Способ определения модификационных изменений белкового комплекса зерна

 

Использование: сельское хозяйство , биотехнология, селекция и семеноводство . Сущность изобретения: изучают инфракрасный спектр проламина исследуемого и стандартного сортообразцов, определяют оптическую плотность в максимумах, рассчитывают отношение значения оптической плотности в максимуме при 1710-1730 см к значению оптической плотности в максимуме при 1650-1660 см и по возрастанию его у исследуемых образцов по сравнению со стандартными определяют степень модиЛикационных изменений . 1 ил. , 3 табл. Ј (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

Ь1 9Ц 2

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

flQ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4863483/13 (22) 03, 09. 90 (46) 07.06,92. Бюл. и 21 (71) Днепропетровский государственный университет им. 300-летия soccoeдинения Украины с Россией (72) В.С.феденко, В.С.Стружко и А.Н.Винниченко (53) 631.527.42(080.8) (56) Патент CQA N 3679433, кл. А 21 J 3/14, 1972.

Smith J.À., Rottman W.L., Rubenstein J, Plant Science, 1985, v. 38, р. 93-98.

Перуанский Ю.В., Савич И.Н. Изв.

АН КазССР, Сер. биол., 1988, М 2, с. 20-25.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно генетическим исследованиям зерновых культур, и может быть использовано для оценки сорто" образцов, различающихся по качеству зерна.

В процессе биосинтеза белки могут быть модифицированы сопутствующими небелковыми веществами (углеводы, липиды, гликолипиды). Процесс модификационных изменений затрагивает основной компонент белкового комплекса - проламин, который является маркером генома и выполняет запасную функцию в зерне, Вместе с тем и не« белковые -вещества играют важную роль в формировании белковых структур, например, гликолипиды в формировании

„„SU„„1739284 А 1 (g1)g G 01 N 33/02, А О1 Н 1/04

2 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИОДИфИКАЦИОННЫХ ИЗИЕНЕНИИ БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА ЗЕРНА (57) Использование: сельское хозяйство, биотехнология, селекция и семеноводство. Сущность изобретения: изучают инфракрасный спектр проламина исследуемого и стандартного сортообразцов, определяют оптическую плотность в максимумах, рассчитывают отношение значения оптической плотности в максимуме при 1710-1730 см — 1 к значению оптической плотности в максимуме при 1650-1660 см и по возрастанию его у исследуемых образцов по сравнению со стандартными определяют степень модификационных изменений. 1 ил., 3 табл. уникальной структуры клейковины, определяющей технологические свойства пшеницы. Использование добавок в пшеничную муку улучшает качество хле" бопродуктов. Имеющиеся данные свидетельствуют о генетической специфич- 1 Х) ности модификации в процессе биосин- 4 ь теза проламинов, что приводит к изменениям показателей, определяющих качество зерна, В связи с этим разработаны различные способы определения модификационных изменений белково- 3 " го комплекса зерновых культур, 3о

Известные способы включают экстракцию проламинов и определение содержания углеводов, суммарных липидов, гликолипидов или качественного состава липидной компоненты. Для опреде3

17 дения генетической специфичности зерновых культур к модификационным изменениям используют способ, согласно которому проводят SDS-электрофорез или изоэлектрофокусирование камплек» са проламиновых белков в полиакриламидном геле. Электрофореграмму обрабатывают конкавалином А, меченым радиоактивным изотопом иода-125. По специфичности связывания отдельных полипептидов с конкавалином А определяют зависимость процесса гликозилирования от исходного генотипа. К основным недостаткам указанных способов следует отнести трудоемкость и длительность операций по подготовке образца и проведение анализа с использованием набора дефицитных реаген тов, которые специфичны для каждого определяемого компонента.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому является способ, включающий экстракцию проламиновых белков из зерна с различным генотипом, проведение электрофореза в полиакриламидном геле, окрашивание гелей цветореагентом и определение модификационных изменений белков по данным денситометрии.

