Штамм бактерий yersinia реsтis, предназначенный для проведения генетических и микробиологических исследований

 

Изобретение относится к микробиологии и генетике, в частности для генетических и микробиологических экспериментов в качестве маркированных штаммов. Целью изобретения является получение штамма для проведения генетических и микробиологических исследований при изучении генотипических и фенотипических свойств чумного микроба. Путём мутагенного воздействия фагоцитирующих клеток большой песчанки получен мутант чумного микроба, стабильно сохраняющий зависимость от цитидина. Штамм депонирован в коллекции Научно-исследовательского противочумного института Микроб под номером КМ-250. Ё

союз соВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)5 С 12 N 1/21, 15/01

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4725093/13 (22) 31.07.89 (46) 15.01.92. Бюл. Ф 2 (71) Среднеазиатский научно-исследовательский противочумный институт (72) Б.Б.Атчабаров, Б.М.Сулейменов, Н.А.Сатыбалдиев и Ж,M.Èñèí (53) 578.81 (088.8) (56) Биохимия и генетика возбудителей чумы, M.; Медицина, 1974, Генетика. 1975, т. XI, М 2, с, 140 — 144.

Микробиология и биохимия ООИ, Саратов.: 1982, с. 21-24.

Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1989, hk 44, с. 10-14.

54) ШТАММ БАКТЕРИЙ YERSINIA PESTIS, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ

Изобретение относится к микробиологии и генетике.

Известны. мутанты чумного микроба, зависимые от азотистых оснований. Как правило эти мутанты получены под действием различных физических факторов в химических агентов и используются для проведения различных микробиологических, и генетических экспериментов (1.2,3).

Для изучения генетики возбудителя чумы необходимо создание доступной для специалистов коллекции с максимально возможным набором маркированных штаммов, До настоящего времени не получены цитидинзависимые штаммы чумного микроба.

Целью изобретения является получение штамма для проведения генетических и микробиологических исследований.. SU„„1705342 А1

ГЕНЕТИЧЕСКИХ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ (57) Изобретение относится к микробиологии и генетике, в частности для генетических и микробиологических экспериментов в качестве маркированных штаммов. Целью изобретения я ел я ется получе ние ш тамма для проведения генетических и микробиологических исследований при изучении генотипических и фенотипических свойств чумного микроба. Путем мутагенного воздействия фагоцитирующих клеток большой песчанки получен мутант чумного микроба. стабильно сохраняющий зависимость от цитидина. Штамм депонирован в коллекции

Научно-исследовательского противочумного института "Микроб" под номером КМ-250.

Полученный цитидинзависимый штамм чумного микроба Y.pestls С-3332cyd- хранится в коллекции Всесоюзного музея живых культур Всесоюзного научно-исследовательского противочумного института Микроб" под номером КМ-250. Штамм имеет следующие морфологические и физиологические характеристики.

Величина клеток двухсуточной бульонной культуры составляет 1 — 2 мк, грамотрицательные, овоидной формы, биполярно окрашенные.

Дает агглютинативный рост в прозрачном бульоне с мелKOхлîll4àTûм осадком на дне пробирки. На агаре Хоттингера формирует пигментированные колонии с зернистым центром и периферической зоной диаметром 2-2,5 мм. Температура оптимума роста 28 С.

1705342 ности (10 единиц) тстсввт суспенвию е ни

Ферментирует глюкозу, маннит, арабинозу, дульцит, рамноэу, Не разлагает: пактозу, сахароэу, дульцит, раффиноэу, отрицательная урезаная активность, нв дает реакцию нитрификации, Отсутствует фибринолитическая и коагупазнвя активность, не пестициногенен и чувствителен к пестицину.

На среде Джексона-Берроуза формирует пигментированные колонии, на магниево-оксалатной среде Хигучи-Смита вырастают кальцийзависимые клетки. Цитидинэависимый мутант продуцирует фракцию 1, чувствителен к стрептомицину, татрациклину, пенициллину, Проявляет чувствительность к чумному фагу Покровской, фагу Л-413" С" и псевдотуберкулезному диагностическому бактериофагу.

Вирулентен для белых мышей и авирулентен для морских свинок, Зависим от пиримидинового нуклеозида-цитидин а.

Пример 1. Способ получения штамма

Yerslnla pestls КМ-250.

