Способ получения полипептида, обладающего активностью фактора некроза опухоли человека

 

Изобретение относится к способу получения полипептида со свойствами человеческого фактора некроза опухоли (ФНО). Способ получения ФИО предполагает культивирование штаммов бактерий Escherichia coli, трансформированных рекомбинантными плазмидными ДНК рНТТ 26, или pHTR91, или PHTS115, или PHTS37, или рНТКРЗ, или рНТКШ, кодирующими ФНО в LB бу льоне, модифицированной М-9 среде или TG среде,выделяют продукт, а потом очищают его путем нанесения на колонку с ДЕАЕ-сефарозой с обессоливанием, ультрафильтрацией, изоэлектрофокусирующим гель-электрофорезом с после- -дующей ультрафильтрацией и гельфильтрацией на колонке с Био-гелем.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4202871 /13 (62) 3869300/13 (22) 06.06я87 (23) 05.03.85 (46) 07.06.92. Бюл. hФ 2 1 (71) Дайниппон Фармасьютикал Ко., Лтд (,УР) (72) Иосааки Ямада, Ясуджи Фурутани, Иицие Нотаке, Юнити Ямагиси (JP) (53) 575.224.2; 577.2!048) (088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА, ОБЛАДАЮЩЕГО АКТИВНОСТЬЮ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к способу получения полипептида со свойствами

Изобретение относится к способу получения полипептида со свойствами человеческого фактора некроза опухоли, который может быть использован, в качестве противоопухолевых агентов, так как обладает селективной цитотоксической активностью по отношению

К опухолевым клеткам и регрессирует„. опухоли у животных.

Пример 1.

1. Получение и-РНК ФНО из человеческих альвеолярных макрофагов.

Человеческие альвеолярные макрофаги собирают бронхоальвеолярным промыванием с помощью фасфатно-солового .,буфера. Альвеолярные макрофаги, 6,3х

ИО клеток, суспендируют в среде

КРИ1-1640, содержащей 107 эмбриональ„., ЯХ„„1739855 А3 (51)5 С 12 N. l5/28

2 человеческого фактора некроза опухо ли (ФНО). Способ получения ФНО пред полагает культивирование штаммов бактерий Escherichia co1i, трансформированных рекомбинантными плазмидными

ДНК рНТТ 26, или рНТБ91, или PHTS115, нли РНТБЗ?, или pHTRP3, или pHTRDH, кодирующими ФНО в ЬВ бульоне, модифицированной И-9 среде или

TG среде, выделяют продукт, а потом очищают его путем нанесения. на колонку с ДЕАЕ-сефарозой с обессоливанием, ультрафильтрацией, изоэлектрофокусирующим гель-электрофорезом с последующей ультрафильтрацией и гельфильтрацией на колонке с Био-гелем. ной бычьей сыворотки, и высевают в чашки Петри (диаметром 8 cM) при концентрации 9д10 клеток на чашку. Их предварительно культивируют при 37 С во влажной атмосфере, содержащей 5X, (ф3 углекислого газа. Через 1 ч культи- б ф вирования эндотоксин. (липополисаха- ©© рид, полученный из Е.со1з.), TPA (фор- (Л бол-1-мнристат-13-ацетат) и цикло-, (Л гекаимид ингибитор синтеза белка) добавляют до нонцантрацнй соотвитст-, ), венно 10 мкг/мл, 10 нг/мл и 1 мкг/мл

После этого культивирование продолжают 4, 0 - 4,5 ч (общее время 5,05,4 ч). Культуральную среду удаляют и макрофаги лизируют и гомогенизируют в 5 ?1 гуанидилтиоцианатном растворе, содержащем 0,6X N-лауроилсаркозината натрия и 6 мИ нитрата натрия.3

173

Гомогенат центрифугируют в градиенте хлористого цезия, содержащем О, 1 М

ЗДТА. Осадок растворяют в небольшом 1 количестве 7 М раствора мочевины, содержащего 0,35 М ИаСЮ20 мм трисНС1 (рН 7,4) и 20 мм ЗДТА, и осаждают этанолом. Получают 159 мкг общей

РНК °

Фракцию общей PHK растворяют в .f мп 10 мИ трис-НС1 (рН 7,4) буфера, содержащего 1 мМ ЭДТА (ТЭ-раствор), и прогревают при 65 С в течение о

5 мин. Добавляют раствор хлористого натрия до концентрации.0,5 И и раствор наносят на колонку с олиго(дТ)-, целлюлозой, предварительно уравновешенной ТЭ-раствором« содержащим

0«5 М хлористый натрий. Поли(А)-и-РНК элюируют из колонки с помощью ТЭраствора и получают 8 мкг PHK.

Поли(А)-и-РНК растворяют в концентрации 1,9 нг/мл в дистиллированной воде и раствор инъецируют в ооциты Xenvpus laevis в дозе приблизи» тельно 50 мп на аоцит. Десять ооцитов инкубируют в 100 мкл среды Barth при 22 С в течение 24 ч. Ооциты гомогенизируют и центрифугируют при .10000 об/мнн в течение 10 мнн. Сус" пернатант подвергают анализу на ФНО-.. активность определением цитотоксической активности ho отношению к клеткам

L-929 мыши.

