13 (22) 30.01 89 (46) 23.01.92. Бюл. N. 3 (71) Науччо-производственное гидролиэное объединение "Гидролизпром" (72) И. 1.Áàëàruåaè÷, Ю.M,Поляк, Д.Д.Caaenbeâ. А.И.Сизов, А.Е.Ухналев, И,Г.Штепенко и

M.Ñ.Ôðèä (53) 577.15 (088.8) (56) Ada I. ef al. Continuous alcohol

fermentatIon te:".г Форе using immobilized

yeach сец — Bio echnol, 83. Pros Just. conf

Commer Арр! Н. Implicat Blotechnol, Ноah оо, 1983, р 597-611.

На«агго А.P. ef а1. Рго.1 ctlon of ethand

„-ac,гг г пh"ized in рес n. — Eur. J. Appi

rniCrOh,Oi В Oteohnel, 1983. ч,17. N . 3, р.148-151

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к поо«зводствам з-анола, фуранкарбоновой кислоть:. антибиотиков, биомассы дрожжей, ферментов и других продуктов трансформации ооганических субстратов иммобилизованными клеткаг- и микроорганизмов, Использование иммобилиэованных клеток е азробной и анаэробной ферментации позволяет более эффективно использовать каталитические свойства

1 микроорганизглов: появляется воэможность создания непрерывно действующих стабильных процессов без затрат на получение и выделение биомассы.

Известен способ анаэробной ферментации с использованием иммобилиэованных дрожжевых клеток для получения этанола, В этом способе клетки Saccharomyces Ж 1707070 А1 (54) СПОСОБ АЭРОБНОЙ И АНАЭРОБНОЙ

ФЕР1ЛЕНТАЦИИ (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности Цель изобретения — повышение активности продуцента. снижение затрат на приготовление носителя и унифицирование оборудования. Цель изобретения — увеличение выхода продукта и упрощение способа. Для этого закрепление клеток производят в пене на межфазчай поверхности гаэ — жидкость при удельных затратах мощности на создание межфаэной поверхности от 0,5 до 3,0 кВт/м ч. При этом

3 для проведения аэробной ф Гментаци используют барботаж воздухом, а аназробчой — барботаж рециркулируек ым в фермечтаторе газом. 2 табл.

cerevisiae включают е фотосшиваемые смолы, поляризация которых происходит под действием света 300 — 400 нл. Гелевые пластинки толщиной 0,8 — 1,0 м л укладывают вертикально в реактор непрерывного действия. В качестве субстрата подают разбавленную тростниковую мелассу. B установке, оборудованной таким образом, выход сп рта составляет 600 л/день. (1).

Однако продуктивность реактора постепенно снижается из-за накопления в нем осадка мелассы, который необходимо периодически удалять.

Известен также способ анаэробной ферментации для получения этачола с использованием дрожжевых клеток, и лмобилизованных в пектине. Для иммобилизации клеток S. serevisiae СМ-1-20 равные обьемы пектина и дрожжевой суспензии вводят в

1707070 смесь 0.2 M МагВлОт. Концентрации дрожжей в пектине и в исходной суспензии обычно равны 70 г/л сухой массы и 2 — б об. массы соответственно. При сбраживании глюкозы иммобилизованными на твердом носителе клетками максимальный выход этанолв составляет 0,43 г/л глюкозы, а продуктивность 12 кг/м ч (2).

Недостатками способов аэробной и анаэробной ферментации, включающих инкубацию субстратов с иммобилизованными на твердых носителях клетками, являются снижение активности клеток биомассы при закреплении на носителе иэ-за затрудненного доступа субстрата и кислорода при аэробных процессах и недостаточной вентиляции при анаэробных процессах, необходимость регенерации носителя, загрязнение носителя осадками субстрата и необходимость удаления осадков; неконтролируемость количества биомассы на матрице и ограниченная скорость потока через носитель, а также необходимость специального оборудования для накопления биомассы продуцента, приготовления носителя и ферментации.

Целью изобретения является увеличение выхода продукта и упрощение способа, Указанная цель достигается тем, что согласно способу аэробной и анаэробной ферл1ентации. в :-ючающему инкубацию с чбс1ратов с;.1 . о -ч1;и-ованными клетка ли и последующее от "e- ние продуктов реакции, используют к;е-,к;. обладающие флотирующей способностью, а их имл1об ° изац з осуществляют путем закрепления клеток на л ежфазной поверхности газ — жидкос-ь -.р 1 у эельных затратах л1ощности 0,5 — 3 кРт.t4 ч, при этом для иммобилизации гр«проведении аэробной ферментации используют барботаж воздухом, а при проведении анаэробной — барботаж рециркулируемым в ферментаторе газом.

