Способ консервирования постоянных клеточных линий

 

Изобретение относится к криобиологии и может быть использовано для низкотемпературного консервирования постоянных клеточных культур. Цель изобретения - упрощение процесса консервирования клеточных культур. Для этого в способе консервирования постоянных клеточных линий, включающем замораживание в присутствии криопротектора на первом этапе до -30°С, на втором со скоростью 5 град/мин до -70°С с последующим погружением в жидкий азот, замораживание осуществляется с криоконсервантом пропандиосахароль в разведении 1:2-1:5 со скоростью замораживания на первом этапе 0,2 - 0,4 град/мин. 2 табл.(Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (я)з С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

K АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

2 табл. (21) 4761222/13

22) 22.11.89

46) 30.01.92. Бюл. N. 4 (71) Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР (72) В.И.Луговой,Л.З. Верховская. С.Т.Олейник, В,М.Гучок и С.Е.Мамаева (53) 578.085.23(088,8) (56) Дьяконов Л.П., Глухов В.Ф., Поздняков .А.А. и др. Культура клеток и тканей животных, Ставрополь: Ставр. с /х институт, 1980, с. 110.

Авторское свидетельство СССР

М 1398203, кл. А 01 N 1/00, 1987.

Авторское свидетельство СССР

N. 1192762,кл. А 01 N 1/00, 1985.

Авторское свидетельство СССР

N- 888896, кл. А 01 N 1/02, 1981.

Изобретение относится к криобиологии и может быть использовано для низкотемпературного консервирования постоянных клеточных культур.

Известные способы консервирования клеточных культур имеют ряд недостатков; требуют отмывания криопротекторов, основаны на применении неустойчивых при хранении криопротекторов или криопротекторов, полученных лабораторным синтезом в небольц)их количествах.

Наиболее близким к данному является способ консервирования клеточных культур, включающий замораживание их в присутствии 10 ДМСО по двухэтапной программе: до -300С со скоростью 10С/мин; затем до -70 С со скоростью 4-6 С/мин с последующим помещением в жидкий азот на хранение. (54) СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ ПОСТО ЯНН ЫХ КЛЕТОЧ Н ЫХ ЛИНИЙ (57) Изобретение относится к криобиологии и может быть использовано для низкотемпературного консервирования постоянных клеточных культур. Цель изобретения — упрощение процесса консервирования клеточных культур. Для этого в способе консервирования постоянных клеточных линий, включающем замораживание в присут ствии криопротектора на первом этапе до

-30 С, на втором со скоростью 5 град/мин до -70 С с последующим погружением в жидкий азот, замораживание осуществляется с криоконсервантом пропандиосахароль в разведении 1:2-1:5 со скоростью замораживания на первом этапе ОД -0,4 град/мин.

Недостатком этого способа является необходимость отмывания клеток от криопротектора, что значительно усложняет процесс консервирования. Кроме того, ДМСО неустойчив при хранении: разлагается с образованием серосодержащих продуктов, обладающих резким неприятным запахом.

Срок хранения до 1 мес.

Цель изобретения — упрощение процесса консервирования.

Поставленная цель достигается тем. что согласно способу консервирования постоянных клеточных линий, включающему замораживание в присутствии криопротектора на первом этапе до -30 С, на втором со скоростью 50С/мин до -70 С с последующим погружением в .жидкий аЗот, замораживание осуществляется с криоконсервантом пропандиосахароль в разведении 1:2 — 1:5 со

1708835 скоростью замораживания на первом этапе

0,2 — 0,4 С/мин.

Криоконсервант пропандиосахароль содержит пропиленгликоль (1,2-пропандиол) 360 г, сахарозу безводну|о 32 г, натрий хлористый 6 г, воды для иньекций до 1 л, Криконсервант обладает низкой токсичностью и устойчив при хранении до 2 л, ЛД-50 пропандиосэхароля серии 050186 для белых беспородных мышей l5,4 (14,0 — 17,0) г/кг, через 2,5 r хранения ЛД-50-15,6 (14,0—

18,0) r/êã. Разработана технология на получение готовой стерильной лекарственной формы пропандиосахароля и нормативнотехническая документация (ВФС).