Для этого образец (О, 1 мп) серийно разбавляют указанной ниже средой и в каждую лунку 96-луночного планшета прибавляют О, 1 мл суспензии клеток

Т -929 (5 х10 клеток/мл), содержащей актиномиции D (2 мкг/мп). Используют минимальную питательную среду Eagle, содержащую 1Х эмбриональной бычьей сыворотки, Пластинку инкубируют при

38,5 С в течение 18 ч во влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа.

Определение числа жизнеспособных клеток L-929 м оценку биологической активности проводят следующим образом. После инкубирования прибавляют

20 мкл 25Х-ного глутаральдегида для фиксирования жизнеспособных клеток, затем промывают и сушат. После этого для окрашивания фиксированных клеток прибавляют О, 1 мл 0,05Х-ного раствора метиленового голубого. Избыток мети-.

-ленового голубого отмывают и пластинки сушат. Метиленовый голубой, связавшийся с фиксированными клетками

55 дЦТФ, 0,9 ед. рибонуклеазы Hg.coli

23 ед. ДНК-полимеразы XE.culi, и ййкубируют при l2 С в течение 60 мин, «о а затеи еще в течение 60 мин при.22 С для синтеза к-ДНК. Реакцию останавливают прибавлением ЭДТА, экстрагируют

9855 элюируют 200 мкл 0,36 н.НС1 и измеряют его поглощение при 665 нм.

Поглощение пропорционально числу жизнеспособных клеток. Концентрация. требуемая для умерщвления 50Х клеток

L-N, приравнивается к 1 ед. активности/мп. Цитотоксическую активность по отношению к клеткам L-N, определенную в укаэанных выше условиях, выражают

„,как единицы (LN) для того, чтобы отличать от цитокснческой активности по отношению к мышиным клеткам L-929— клеткам-мишеням.

Супернатант, полученный выше, обладает цитотоксической активностью

6,6 ед. (L-929)/мл. Это указывает на то, что образец поли(А)-и-РНК содер- . жит и PHK ФНО.

20 2. Синтез к-ДНК.

Комплементарную ДНК синтезируют с использованием полученной н разделе 1 поли(А)-и-РНК в качестве мат.рицы.

25"

6 мкг поли(А)-и-PHK растворяют в.

40 мкл буфера 50 мМ трис-НС1 (рН 8,3), содержащего 10 мМ NgCl « 10 мМ дитиотреитола, 4 мИ пирофосфата натрия, 1

30 f«25 Mtl каждого из трех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов дГТФ, дАТФ и дТТФ, 0,5 мМ дЦТФ, 167 нИ альфа- РдЦТФ (удельная радиоактивность

3000 Ки/ммоль), 4 мкг олиго(дТ) и 120 ед. обратной транскриптазы, 35 полученной из вируса птичьего миелоа о бластоза (ВПИ), и инкубируют при 43 С в течение 30 мин. После этого реакцию останавливают прибавлением ЭДТА.

О Реакционную смесь экстрагируют смесью фенол/хлороформ (1: 1) и к водной фазе прибавляют ацетат аммония до концентрации 2,5 Н. Гибрид к-ДНК-и-РНК выделяют из водной фазы осаждением

4$ этанолом. Осадок гидрида к-ДНК-и-РНК растворяют в 100 мкл 20 мИ буфера трис-НСl (рН 7,5), содержащего 5 мИ

ИяС1 « 10 мИ сульфата аммония, 100 мМ хлористого калия, О, 15 мИ бетаникотинамидадениндинуклеотида« 5 мкг бычье го сывороточного альбумина, 0,04 мМ каждого из четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов дГТФ, дАТФ, дТТФ и

1739855 смесью 4енол/хлороформ и выделяют осаждением этанолом.

3. Получение к-ДНК с олиго (дЦ)окончанием. к-ДНК, полученную выше, растворяют в 100 мМ буферного раствора какодилата натрия (рИ 7,2), содержащего 2 MN

СаС1, 0,2 мМ дитиотреитола, О, 1 мМ альфа- P-дЦТФ (удельная радиоактив-.

З ность 3 Ки/ммоль), 10 ед. терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы, и о инкубируют при 37 С в течение 30 мин.

Реакцию останавливают прибавлением

ЭДТА, к-ДНК экстрагируют смесь фенол/

/хлороформ и осаждают этанолом. к-ДНК, оканчивающуюся олиго(дЦ), растворяют в 10 мМ буфере трис-НС1 (рП 7,4), содержащем 1 мМ ЭДТА и

100 мМ хлористого натрия, до концентрации к-ДНК,. оканчивающейся олиго(дЦ), равной 2 мкг/мл.