Способность клеток адсорбироваться на поверхности раздела фаз газ — жидкость известна и используется при выделении клеток из культураnt,íoé жидкости методоM флотации. CDno1«p, ющей способностью обладают дрожж:- оде н ые грибы рода Candida, Trlchosporon Hansenula, К1и„vегоmyces, Аspe.g i us ".at å.",.1 . Bacil!us =ubtllls, базидальные rpt бы Tr ichoderma nitomlum и другие, Эта способность м«кроорганизмов используется для «х им,1обилизации на поверхности фаз газ — жидкость, B предлагаемом способе клетки закреплень1 на поверхности раздела фаз в пленках жидкости, окружающих пузырьки, и не обладают способностью свободно передви5

55 гаться в основном объеме жидкости, Об этом свидетельствует полное отсутствие клеток в жидкости, вывод« лой из аппарата, несмотря на их значительную концентрацию в объеме реактора (12 — 40 г/л абсолютно сухой биомассы) и высокие скорости протока среды (О - 1-2 ч ).

Среди известных способов вэробной и анаэробной ферментации, включающих инкубацию субстратов с иммобилизованными клетками и последующее отделение и родуктов реакции, не обнаружено признаков, сходных с отличительными признаками предлагаемого изобретения.

B отличие от способа аэробной и анаэробной ферментации с использованием традиционной иммобилизации на твердых носителях, где поверхность раздела фаэ фиксируют, создание поверхности раздела фаз в системе газ — жидкость требует введения энергии на диспергирование газа, так как такая двухфазная система обладает только динамической устойчивостью и в отсутствии подвода энергии на пере,лешивание paccnai вается с образован«ел газовой и жидкой фаз. Для создания и поддержания раздела фаз е зависимости от пенообразующей способности раствора требуется различный вклад мощности на перемешивэние

Увеличение выхода продукта в предлаraемсм способе аэробчой и ана:р б ой

$ept1eHTaции обус" овле чс -1оеыщ, ниел1 аки-.ност 1гродуцента по ci ae1е ию сз t nоСОбО 1, Гдв ИСПОЛЬЗуЮт Ил1.1Об 1ЛИЗа 1 1Ю Н3 твердых носителях, так как, e npe raraet" ом способе субс рат, кислород и другие ко лпоненты среды абсолютно доступны к,-етк и послед яя не ингибируется химическими соединениями, применение которых неизбежно при формировании твердых носителей. Поверхность раздела фаз газ— жидкость не загрязняется осадками субстратов и способствует активному массообмену газов.

Для накопления биомассы продуцЕнтов, проведения процесса иммобилизации и получения продуктов не требуется специального оборудования, а все три процесса протекают в одном ферментаторе. Унификация оборудования, а также снижение затрат на приготовление носителя достигается тем, что для аэробных и анаэробных процессоВ требуется один фер лентатор, с той лишь разницей, что при проведении аэробных процессов используется воздух, а анаэрсбных — C02, любой инертный газ Все указанное приводит к упрощению предлагаемого способа.

Иммобилизованные к четкt1 микроорга- низмов на поверхности раздела фаэ газ—

1-,0-„,7-0,, дкссть используют е аэробном процессе биотрансфор лации фурфурола (cD) в фуранг-r 1..6.човую кислоту (ГФКК), в аэробном процессе очистки сточных вод и анаэробно.л процессе сбраживания сахаров на спирт.

Ферментацию проводят с различны ли видами микроорганизмов из музея ВНИИгидролиз в ферментаторе емкостью 3 л при определенном вкладе мощности на создание межфаэной поверхности газ — жидкость, снабженном мешалкой, системами подачи воздуха, TE "статирования подачи субстрата и отбора культуральной жидкости через зону, лишенную подвода энергии пере лешиеания.

Зона, лo, èåííàÿ подвода энергии, создается искусственно, в виде кармана или ложного дна фер лентэтора. В этой зоне происходит расслоение на газовую и жидк, ю фгзы, Микроорганизмы, закрепленные на поверхности пузып ов, всплывают в активну о зон фермел ., ра, а культуральная жидкость, свободная от клеток и содержащая целевой продукт, выводится из зоны, ли шен -:ой эн ел ни.