Согласно известному способу экстрагируют проламин из селекционных образцов зерна раствором 70ь-ного этанола с 2)1 мочевиной..Затем проводят электрофоретическое разделение выделенных белковых препаратов в плоском 100-ном полиакриламидном геле с 8 fi мочевиной в уксуснокислой системе, а также в 12,5Ф-ном полиакриламидном геле с 0,1Ж додецилсульФата натрия в щелочных буферных растворах. После электрофореза гели окрашивают с помощью Шифф-иодной кислоты для выявления углеводов, используя

12 операций в такой последовательности: обработка 100 мл 104 раствора трихлоруксусной кислоты в течение

30 мин; промывка дистиллированной soдой по 200 мл (2 раза по 30 мин); обработка 100 мл 1,14-ного раствора исдной кислоты, приготовленной на

403-ном этаноле, в. течение 30 мин; промывка дистиллированной водой (2 раза по 200 мл в течение 5 мин; выдержка в течение 4 мин в 100 мл восстанавливающего раствора (40 мл

53-ного раствора иодистого калия, растворенного в 5:;-ном.растворе гипо39284 Д сульфита натрия и 60 мл 3,5 мИ раствора соляной кислоты); повторная обработка в 100 мл свежеприготовленно- " го восстанавливающего раствора в течение 7 мин; обработка дистиллированной водой 3 раза; инкубирование. в

100 мл реактива Шиффа р течение

90 мин; обработка 200 мл обесцвечивающего раствора (0,23 метабисульфита натрия, 403 этанола и 53 уксусной кислоты) в течение 90 мин при 55 С; промывка (2 раза по 100 мл) раствором, содержащим 403 .этанола и 54 уксусной кислоты, в течение 30 мин„ обработка 200 мл 0,83"ного раствора метабисульфита натрия, приготовленного на 0,12 И соляной кислоте, до полного обеспечивания фона; фиксиро20 вание в 53-ном растворе уксусной кислоты.

Оптическую плотность окрашенных зон получают путем сканирования гелей на денситометре и по .полученным значениям определяют модификационные изменения белкового комплекса зерна.

Указанный способ сложен s техническом исполнении, отличается длительными и трудоемкими методиками, требу30 ет большого расхода дефицитных реагентов (более 10) и предусматривает подготовку сложных растворов (более

10) . К недостаткам способа следует также отнести и необходимость прове" дения электрофоретического разделе"

35 ния комплекса проламиновых белков на группы полипептидов перед определением оптических параметров. Указанные недостатки ограничивают использование способа в селекционной практике для

40 экспресс-диагностики.

Цель изобретения - упрощение и ускорение анализа.

Способ осуществляют следующим образом.

45 >

Экстрагируют белки проламинового комплекса из размолотого зерна стандартного и исследуемого сортообразца злаковых культур. Проводят под" готовку препарата проламина к анализу путем отливки пленки из раствора на оптическое стекло. Измеряют инфракрасный спектр проламина на спектрофотометре в области 1550-1850 см 1

Ы определяют значения оптической плотности в максимумах поглощ ния при.

1710-1730 и 1650-1660 см и рассчитывают соотношение оптических плотностей при указанных максимумах в каче! 73,)2 стве сравнительного показателя. Повы шение степени модификации белкового комплекса:выявляют по возрастанию величины сравнительного показателя

5 исследуемого сортообразца в сравнении со стандартным. Интервал значений волновых чисел максимумов погло; щения при 1710- I730 и 1650-1660 см обоснован экспериментально. . .1О

На .чертеже .приведены спектры погло" щения зерна Стандартного (линия кукурузы W64A +/+." кривая 1) и исследуемого (мутантная линия кукурузы .

М64А 02/02 - кривая 2) сортообразцов.

Отличительными особенностями способа являются анализ по спектру поглощения проламина и определение сте-, пени модификационных изменений белкового комплекса: зерна по величине от- 20 ношения оптических плотностей в максимумах поглощения проламина исследуемого сортообразца в сравнении со стандартным. Пример !. Исследуют ИК-спект- .25 .ры .глиадинов, выделенных экстракцией

703-ным этанолом после отделения водо- и солерастворимых белков из размолотого зерна сортов пшеницы, контрастных .по технологическим свойствамКоралл Одесский (твердая) и Днепропетровская-.846 (мягкая). Для подготовки тонкой пленки образца к анализу раствор 3 мг преларата в 0,5 мл

70о;-ного водного диоксана наносят на оптическое стекло из Флюорита и высу" шивают под вакуумом. ИК-спектры глиадинов получают на приборе "Спекорд

М-80". в области !550-1850 см Опти ческие плотности 0 и Dz. в максимумах поглощения при 4 и Я рассчиты- 40 вают по методу базисной линии.