4. Получение ДНК pBR322, оканчивающейся олиго(дГ). 10 мкг ДНК pBR322 растворяют в

100 мкл 20 мМ буфера трис-НС1 (рН

7,4), содержащего 10 MM хлористого магния, 50 мМ сульфата аммония, 10 мкг бычьего сывороточного альбумина, и прибавляют 15 ед. рестрикционной зндонуклеазы Papal. Смесь инкубируют при 37 С в течение 1 ч, экстрагируют смесью фенол/хлороформ и выделяют ДНК из водной фазы осаждением этанолом. Полученную ДНК растворяют в 200 мкл такого же буферного раствора, который был использован для присоединения к окончанию к-ДНК (за исключением того, что он содержит

80 ед. терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы и Н-дГТФ вместо Р-дЦТФ), и инкубируют при 37 С в течение 20 мин, осуществляя присоединение нриблизительно 10 — 15 остатков дезоксигуаниловой кислоты (дГ) к

3 -окончанию. Реакционную смесь экст рагируют смесью фенол/хлороформ и

ДНК pBR322 оканчивающуюся олиго(дГ), выделяют из водной фазы осаждением этанолом. Результирующую ДНК pBR322 с присоединенными окончаниями растворяют в том же буфере, который был использован для растворения олиго(дЦ)концевой к-ДНК таким образом, чтобы результирующая концентрация ДНК pBR322 с присоединенными окончаниями была равна 20 мкг/мл.

5. Конструирование рекомбинатных .плиз мид .

120 мкл раствора олиго (дЦ) -конце вой к-ДНК смешивают с равным объемом раствора олиго(дГ)-концевой ДНК

pBR322, инкубируют при 65 С в течение

5 мин и при 57 С в течение 120 мин для достижения ренатурации.

6. Отбор организмов-хозяев.

Полученными плазмидами трансфорMHp7IOT клетки HITBMMa E.culi Х 1776, культивируют при 37 С в 20 мл L-бульона (состав: 10 r триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого натрия и 1г глюкозы на 1 л, рН 7,2), . содержащего 100 мкг/мл диаминопимелиновой кислоты и 40 мкг/мл тимидина, до тех пор, пока мутность, измеряемая при

600 нм, не достигнет О, 5. Клетки собирают о . центрифугированием при 4, С, промывают

10 мл 10 мМ буфера трис-ИС1 (рН 7,3), содержащего 50 мМ хлористого кальция.

Клетки снова суспендируют в 2 мл того же буферного. раствора и инкубируют при О С в течение 5 мин. К 0,2 мл суспензии прибавляют О, 1 мл раствора

1 рекомбинантных плазмид полученного вью ше, инкубируют при 0 С в течение

15 мин, выдерживают при 42 С в течение 2 мин, добавляют 0,5 мл Ь-бульона с добавками и культивируют при встряхивании в течение 1 ч. Отбирают аликвоту культуры, наносят на пластинку агара с L-бульном, содержащим добавки и тетрациклин. в концентрации

15 мкг/мл, и культивируют при 37 С в

35 течение 12 ч. Набор к-ДНК получают отбором трансформированных клеток, устойчивых к тетрациклину.

7. Кодирование к-ДНК человеческого

ФНО.

Трансформированные клетки, вклюI чающие в себя рекомбинантные плазмиды, содержащие к-ДНК, кодирующую полипептид человеческого ФНО, отбирают гибридиэационным анализом. к-ДНК, кодирующую кроличий ФНО, выделяют из рекомбинантной плазмиды

pRTNF802 (как показано в справочном примере 7), расщепляют эндонуклеаэой

Ava I или Нае II,.фрагменты ДНК выделяют осаждением этанолом и электрофорезом в полиакриламидном геле.

Фрагмент ДНК (299 п.о), соответствующий основаниям от 285 до 583, по. — . лучают расщеплением эндонуклеазой

Ava I (Ача Х-фрагмент).

Другой фрагмент ДНК (88 п.о), соответствующий основаниям от 33 до

120, получают расщеплением зндонук7 .

7 173 леазой Hae ll (Нае II-фрагмент).

Ava I-фрагмент и Hae II-фрагмент меэг тят радиоактивной меткой Ро Эти меченые фрагменты ДНК используют в качестве пробы для проверки набора к-ДНК и отбора трансформированных клеток, имеющих плаэмиду, содержащую к-ДНК, кодирующую полипептид человеческого ФНО.

С использованием P-меченого

32

Ача Х-фрагмента в качестве пробы при

Первом отборе из 20000 клонов:и отбирают 43 клона. Эти 43 выбранных клона подвергают второму отбору с использованием P-меченого Hae IIфрагмента и отбирают 6 клонов, имеющих сильные гибридизационные сигналы на оба фрагмента к-ДНК ФНО кролика.

8. Экспрессия .