6 ферментатор непрерывно подают питательнь :- средь газ,,од -.ержиеают температуру и рН. Одновременно с подачей гит-.тельной сред. ществляют непрер:лень и стбог. r ." ту; aльно . жидкости из зоны, лишенно.э эде".-.г энергии. Удержэн1е б1омгссы в ферм,atoðe осуществляют за с ет им 06 in! saци!1 r леток на поеер>,ности раздела ь г - аз — жидкость. B культуральной жидко--и определяют конц н т рации продуктов летодом жидкостной хро>латографии, спек р фотометрически, химичеСкк .

Осуществляя способ аэробной и анаэробной ферментации с использованием клеток, обладающих 1,лотирующей способностью, и лмоб . 1и зова н",ых на 1лежфгзной поверхности газ — жидкость. накопление биол1ассы продуцента и биотрансфорглацию фурфурола vr«" обилизованными клетками пооводят е одном ферментаторе.

Пример 1, Дрожжи Candlda tropicalls

649(У-699) вносят в ферментатор с питательной средой, а активную зону которого непрерывно подают воздух и осуществляют активное neper e! ивание среды с помощью мешалки (M = 500 мин ) для создания меж-1 фаэной поверхности газ — жидкость. Вклад мощности на перемешивание 1,2 кВт/м по3 верхности, на которой удерживаются клетки дрожжей. При достижении концентрации биомассы в фер лентэторе 12 г/л вместо nuTaòånьной среды начинают подачу раствора

cD с концентрацией 1,57;. Из зоны фермен10

55 татора, лишечной поде"..дэ í:г iи,i. о!5! раIoT культуральную жидкость без биомассы продуцента, в которой Ф окислен до ГФКК

1роцесс биотрансфор лац11и Ф протекает при 37 C и рН 6,0. Скорость пода«i раствора составляет D = 0 2 ч

-1

Выход целевого продукта — ГCDKK составляет 95ь. Процесс трансформации осуществляют непрерывно е течение 120 v, концентрация биомассы в ферментаторе составляет 12 г/л, а в культуральной жидкости — 0,12 г/л.

Пример 2. Накопление и имл обилизацию продуцента ФКК дрожжей "iansennla

anomala Kvp-5(Y-251) и тоансфор лацию Ф в

ГФКК осуществляот по методике примеГа

1, Выход ГФКК 94,3,/. Унос клеток продуцента с культуральной жидкостью состав lRет 0,12 г/л сухой биомассы, концентрация им,лобилизованных дрожжей в ферментаторе 11,8 г/л.

Пример 3. Накопление и ил1л1обилизацию продуцента ФКК дрожжей Candida

mellnii Георг-1(70) (штамм не депснирован) осуществляют по методике примера 1. Выход целевого продукта 88 . Унос клеток продуцента с культуральной жидкостью

0,20 — 0,30 г/л, концечтрация иммобилизованных дрожжей 11 г/л.

П р «е р 4. Накопление и иммобилиэацию продуцентэ ФКК Candida

gulllecmondii Лу-2 (У-248) и биотрансфс" л ац11ю Ф в ФКК осуществляют по методике прилгеpa 1. Выход це 1евого продукта 90 0=,»

Унос клеток про.уцента с культуральнсй жидкостью 0,23 г/л сухой б омассы. концентрация иммобилизсванных дрожжей 12 г/л, Пример 5, Анаэробчую ферментацию сбргживаемых сахаров гидролизата древесины проводят при помощи ил1л1оби иэованных в пене на межфазной поверхности гаэ — жидкость клеток дрожжей С. tropicalis

649 (Y-696). Межфазную поверхность создают в ферментаторе с мешалкой пои удельных затратах мощности 0,5 кВт/м .

B аппарат, снабженный мешалкой с отношением

Ь"жею — 3 бмеюалки и числом оборотов и = 125 мин, а также

-1 системами подачи воздуха и рециркуляции газа, заливают 1 л питательного субстрата— гидролиэатэ древесины, содержащего 6,9 г/л гексоз и 2,3 г/л пентоэ.

