Штамм medicago sатivа l. - продуцент пероксидазы
Изобретение относится к биотехнологии и химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано для получения диагностикумов. биореакторов и лекарственных средств. Целью изобретения является получение штамма клеток Medlcago satiya, продуцирующего пероксидазу. Данный штамм получен и депонирован во Всесоюзной коллекции клеток высших растений ИФР АН СССР под номером 23 и обладает высокой продуцирующей пероксидазу способностью. 1 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 5/04
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ: (21) 4828580/13 (22) 23.05.90 (46) 15.02.92. Бюл. N 6 (71) Институт физиологии растений им.
К,А.Тимирязева (72) А.Ю.Скрипников. B,В..Урманцева, Л.А,Волкова, Н.Н,Карасев и И.Г.Газарян (53) 578.085.23 (088.8) (54) ШТАММ MEDICAGO SATIVA L; — ПРОДУЦЕНТ ПЕРОКСИДАЗЫ
Изобретение относится к биотехнологии и химико-фармацевтической промышленности и может быть использована для получения диагностикумов, биореактивов и лекарственных средств. "
Medicago sativa — люцерна посевная, многолетняя трава, произрастающая на территории Советского Союза. Удельная пе.роксидазная активность в 15 — 20 раз ниже активности корней хрена, Цель изобретения — получение штамма клеток Мед!са9о sativa, продуцирующего пероксидазу.
Данный штамм получен на кафедре Клеточной физиологии и иммунологии МГУ и депонирован во Всесоюзной коллекции клеток высших растений Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева АН СССР под номером 23. . История получения штамма.
Источником получения штамма служили листья стерильных зеленых 30 дневных раетений, Первичный каллус образовался на агаризованной среде Гамборга В-5, содер„„ Ж„„1712413 А1 (57) Изобретение относится к биотехнологии и химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано для получения диагностикумов, биореакторов и лекарственных средств, Целью изобретения является получение штамма клеток
Medlcago sativa, продуцирующего пероксидазу. Данный штамм получен и депонирован во Всесоюзной коллекции клеток высших растений ИФР АН СССР под номером 23 и обладает высокой продуцирующей пероксидазу способностью. 1 табл.
° жащей фитогормоны, мг/л: 2,4 Д 8; НУК 0,5; кинетин 8. Культивирование листовых эксплантов проводили при постоянном освещении интенсивностью 2000 лк в чашках
Петри диаметром 10 см, содержащей 25 мл среды, В каждую чашку Петри помещали по
6 листовых пластинок нижней стороной в среду. Через 30 сут после эксплантации с целью получения суспензионной культуры первичные каллусы переносили в жидкую среду В-5 с фитогормонами в составе, мг/л;
2,4 Д 0,1; НУК0,5; кинетин 0,1. Для этого 400 мг каллусной ткани помещали в колбы объемом 500 мл., содержащей 20 мл среды.и культивировали ее на качалке при 140 об/мин в течение 14 сут. После этого 20 мл суспензии переносили в колбы объемом 1 л. содержащей 100-150 мл среды. Суспензив в этих условиях пассировали в течение 5
1 циклов выращивания.
Далее в ИФР АН СССР в 1985 ã. суспензия была переведена на среду Мурасиге и
Скуга с витаминами по Стаба и фитогормонами, мг/л: 2,4 Д 1; кинетин 0,1.
1712413
50 4 С). Раствор декантируют от осадка, осадок суспендируют в 500 мл 1 M раствора
KCI в течение 30 мин, затем отделяют центрифугированием. Гомогенат диализуют против 5-кратного избытка 5 мМ ацетатно55 го буфера рН 6,0 в течение 14 ч. Далее раствор наносят на колонку (2,6х2 см), уравновешенную 5 MM ацетатным буфером со скоростью 15 Mn/ч. Адсорбировавшиеся на колонке белки элюируют линейным градиентом исходного буфера рН
Культуральные свойства штамма.
Характер роста: суспензия желтоватого оттенка, индекс роста по сырой и сухой.биомассе 10-15, по числу клеток 30-36, число живых клеток 60 — 80 .