ДНК. выделяют иэ б клонов, отобранных в разделе 7, а именно плазмиды рНТМР1, pHTNF4 pHTNF5, pHTNF13,.

pHTNF22 и pHTNF26. Каждую нз рекомбинатных плазмид вводят в клетки Е.coli

НВ101, культивируют в 50 мл L3-бульона (состав: 10 r триптона, 5 r дрожжевого экстракта и 10 r хлористого натрия на 1 л, рН 7,5) до тех пор, пока мутность культуры, измеряемая при 600 нм, не достигнет 0,8. После этого собирают приблизительно (3-5)Х к10" клеток, суспендируют в 1 мл

50 мМ буфера трис-HC1 (pH.8,0), со-. держащего О, 15 лизоцима и 30 мМ NaC1.

После инкубации в течение 30 мин в . ледяной воде клетки подвергают лизису шестикратным замораживанием-размора" живанием. Клеточные остатки удаляют центрифугированием и получают прос-.. ветленный лиэат. Лизат, полученный из каждого трансформированного организма, подвергают анализу на цитотоксическую активность по отношению к клеткам 1-929.

Лизат, полученный из трансформированного организма, содержащего плазмиду pHTNF13, имеет цитотоксическую активность 186,1 ед. (1-929)/мл.

9. Определение последовательности оснований в клонированной к-ДНК.

Рекомбннантнуюплаэмиду рНТЖ13 выделяют так, как описано выше. Плаз мтщную ДНК расщепляют с помощью эндонуклеаэы Рзс I, клонируют к-ДНК .

После этог фрагмент клонированной к-ДНК расщепляют различными рестрикционными эндонуклеазами. и последовательности оснований результирующих 16

9855 8 фрагментов определяют по методике

Махас-Gilbert, Участок, кодирующий полип птид человеческого ФНО, определен на основе гемологичности к последовательности. оснований, кодирующей кроличий ФНО.

ДНК, кодирующая полипептид человеческого ФНО, кодирует его полипептид-предшественник, состоящий из 233 аминокислотных остатков. Полный поли-, пептид человеческого ФНО представляет собой полипептид, соответствующий 155 аминокислотным остаткам от С-конца его предшественника, который кодируется последовательностью оснований от

Р.235 до h» 699. Последний кодон, кодирующий полипептид человеческого ФНО, представляет собой кодон TGA;

10..Иммунологические свойства полипептида человеческого ФНО.

Иммунологическую перекрестную реакционную способность полипептида человеческого ФНО лизата.определяют с помощью антитела против кроличьего .. плазменного ФНО следующим образом.

Лиэат смешивают с равным объемом разбавленного в 100 раз очищенного .антитела против кроличьего плазменно,го ФНО, полученного в справочном примере. После инкубировання при 37 ® в течение 2 ч цитотоксическую активность реакционной смеси измеряют по методике, описанной выше, с использованием клеток Ь-929 в качестве кле35 ток-мишеней. Кроличий плазменный ФНО, полученный в справочном примере, предварительно разбавляют фосфатным солевым буфером и разбавленный раствор испапьзуют в качестве контрольного образца ФНО. Цитотоксическая актив-.. ность полипептида человеческого ФНО не нейтрализуется антителом.

Пример 2. Получение полипег < тида человеческого ФНО в Escherichia

coli.

1. Экспрессия под контролем промо" тора tacк-ДНК выделяют из рекомбинантной

M плазмиды pHTNF13 так, как указано в примере 1, расщепляют с помощью эндонуклеаэы. Есо RI для отщепления части некодирующего участка ниже участка, кодирующего ФНО. Результи>> рующий Фрагмент ДНК (приблизительно

1, 1 к.д.о.) вводят в больший фрагмент

ДНК плазмиды pBR322 по сантам Pat I и Eco RI и конструируют рекомбинантную плазмиду, включающую в себя к-ДНК

9 17

ФНО и ген устойчивости к тетрациклину (плазмида рНТ113).

Экспрессивная плазмида рНТТ26 кодирует полный полипептид человеческого ФНО. к-ДНК, выделенную из рНТ113, расщепляют эндонуклеазами Ava I u Hind

III и фрагмент ДНК размером 578 п.о., включающий большую часть участка, кодирующего полный полипептид человеческого.ФНО (называемый ЧФНО-фрагмент), выделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

Фрагмент ДНК, содержащий промотор .tac, выделяют из плазмиды pDR 540/Р-1 растворением в 2 мл 0,10 мМ буфера трис-НС1 (рН 7,5), содержащего 50 мМ

NaC1, 6 MN NgClz и 6 мМ 2-меркапто.— . этанола, и расщеплением эндонуклеазами EcuRI и Ватп Н1 при 37 С в течение 60 мин После добавления хлористого натрия до результирующей концентрации 0,3 M отщепленные фрагменты

ДНК осаждают этанолом. Фрагмент ДНК, содержащий промотор tac выделяют электрофорезом в полиакриламидном ге.— ле с выходом 8,3 мкг.

Фрагмент промотора tac связывают с химически синтезированным олигодезоксирибонуклеотидным адаптором, прецставленными следующей формулой:

5 -GATCCATGTCATCTTCTCGAACC

3 -GTACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT

Этот адаптор включает инициирующий кодон ATG и последовательность оснований, соответствующую 5 -концевой части последовательности оснований, кодирующей полный полипептид человеческого ФНО, и имеет Bam EII- u Ava. Iкогезивные концы. Результирующий фрагмент ДНК называют tac-промоторадапторным фрагментом.