Пример 1. Сформировавшийся монослой клеток постоянной линии почки теленка (ПТ) в хорошем состоянии (клетки эпителиоподобного типа с четко выраженными границами) снимают с поверхности стекла культуральных сосудов смесью растворов версена и типсина в соотношении

4:1 бесцентрифужным методом и берут пробу для определения концентрации и жизнеспособности клеток, К суспензии клеток добавляют криоконсервант пропандиосэхароль разбавленный питательной средой:

90 . - среды 199, 107 сыворотки крупного рогатого скота и IOQ мкг/мл канамицина сульфата, до конечного разведения 1;3,5 и концентрации клеток 1,9 х 10 /мл, Клеточ б ную суспензию разливают в полиэтиленовые ампулы по 1,5 мл и эапаивают.

Зквилибрацию клеток с криоэащитной средой осуществляют 15 — 20 мин при комнатной температуре. Охлаждение проводят в программном замораживателе на первом этапе со скоростью 0,3 С/мин до -30 С, на втором со скоростью 5 /мин до -70ОС, после чего погружают в жидкий азот (-196 С) и хранят 20 дн, Отогревают в водяной бане при 37 С. Размороженные клетки переносят в культуральные флаконы, добавляют питательную среду д5о посевной концентрации клеток 1,9 х tÎ /мл. Культивирование осуществляют при 37 С без замены среды через сутки. Жизнеспособность разморо- женных клеток определяют методом суправительног0 окрашивания раствором типанового синего, которая .составила

80,0 . По истеченли 4 сут культивирования образцов монослой выполнен на 1007, поверхности культурального флакона. Клетки имеют полигональную форму с хорошо вы5

55 раженными границами, В цитоплазме отсутствуют видимые признаки цитопэтологии.

Пример 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1 на клетках постоянной линии карцинома гортани(Нер-2). Замораживэют в криоконсервирующих средах с различными разведениями пропандиосахароля 1;1; 1:1,5; 1:2; 1:3; 1:3,5; 1: 5; 1.6, Самая высокая жизнеспособность клеток обеспечивается при разведении пропандиосахароля 1;2 — 1:5. На 4-е сут культивирования монослой этих образцов выполнен на

100 ф„клетки имеют полигональную форму с четко выраженными границами, в течение

3 пассажей хорошо снимаются со стекла и пересеваются. Образцы, консервирован-. ные при разведении пропандиосахароля

1:1; 1:6, при культивировании образовывают островки на поверхности культуральных флаконов и не пассируются.

Пример 3. Способ осуществляют. аналогично примеру 1 на клетках постоянных линий Нер-2 и ПТ. Замораживание на первом этапе осуществляют с различными скоростями 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1,0, 5,0 С/мин.

Жизнеспособность клеток Нер-2 и ПТ после замораживания с различными скоростями на 1-м этапе (n=8) приведена в табл.1.

Из табл.1 следует, что для клеток Нер-2 оптимальными являются скорости 0,2—

1,0ОС/мин, Для клеток линии ПТ этот интервал уже 0,2 — 0,4 ОС/мин. Поэтому отобран интервал 0,2 — 0,4 "С/мин, Пример 4. Способ осуществляют аналогично примеру 1 с клетками Нер-2 и

ПТ. Параллельно консервируют клетки известн ь.м способом.

Жизнеспособность клеток Нер-2 и ПТ после замораживания различными способами на 1-м этапе (п=8) приведена в табл.2.

Из табл.2 следует, что жизнеспособность клеток, консервированных предлагаемым способом, такая же, как и в известном.

Формула изобретения

Способ консервирования постоянных клеточных линий путем замораживания их в присутствии криопротектора на первом этапе до -30 С, на втором со скоростью

5 град/мин до -70 С с последующим погружением в жидкий азот, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения процесса, замораживание осуществляют с криоконсервантом пропандиосахароль в разведении i:2 — 1:5, а скорость замораживания нэ

1 этапе 0,2 — 0,4 град/мин.

170S835

Таблица 1

Таблица 2

Составитель А.Романченко

Техред М.Моргентал Корректор M,Øàðoøè

Редактор А.Долинич .

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 40> Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5