В посевную среду. содержащую 420 мг/л азота и 70 мг/л PgOs, вносят дрожжевые клетки С, tropicalis 649(У-696). Иммобилизация клеток происходит одновременнО с

|», !»nv non н«ем в аэробной стад. и на меж О пов" Г. мости газ — жl»QKocTb. Созда. ла-!. l ° з сч т подач«возду,а со скоростью

1 л,, работы к ешалки {и = 1 "5 м«м ). кс.»öeíòрац«я составляет 12,5 г/л cлЕСто подачи воздуха нач«мают рециркуляцию углекислого газа. образующего при сбраживании 10 гидролизата. Сбраживание сахаров гидролиза а на спирт происходит при 32 С, рН 4,0, подаче субстрата со скоростью D = 1,0 ч

-1

Выход этанола составляет 0,46 г/г от сброженмых редуцирующих веществ (PB) 15 г«дрол«эата

Концентрация б«омассы в культуральной жидкости, отбираел1ой из зоны, лишенной подвода энергии. составляет 0,1 — 0,25

r/n, 20

П р и к е р 6. По методике примера 5 пол |/ | а ют эта мол и „" »< п|змощи и<лк<обилизованмых на к е кфазной поверхности газ— жr дкость клеток Kluyvегоmyces marxianus

УС, При вкладе мощности на создание меж- 25 фаэной поверхности гаэ — ж <дкость 1,5 кВтlм вь ход спирта составляет 0,42 гlг. з кОМНЕмтрац«я 6«ОМаССЫ В КуЛЬтураЛЬНОй !

r «;, "-T«cocтавляет 0,5 г/л.

Пример По ме одике пр«мера 5 30 и С;», ча Ют Э; а. О я и ри пОмощи «к",мОби ли ЗОванмь х ма к -еж, азной поверхности газ— ж«дк ось! л .то" C rropicnlis QH-" (uj Teì!ì. не депом«ро-.-ам) | ;«вкл-:д" к с цности на создам« lлежфазмой поверхмост«газ — жид- 35

voсть 1,5 кВт/ выход спирта составляет

0 36 г/г, а концентрация биомассы в культурально жидкости составляет 0,1 — 0,18 г/л.

В -a6n. приведены рсзультаты других амазробмых фермемтаци«гидролизата 40 древесины и мелассгя ик мобилизованными клетvами

Пример 8. Оч«стку сточных вод глдполи»зного производства проводят путем аэробного культивирования Tr, cutaneum 45

Лд-10{Y491), Процесс проводят в лабораторном ферментат ре емкостью 5 л, число оборотов мешалки 1400 мин . расход воздуха 2 л/ч. Вклад мощ ости на перемеш«вание3,0 кВт, м; рН среды 5 5, t = 36"С; скорость 50

-1 подачи сточной воды О = 3.0 ч; концентрац«я б Омассы в фермента TОре 9,5 гlл сухой б«омассы; концентрация за рязнений на входе по ХПК 6000 мг Oz/л.

Очищенную сточную воду отбирают иэ 55 эоны ферментатора, лишенной подвода

ЭНЕРГИИ. В КОЛ«чЕСтВЕ 13.5 n/Ч, КОНцЕНтрация биомассы в ней составляет 0,1 — 0,2 г/л сухой биомассы. ХПКост = 2000 мг Оз/л. Избыточную био лассу отбирают из верхней части ферментатора с копн мтрацией 9.5 г/n C потскок,к,»дкости 1 5 n/ч, Глубина

О »истк«сост зв,;яет 66 — 70 / (пo ХПК) УДельмая окислител,мая мо,цность 12 г Q.-/n ч

Пример 9 Очистку воды r«upon«змодрожжевого про«зводства производят ассоциацией культур м«нроорган«змов

Aspergillus niger u penicillium chrisogenum (не депонированы) по методике примера 8.

Концентрация загрязнений на входе по ХПК

6700 мг Ог/л. Глубина очистки 75-78О(, (по

ХПК), удельная окислительная мощность системы 9,2 02/л ч.

В табл. 2 приведены результаты других аэробных ферментаций сточной воды иммобилизованным«клетками, Как видно из приведенных пр«флеров различных фе„рментаций, биомасса микроорганизмов в результате закрепления íà поверхности разд па фаз газ — жидкость имеет время пребь eэ. ия в обьеме ферк<ентатопа значител ьно 6зnbruee, чем время п ре бы вания жидкости, Так, e np« epax 1 — 4 пр«биотрэнсформации Ф среднее время пребывания жидкости в ферме таторе составляет 5 ч пои времени тГан:формации более 120 ч

В пр«к.ер;< 5 — 8 np«сбражr ва| . .." (.-харосодер. ащ«растворов в этгнол разница времен« "р- бывал«я дрожжей» 250 ч и жидкости (1 ч) еще больше Анаг-«-»нь е данны" пол " ены и при ч«стке стсчмы" вод: 0,3 «2-5" ч соответствеммс (;-р |;:, 6 и 9)