Отдельно больший фрагмент ДНК (размером 4,3 т.п.о.), включающий ген устойчивости к ампициллину (фрагмент pBR322-Амп ) вырезают из плазмиды

pBR322 расщеплением эндонуклеазами

Hind III и Есо RI, и выделяют гельэлектрофорезом в 0,7 -ном агарозе с низкотемпературным размягчением. мкг ЧФНО-фрагмента и 6 мкг фрагмента pBR322-Амп растворяют в 66 мМ 3 буфере трис-ПС1 (рН 7,6),. содержащем 6,6 мМ хлористого магния инкубио

Э руют при 55 С в течение 10 мин, прибавляют АТФ и дитиотреитол соответственно до концентрации 1 и 10 мМ и

168 ед. Т ДНК-лигазы и смесь инкуби39855

10 руют при 22ОС в течение 1?О мий. Результирующий фрагмент ДНК выделяют экстракцией фенолом. Получают приблизительно 4 мкг ДНК. Фрагмент ДНК (0,8 мкг) связывают с tac-промоторадапторным фрагментом {0,3 мкг) в тех же условиях, как описано выше, за исключением того, что используют

63 ед. Т+ДНК-лигазы. Реакционную смесь разбавляют в 6 раз дистиллированной водой и смешивают с равным объемом суспензии клеток Е.соli ХМ103, обработанных кальцием. Смесь последовательно инкубируют в ледяной воде в течение 20 мин, при 42 С в течение

1 мин и при комнатной температуре в течение 10 мин, прибавляют бульон о

LB встряхивают при 37 С в течение

20 60 мин. Аликвоту результирующей клеточной суспензии наносят на LB-агаровые пластинки, содержащие ампициллин в концентрации 25 мкг/мл, и культивируют в течение ночи при 37 С. От25 бирают колонии, устойчивые к ампициллину.

Один из трансформированных организмов, способный вырабатывать поли-. пептид человеческого ФНО, называют

ХМ103/рНТТ26.

Обработанные кальцием клетки Е.со1

IN103 получают следующим образом.

Клетки Е.coli 1М103 высевают в ЬВ бульон и культивируют при. 37 С в течение ночи. 1 мл результирующей культуры высевают в 100 мл LB-бульона и о дополнительно культивируют при 37 С до тех пор, пока мутность культуры, определяемая при 650 нм, не достигнет

0,6. После инкубации в течение 30 мин

40 в ледяной воде клетки собирают центрифугированием и суспендируют в 50 мл

50 мИ раствора хлористого кальция, выдерживают при ООС в течение 60 мин, собирают центрифугированием и снова

45 суспендируют в 10 мл 50 MN раствора хлористого .кальция, содержащего 20Х глицерина. Эту суспензию используют в качестве обработанной кальцием суспензии клеток Е.coli IN103.

Трансформированный организм

П1103/рНТТ26 культивируют в течение ночи в бульоне LB при 37 С. Культуру (0,5 мл) высевают в 5 мл свежего бу55 льона LB, культивируют при 37 С в течение 1 ч, прибавляют изопропилбета-В-тиогалактозид до концентрации

1 мМ и -культивирование продолжают еще в течение 4 ч. Клетки собирают

1739855 нуклеазами Нра I и Есо RI и получают фрагмент ДНК (размером 4 т.п.о.), включающий участок промотора phos u последовательность Shine-Dalgarno, последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид, N-концевую часть фосфатсвязывающего белка, а также ген устойчивости к тетрациклину.

AGC!

Этот фрагмент ДНК обозначают как фрагмент Нра I — Eco RI. Фрагмент ,Нра I - Есо RI связывают с химически синтезированным олигодезоксирибонук0 леотидом-свяэывателем, имеющим сле-.. дующую последовательность: .5-СССССАТССССО

3 -GGGCCTAGGCCC

После этого связанный фрагмент ДНК расщепляют рестрикционной вндонуклеазой Ваш HI- Результирующий фрагмент ДНК (приблизительно 3,6 т. п.о.), имеющий когезивные концы и суспендируют в 1 мл 50 MN буфера трис-НС1 (рН 8,0), содержащего О, 1Ж лизоцима.и 30 мМ ИаС1, и оставляют стоять при О С в течение 30 мин. Пос-, ле этого шесть раз повторяют замораживание в смеси сухой лед/этанол и размораживание при 37 С, клеточO ные остатки удаляют центрифугированием и получают просветленный лизат.

Лизат имеет цитотоксическую активность, равную 99000 ед. (L-929)/

/мл, которая не нейтрализуется антителом против кроличьего ФНО. Это подтверждает тот факт, что полипептид человеческого ФНО иммунологически не пересекается с кроличьим ФНО.