Фагоцитирующие клетки — полиморфноядерные лейкоциты (ПМЛ) и макрофаги (МФ) оказывают мутагенное действие на ряд микроорганизмов — Е.coll

Я typhlmurium, Р,flscherl, что было показано в опытах In vitro. Активным началом ПМЛ и

МФ являются дериваты кислорода: супероксидный анион (ОН ), перекись водорода (Н202) и др

Мутагенное действие фагоцитов на чумной микроб в опытах in vitro продемонстрировано в работе Атчабарова с соавт (41, Мутант Y.pestls КМ-250, получен из природного штамма. Y.pestls С-3332 ln vlvo под действием стимулированных и резидентных ПМЛ и МФ в брюшной полости большой песчанки (Rombomls opimus) основного носителя чумного микроба в пустынных очагах чумы.

B опытах используют, как и in vitro, предварительную стимуляцию выхода в брюшную полость большой песчанки ПМЛ с последующим введением туда чумного микроба и смывом его после умершвления животного. Оценку результатов взаимодействия фагоцитов и возбудителя чумы проводят после изучения свойств субкультур штамма чумного микроба взятого в опыт.

Пример 2. Использование штамма

КМ-250 для изучения метаболизма пиримидиновых оснований. Иэ суточной агаровой культуры чумного микроба КМ-250 и С-3296 (штамм выделенный в высокогорном Закавказском природном очаге) по стандарту мут5

55 забуференном физиологическим растворе (рН 7,2) с концентрацией микробных клеток

10 в 1 мп. Пипеткой переносят 0,5 мл испы9 туемой культуры в пробирки с 4,5 мл физиологического раствора, доводят концентрацию микробных клеток до 10 в 1 мл. Из разведения Y.pestls КМ-250 бактериологической петлей (диаметр 2 мм) делают посев двумя штрихами (2,5-3 см) нв пластинку минимального агара следующего состава (Минимальная среда — MC): 1000 мл дистиллированной воды; 15,0 г агар-агара; 30 мл 107(, раствора хлористого кальция; 7,0 г двухзамещенного ортофосфата калия; 2,0 г однозамещенного ортофосфата калия; 0,5 г цитрата натрия; 0,1 г сульфата магния; 1,0 r сернокиспого аммония; 3,0 г глюкозы; 0,5 г сульфита натрия; цистеин, фенилаланин, метионин, треонин, аргинин, тиамин по 50 мг.

Иэ конечного разведения штамма С3296 производят высев двумя штрихами на ту же чашку с МС следующим образом: первый штрих проводят перпендикулярно посеву штамма С-3332 cyd- на расстоянии 3 мм оТ края штриха, второй — параллельно на том же расстоянии. Посевы таким методом делают на 3-4 пластинках минимального агара. Место посева каждого штамма метят.

Чашки с посевами инкубируют при 28 С.

На 2-3 сутки вырастают все посевы штамма С-3296, а штамма КМ-250 лишь в местах наиболее близких к посевам штамма

С-3296.

Полученные данные позволяют сделать выьод о синтрофизмеобеспечении потребности в пиримидиновых основаниях штамма (Y.pestls КМ-250) с блоком их биосинтеза, промежуточными продуктами метаболизма штамма Y.pestls С-3296 с ненарушенными путями их биосинтеэа.

Пример 3. Использование штамма

Y.pestls KM-250 для изучения пиримидинового оперона, Иэ суточной агаровской культуры чумного микроба штамма Y.pestls

KM-250 и С-3296 по стандарту мутности (10 единиц) готовят суспензии в эабуференном физиологическом растворе (рН 7,2) с концентрацией микробных клеток 10 в 1 мл. s

Пипеткой переносят 0,5 мл суспензии в пробирку с 4 мл физиологического раствора, доводят концентрацию до 10 микробных в клеток в 1 мл, Иэ этого разведения микропипеткой переносят 10,0 мкл (10 микробных б клеток) на плотные питательные среды (посев "бляшкой") следующего состава: минимальная среда (аналогичная МС в примере

1): МС с добавлением цитидиловой кислоты (50 мг на 1 л среды); МС с добавлением уридина (50 мг на 1 л среды); МС с добавлеем цитидина (50 мг на 1 л среды).

1705342

Составитель 6,Атчабаров

Редактор М.8асильева Техред М.Моргентал Корректор М,Кучерявая

Заказ 170 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-З5, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Чашки с посевами инкубируют 2-3 сут при 28 С.

Штамм чумного микробе КМ-250 растет лишь на среде Q 4 (с добавлением цитидина). Тогда как штамм С-3296 растет на всех укаэанных средах.

Цитидиловая кислота. уридин являются предшественниками биосинтеза цитидина.

Полученные данные позволяют сделать заключение о месте блока путей синтеза пиримидиновых оснований у испытуемого штамма.

5 Формула изобретения

Штамм бактерий Yerslnla pestls KM-250, предназначенный для проведения генетических и микробиологических исследований.