Способ ферк нтаци«с »спол. зовам, ° м клеток, обладающих флот,.рующей споссбностью, иммоб«лизованных путе л закрепления клеток на межфазной поверхности газ — жидкость может быть применен как для аэробных процессов {примеры 1 — 4, 8 и

9), так и амаэробнь!х (пр«флеры 5 — 8) S эависимос.и От ис. Ользуемого субстрата и по пенообразующей способности вклад мощности на перемеш«вание, необходимой для создания поверхности раздела фаз газ — жидкость и обеспечения массообмена кислорода, составляет от 0,5 кВт/м (для мелас3

Cbl дО 3 кВт/м (;. я СтОчных вод гидрОлиэнОго производства) Процессы перв«чного накопления биомассы продуцентов во всех примерах и различные процессы с «спользпван«ем им лобилизовамных на пояерхности раздела фаз газ — жидкость клеток проводят в однс л и том же ферментаторе для аэробнь х «амаэробных процессов.

В примерах 8 — 9 и р » ведем ы ферментации с использованием флотирующихся микроорганизмов различных классов и родов, что указывает на широкую возможность применения предnaraer" ого способа для

1707070 флотирующей способностью, а их иммобилизацию осуществляют путем закрепления клеток на межфазной поверхности газ— жидкость при удельных затратах мощности

5 на создание межфазной поверхности 0,5—

3.0 кВТ/матч, при этом для иммобилизации при проведении аэробной ферментации используют барботаж воздухом. а при проведении анаэробной — барботаж рециркули10 руемым в ферментаторе газом. получения продуктов метаболизма, биомасСЫ И ДЛЯ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД.

Формула иэобретения

Способ аэробной и анаэробной ферментации, включающий инкубацию субстратов с иммобилизованными клетками и последующее отделение продуктов реакции, о т л и ч а ю щ и 4 с я тем, что, с целью увеличения выхода продукта и упрощения способа, используют клетки, обладающие таблица!

Концентрация бт!оиассы, г/л (а.с.a.)

В реактора В унося

Выход спирта, r/n РВ

Расход электроСреда для фесментации

Пример

Втами микроорганизма энергии, кВт/мэ

C.trîðiñàlis 649 (7-699) о,о

0,5 12,5

Гидролизат

11

II

Il

II

Меласса

11

Il

ll

»ll»

Гидэолнэат

II

II

I l »

С,tropicaiis 649 (Y 699)

11»

l I »

11

K.ssarxianus МС (не делоны рован) о,38 с,iso о,4о

0,36

0,40

0,3

0,0

0,2 о.о о,18

1г,о

3i,О

31,о

12,5

l4>1

3,0

1,5 т 0

1,5

11

Мел а с сг

II

Il

Не."а с са, 1г

13

14

С.internedis

Тавл.з 11(85) (He деломирован) 0,41 с,42 о,4я

iS,4

19,с

12 ° 0

0,11 о,г

o,s

1,5

11»

I . дрс лиза" и

i7

18

С.рЛ11етт "sdii Лд-2 (v-248) 0,47

О,48

2,С

1,6

20,0

1г,с г,о

3,с

11

Мег.зс са

20 г1

Таблица 2 (с

Глубина очистки

Пример

Еаммы мнкрсорганнзиов реда для tepиентации

Концентрация биомассы, г/л,d,ñ.д.

Рас ход эле кт роr энергии ° кВт/иэ в уносе в реактоFc

8,8 12

52-56

1 Trichosporon cuteneum

Сточная вода 1 5 гидролнзован-

lesõ производств

Лд-1 О (У491) 9,5 0,1-0,7 &6-70

Сточная вода 3 ° О гивролиэованных производств

2 Tricbosporon cutsneua

Лд-lo(y-491) Тс з!е

9,0 О ° 5-0,7 64-70

7,9 9,о 63-69

4 Aspergillus niger

3,5

Сточная вода гнд- 1,5 ролизно-дрокяевого гвэонэводст ва

0117-18 75-78

0,4-0.7 75-77

5 Penicill ium chrisogetsss

3,о

3,5

1 г

4

6

8

1,5

3,0

3,2

0,5

1 ° 5

3,0

3,2 о,3

1,5

1ã,5

12,5

1г,о

12,0

3i,5

31,0

31 о

3о,8

30,5

15,0

0,0

o,ã г,о

lo,o о ° o

0,0

0,2-0,3

1,5

11,0

0,5 о,46 о,48

0,47

0,47

O,4О с,48

0,48

0,48

0,46

О,4г о,42