2. Экспрессия под контролем промотора trp, Рекомбинантную плазмиду рНТ113 гид" 2О ролизуют эндонуклеазами Ача I u Sal I для расщепления на 3 фрагмента (размерами О, 8, 1, 3 — 2, 6 к.п.о. ) . Фрагмент 1, 3 к. п.о. -ДНК, включающий в себя большую часть участка, .кодирующего полный полипептид человеческого ФНО и часть гена устойчивости к тетрациклину,,выделяют (обозначают Ача ХSal Х-фрагмент). Ava Х- Sal I-фрагмент связывают со следующим химически синтезированным олигодезоксирибонуклеотидным адаптором. Этот адаптор обозначают как адаптор I:

5 -CGATATGTCATCTTCTCGAACC

3 -TATACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT

Результирующий фрагмент ДНК обоз- 35 начают как ЧФНО-адапторный фрагмент.

Отдельно фрагмент ДНК (35 -п.о.), включающий в себя часть участка промотора rrp отрезают от. плазмиды

pDR720/Ð-Х расщеплением эндонуклеазами Есо RI и Нра Х, и фрагмент ДНК связывают с химически синтезированным адаптором, имеющим следующую формулу;

5 - ААСТАСТАСССААСТТСАССТАААААСССТАА

3 -TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTTTTCCCATT

Связанный фрагмент ДНК обозначают как фрагмент промотора trp.

Йлазмиду рВК322 расщепляют эндо нуклеазами Есо RI u Sal I, выделяют больший фрагмент ДНК (размером 3,7 т.п.о.). Последовательным. связыванием этих трех фрагментов ДНК, фрагмента

ЧФНО-адаптора, фрагмента промотора сгр и большего фрагмента-pBR322.:. конструируют экспрессивную плазмнду

pHTR91. Экспрессивную плазмиду вводят в клетки Е.coli НВ101 способом, описанным в разделе..1, и один из трансформированных организмов называют НВ101/pHTR91.

Трансформированный организм

НВ101/рНТК91 культивируют в течение ночи при 37 С в модифицированной среде И-9 (состав: 0,77 NazHPO+, 12_#_ Н О, О,ЗЖ KH

ИдБ04, О, 1 мМ СаС1 и 0,57 глюкозы).

Культуру (0,05 мл) высевают в 5 мл той же среды и культивируют при 370С в течение 1 ч, прибавляют 3-бетаиндолакриловую кислоту до концентрации 20 мкг/мл, культивируют в течение 4 ч. Клетки собирают, обрабатывают по методике, описанной в разде-. ле 1, и получают просветленный лизат.

Лизат имеет цитотоксическую активность 1,01х10 ед. (L-929) /мл.

3. Экспрессия под контролем промотора phos, Фрагмент Ача,Х- Sal I, полученный в разделе 2, связывают .с химически синтезированным олигодезоксирибонуклеотидным адаптором, имеющим следующую последовательцость:

5 -GATCCATGTCATCTTCTCGAACC

3 -GTACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT

Связанный фрагмент ДНК расщепляют эндонуклеазой Bam HI и получают фрагмент ДНК, имеющий на обоих окончаниях когезивные концы Ваш НХ (фрагмент

ЧФНО-Тет . Ваш НХ).

Отдельно в плазмиду pSN5182, со; держащую ген phns, расщепляют эндо13

14

1739855

Bam HI в обоих окончаниях, обозначают как phos — Ваш HI.Тет

Фрагмент ЧФНО-Тет, Bam HI связыУ вают с фрагментом промотор phos

Ваш 1П.Тет и конструируют экспрессивную плазмиду для получения поли-. пептида человеческого ФНО, связанного со связывающим фосфат белком, которую называют pHTS115, Экспрессивную плазмиду вводят в Е.coli HB101 по описанной методике.

Один из трансформированных организмов (HB101/рHTS115) культивируют в 5 мл среды TG (состав: 120 мМ.буфер трис-НС1 (рН 7,4), 0,27. глюкозы, 80 мМ Na01, 20 мМ КС1, 20 мМ NH+Cl, 3 мМ Ha SO@,1 мИ NgC1<, 0,2 MN СаС1, 200 мМ ЕеС1, 20 мг/л лейцина, 20 мг/л пролина и 10 мг/л витамина

В1), в которой присутствует КН РО в концентрации 0,64 мМ, при 37 С в течение 20 ч при встряхивании. Клетки собирают центрифугированием, суспендируют в 2 мл среды TG, содержащей КН РО в концентрации 0,064 мМ, культивируют при 37 С в течение 6 ч, центрифугируют и промывают 1 мл 10 мМ буфера трис-НС1 (рН 7,2), содержащего 30 MN NaC1. После этого их снова суспендируют в 0,2 мл 33 мМ буфера трис-НС1 (рН 7,2) и смешивают с равным объемом 33 мМ буфера трис-HCl (рН 7,2), содержащего 0,1 мМ ЭДТА и

403 сахарозы, инкубируют при 37 C в течение 10 мин, клетки собирают, снова суспендируют в 0,4 мл охлажденного

0,5 мМ раствора Г1яС1 и оставляют стоять в ледяной воде в течение

10 мин при.периодическом встряхивании. Клеточные остатки удаляют центрифугированием и получают просветленный: экстракт (далее обозначается как периплазмический экстракт), Периплазмический экстракт имеет цитотоксическую активность 1,34х10 ед. (L-929)/мл.