Суспензия выращивается в течение 96 пассажей в режиме накопительного культивирования в жидкой среде, мг/л: йН4МОз 1650
KNOB 1900
CaClz .2Hz0 440
Mg S0< . 7Hz0 370
КНг Р04 170, НзВОз 6,2
MnSO< 4Hz0 22,3
ZnS04 .7НгО 8,6
К! 0,83
NazMo0< .2Hz0 0-,25
CuS04 5НгО 0,25
CoClz .6НгО 0;25
FeSO4 6НгО 27,8
Naz ЭДТА 37, 3
Витамины по Стаба: фолиевая кислота
0,5; рибофлавин 0,5; биотин 1,0; Са-пантотенат 1,0; пиридоксин 1,0; тиамин 1,0; амид никотиновой кислоты 2,0; цианокобаламин
0,0015. . Кинетин 0,1, 2,4 дихлорфеноксиуксусная кислота 1,0 .Гидролизат казеина . 500
Сахароза . 30000
Температура 26+1, влажность
67= -3, темнота колбы на 1 л с 100 мл питательной среды на качалке 80 — 98 об/мин, радиус вращения 18-20 с. Продолжительность цикла выращивания 13 — 15 дней, исходная плотность засева 0,8-2,0 r сухой массы Hà 1л или 1 10 клеток/мл, кратность рассева 1/7-1/10.
Цитологическая характеристика.
Суспензия клеток люцерны состоит из меристематических (размером 4,8-9,5 мкм) и паренхимных (1 1,4-28,5 мкм) клеток. Процентное соотношение агрегатов в экспоненциальную фазу роста: 2 — 5 клеток 20 — 30, 10 клеток 30-35%, >10 клеток 37-387, отдельные паренхимные клетки 2-4ф,.
Кариологическая характеристика.
Распределение клеток по числу хромосом, : n — 17; 2п — 26; Çn — 19; 4n — 11;
>4п -21.
Способы хранения.
Метод пересевов — цикл выращивания в жидкой среде 13-15 дней, замораживание в жидком азоте — условия подготовки, состав среды обычный, возраст культуры 6-7 дней, криопротектор ДМСО в конечной концент5
35 рации 7, замораживание проводилось по ступенчатой программе, оттаивание в водяной бане при 40 С, промывание материала питательной средой и высев с максимальной плотностью на поверхность агариэованной среды, процент живых клеток сразу после оттаивания и промывания 20 — 30 .
Характеристика биосинтеза пероксидаэы в клетках люцерны.
Активность пероксидазы, измеренная спектрофотометрически по гваяколу, в цикле выращивания возрастает, выявляя значительную активность в фазу деградации клеток (22 — 30 сут). Оптимум активности в клетках и в среде при рН 5,5, Активность в клетках достигает 300 ед.ОП/мг сух.м мин, при расчете на 1 мл .среды активность в клетках колеблется в разные циклы выращивания в фазу деградации в пределах
1200 — 2200 ед.ОП/мл .мин, а в среде 400800 ед.ОП/мл мин.
Анаксия в течение 24 — 36 ч приводит к увеличению активности в 2 — 3 раза, однако стабильность фермента при этом падает.
Изучение физико-химических характеристик показало, что основным компонентом пероксидазы клеток люцерны является изофермент С (pl 8.9; 9,2; 9,3), который выделен в гомогенном состоянии двойной ионообменной хроматографией на КМ-сефацеле. Выход иэофермента С составляет
0,25-0,30 мгlг сухих клеток. Изоферментный состав (молекулярный вес, RZ; К, Кь) изофермента С пероксидазы люцерны близки по свойствам изоферменту С пероксидазы хрена.
Пример конкретного выполнения.
Штамм люцерны культивируют на среде укаэанного выше состава при 26 С в темноте. В постстационарную фазу роста (21-26 сут) биомассу клеток отделяют от жидкой среды фильтрованием под вакуумом. ЗОО r сырой биомассы проМывают.500 мл 5 мМ К-фосфатного буфера рН 7,0 и разрушают на гомогенизаторе при скорости 15 тыс.об/мин в течение
5 мин при 40С, осадок отделяют центрифугированием (20 мин, 14 тыс.об/мин, 1712413
Формула изобретения
Штамм Medical sativa L. ВСКК(ВР)
%23-продуцент пероксидазы.
Составитель 8; Урманцева
Техред М.Моргентал Корректор A. Осауленко
Редактор Ю. Середа
Заказ 510 Тираж . Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101
6,0., собирая фракции в интервале 180200 мМ. Рехроматографию проводят в ана-. логичных условиях. После. рехроматографии исследовали изоферментный состав различ° ных фракций, определяли молекулярную. массу фермента методом злектрофореза и гель-фильтрации, изучали термоактивацию фермента при 50 и 65 С. В таблице представлены данные, позволяющие сравнить свойства пероксидазы хрена (коммерческий препарат) и полученный препарат щелочной изоформы пероксидазы люцерны. г
Сравнительный анализ нового препарата с коммерческим препаратом пероксидазы хрена показывает, что культура клеток люцерны может быть использована в качестве альтернативного источника коммерческой пероксидазы с более широкой сферой его применения.