Значения сравнительного показателя D /D< глиадинов приведены в табл. 1 (данные статистически досто- верны, ошибка. измерения не более 5 ;). 45

Значения сравнительного показа-". теля свидетельствуют о возрастании модификационных изменений белков ,npоламинового комплекса зерна пшениI

50 цы мягких сортов в сравнении с сор" тообразцом твердых пшениц.

Пример 2. Исследуют ИК-спектры проламинов, выделенных из зерна злаковых культур, аналогично примеру °

Результаты определения сравнительного показателя D !0 проламинов приведены в табл. 2 (данные стати-.

84 стически достоверны, ошибка измерения не более 5Ô).

Вариабельность сравнительного по казателя свидетельствует о зависимос1

) ти степени модификационнои изменчиво" ., сти проламинового комплекса от приро" ды зерновых культур.

Пример 3. Исследуют аналогич.но примеру 1 ИК-спектры белков зеинового комплекса, выделенных из зерна кукурузы с различным генотипом путем экстракции раствором 704-ного этанола с /3-мeрxaптoэтaнолом. В ка" честве стандарта используют исходные линии кукурузы CM64A +/+, А 619 +/+), а в качестве исследуемых образцовлинии кукурузы с эндоспермовыми му- . тациями типа о2, su2, о2/о2, su2/ . Результаты .определения сравнительного показателя D,/D< зеинов приведены в табл. 3 (данные статистически достоверны, ошибка измерения не бо" лее 53).

Полученные результаты подтверждают, что сравнительный. критерий позволяет определить степень модифика" ционных изменений белкового комплекса в зависимости от типа эндоспермовой мутации.

Так, мутация типа о2/о2 вызывает существенные изменения в процессах: модификации белков в отличие от мутации типа su2/su2. В двойных мута" циях типа o2/î2 зи2/ви2 наблюдается снижение модификационных изменений в сравнении с мутацией типа о2/о2.

Использование предполагаемого способа в сравнении с .известным по" зволит ускорить и упростить определение модификационных изменений белкового комплекса зерна путем исключения длительных и трудоемких операций, исключить расход многочисленных реагентов. Предлагаемый. способ позволяет выявить сортовую и генотипическую специфичность злаковых культур к модификационным изменениям белкового комплекса при оценке качества зерна по хозяйственно ценным призна-,. кам.

Формула изобретения

Способ определения модификацион ных изменений белкового комплекса зерна, включающий экстракцию прола39284

Таблица1 е в еаза

Сорт пшеницы 11,см I 4>c D(./Dg

Коралл Одесский

Днепровская846

1730 1656 0,10

1730 1656 .0,21

Таблица 2

Ф

Характеристика проламинов О,,см ч,см D< /Ве

° г

Секачи (Рожь Харьковская 55) 1720

Проламин тритикале (Амфидиплоид 3/5) 1710

Авенин (Овес Скакун) 1730

Кафирин (Сорго Судзерн 62),1712

1660 0,23

1660 0,34

1650 0,39

1656 0,51

Т а б л и ц а 3 Г см, см Dg/Dg

Генотип кукурузы

17 мина исследуемых и стандартных сортообразцов злаковых культур и опреде ление модификационных изменений белка по оптическому параметру, о тл и ч а ю шийся тем, что, с це:лью упрощения и ускорения анализа, в качестве оптического параметра исследуют инфракрасный спектр проламина в области 1550-1850 см определяют значения оптических плотностей

w64A +/+

М64А о2/о2

М64А su2/su2

М64А o7/о2 su2/su2

А 619 +/+

А 619 о2/о2

А 619 su2/su2

А 619 о2/o2 зи2/su2 в,максимумах, находят отношение значения оптической плотности а максимуме при 1710-1730 см"< к значению оптической плотности в максимуме при 1650-1660 см"1и по возрастанию данного отношения у исследуемых сортообразцов по сравнению со стандартными выявляют повышение степени модификационных изменений.

1725 1656 0,21

1724 1656 0,40

1725 . 1656 0,12

1725 1656 0,13

1720 . . 1656 0,22

1720 1656 0,30

1720 1656 0.19

1730 1656 0,16 л

1739284

Составитель В.Феденко

Редактор A.Kîçîðèç Техред A,Кравчук Корректор СЛекмар

Заказ 1999

Тираж

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР!

13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101