Мол.м. полипептида, имеющего цитотоксическую активность, определенная электрофорезом вполиакриламидном геле (12,5Х) с додецилсульфатом натрия, равна 19000 дальтон, и это свидетельствует о том, что полипептид получается в виде соединенного белка.

4. Экспрессия под контролем промотора phos °

Рекомбинантную плазмидную ДНКpHTNP13 расщепляют эндонуклеазой Рзс 1 для вырезывания фрагмента ДНК (приблизительно 1,2 т.п.о,), вкпючающегv

ДНК человеческого ФНО. Фрагмент ДНК

ДНК человеческогоФНО. ФрагментДНК расщепляют эндонуклеазой Bbe I и получают фрагмент ДНК (приблизительно

О, 9 т. и. о. (далее обозначается как фрагмент ВЬе Т вЂ” Ряс Х). 6 мкг фрагмента Bbe I — Pst I растворяют в

10 80 мкл 20 MN буфера трис-llC1 (рН

8,0), содержащего 12 мИ СаС1, 12 мМ

NgC1<, 0,2 M NaC1, 1 мМ ЭДТА и 0,02 ед. экзонуклеазы Bal 31, инкубируют при 300 С в течение 30 мин для от0

l5 щепления приблизительно 50 — !50 пар оснований с каждого конца фрагмента

ДНК. Затем концы фрагмента снова нао ращивают инкубированием при 37 С в течение 60 мин с 10 ед. ДНК-полимеразы I Е.culi (большой фрагмент) в присутствии каждого из четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов дГТФ, дАТФ, дЦТФ и дТТФ, взятых в концентрации 0,1 мМ, и 50 мКг/мл бычьего сывороточного альбумина. Полученный фрагмент ДНК расщепляют эндонуклеазой„Есо RI и результирующий фрагмент

ДНК (приблизительно 750 п.о.), имею»щий тупой конец и Есо RI — липкий

30 конец, выделяют (обозначают как Bal

31-Eco RI-фрагмент) .

Bal 31-Eco RI-фрагмент связывают с фрагментом Нра I-Eco RI (приблизительно 4 т.п.о.), полученным из pSN

5182 так, как описано в разделе 3, и конструируют плазмиду, содержащую участок промотора phos последовательность Shine — Dalgano, последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид и N-концевую часть фосфатсвязывающего белка, последовательность ДНК, кодирующую полный полипептид человеческого ФНО и часть его полипептида-предшественника.

Плазмиду называют pHTS 37 и вводят ее в Е.coli HB101 с получением трансформанта HB101/pHTS 37. Трансформированный организм НВ101/pHTS 37 культивируют и периплазмический экст50 ракт получают в условиях, описанных в разделе 3.

Полученный периплазмический экстракт имеет цитотоксическую активность, равную 4,93х10 ед. (L-929)/

Ы

Экстракт подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле (12,5 ) с додецилсульфатом натрия. Электрофорез проводят при 35 В в течение 12 ч с

15 173 использованием трис-глицинового (рН

8, 3) буфера, содержащего О, 1Х додецильсульфата натрия. Белок окрашивают

Кумасси бриллиантовым голубым. Две поцосы белка, не наблюдавшиеся в экстракте Е.coli HB101, наблюдаются в положениях, соответствующих 22000 и 16500 дальтон. Гель нарезают на кусочки шириной 2 мм и каждый ку/ сочек геля инкубируют в минимальной питательной среде Eagle, содержащей

1 зародышевой бычьей.. сыворотки, при 4 С в течение ночи, для элюирования белка из геля. Элюат используют для определения цитотоксической активности по отношению к мышиным клеткам Ь-929. В результате устанавливают, что сильная цитотоксическая активность наблюдается в элюате, соответствующем белку с мол.м.

16500 дальтон.

Исходя из структуры экспрессивной плазмиды рНТБ 37 делают вывод о том, -что полипептид человеческого ФНО, полученный в трансформированном организме, представляет собой слитый белок, включающий часть фосфатсвязывающего белка и полипептид человеческого ФНО с частью его предшественника. Теоретическая мол.м. слитого белка рассчитана и равна приблизительно 23000 дальтон. С другой стороны, мол.м. полного полипептида человеческого ФНО равна 17097 дальтон.

Это исследование свидетельствует о том, что получаемый слитый белок может быть превращен в полный полипептид человеческого ФНО в клетке-х зяи-<. не путем ограниченного гидролиэа, возможно по специфическому участку (Arg-Ser), соединяющему полный полипентид человеческого ФНО с частью его предшественника..

Если периплазмический экстракт инкубировать с 5 мкг/мл трипсина при

37 С в течение 1 ч и реакционную смесь подвергнуть электрофорезу на полиакриламицном геле с додецилсульфатом натрия в описанных вьюне условиях, то наблюдается белковая полоса, соответствующая мол.м..около

2200 дальтон, которая может представлять собой слитый белок, исчезающий при расщеппяющем действии трипсина.

Пример 3. Получение модифи цированного полипептида человеческого ФНО.

Плазмиду рНТ1Ц1 4, .содержащую ДНК, кодирующую полипептид, получающийся в. результате отщепления четырех аминокислот из N-окончания полного поли5 пептида человеческого ФНО, конструируют таким же образом, как и экспрессивную плаэмиду pHTR 91 в примере 2 (2), за исключением того, что используют, следующий синтетический адаптор:

5 -CGATATGACC

3 - TATACTGGGGCT

Плазмиду рНТКР4 вводят в Е.coli

НВ101, трансформированный организм

0 культивируют в течение ночи при 37 С в модифицированной среде M-9, высева.ют в 5 мл той же среды, культивируют при 37 С в течение 1 ч, прибавляют

3-бета-индолакриловую кислоту до

20 концентрации 20 мкг/мл и культивирование продолжают в течение ночи.

Клетки собирают центрифугированием, обрабатывают по методике, описанной в примере 2 (1), и получают просвет25 ленный лизат.

Лизат имеет цитотоксическую активность 1, 1к10 ед. (Ь-929)/мп.

Пример 4.:Получение полипептида-предшественника человеческого

З0 ФНО в Escherichia coli.

Плазмиду pHTRP3, содержащую к-ДНК, кодирунлцую полипептид-предшественник. человеческого ФНО, конструируют следующим образом. к-ДНК выделяют из рекомбинантной плазмиды рНТ113 расщеплением эндонуклеазами Pst I u Hind

III ° Фрагмент к-ДНК затем дополнительно частично расщепляют эндонук.леазой Hgi АХ с получением фрагмента

ДНК (приблизительно 820 п.о.), включающего последовательность оснований, кодирующую большую часть полипептида-предшественника, Результирующий фрагмент ДНК. связывают с химически

45 синтезированным олигодезоксирибонуклеотидным фрагментом, имеющим следующую формулу:

5i -CGATATGAGCA

3 -TATAC

Связанный фрагмент ДНК называют фрагментом Pre-ФНО.

Отдельно фрагмент ДНК, содержащий часть. участка npoMmopa trp, вырезают из плазмиды pDR720 расщеплением эндонуклеазой Есо RI и Нра I, и фрагмент ДНК связывают со следующим химически синтезированным адаптором:

5 -AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAAT

3 -, ТТСАТСАТСССТТСААСТССАТТТТТСССАТТАСС

17 1739855

Результирующий фрагмент ДНК связывают с фрагментом Pre-ФНО и связанный фрагмент ДНК сшивают с фрагментом ДНК (приблизительно 4,3 т.п.о.), 5 имеющим ген устойчивости к ампициллину плазмиды pBR322.

Плазмиду рНТКРЗ конструируют по описанной методике, вводят .вЕ.coli

НВ101, культивируют в течение ночи при 37 С в модифицированной среде

И-9. Культуру (O П5 мл) высевают в

5 мл той же среды, культивируют при

37 С в течение 1 ч, прибавляют 3"бета-индолакриловую кислоту до концентрации 20 мкг/мл и культивирование продолжают в течение ночи. Клетки собирают центрифугированием, обрабатывают по методике, описанной в примере 2 (1) и получают просветленный лизат.

Лизат имеет цитотоксическую активность, равную 1 8 л10 ед. (L-929)/ мл °

Пример 5. Получение и очистка полипептида человеческого ФНО.

1. Получение.

Клетки Е.coli НВ101/рНТ 91, полученные в примере 2 .(2), используют для,получения полипептида человеческого ФНО. Для этого культивируют их в течение ночи при 37 С в бульоне LB, содержащем тетрациклин в концентрации

12,5 мкг/мл, высевают в 10 объемов модифицированной среды И-9, использованной в примере 2 (2), и культивио руют при 37 С в течение 1 ч. После прибавления 3-бета-индолакриловой кислоты до концентрации 20 мкг/мл культивирование продолжают в течение

4.ч. Клетки собирают, обрабатывают и получают просветленный лизат. Лизат используют для очистки полипептида человеческого ФНО.

2. Очистка полипептцца человечес кого ФНО. 45

1Ы

В колонку (5л20 см), набитую DEAE$ерЬагозе СЬ-6В (Pharmacia), предварительно уравновешенную 20 мМ буфером трис-HCl (рН 7,8), вводят 1030 мл лизата. Колонку промывают 3 л того же буфера, а затем элюируют линейным градиентом NaC1 от.О до 0,3 M в том же буфере со скоростью потока

133 мл/ч. Элюат фракционируют по фракциям 10 мл. Фракции, обладающие цитотоксической активностью, собирают и объединяют.

Выделение цитотоксической актив-. ности на этой стадии составляет 53Х, а удельная активность повышается приблизительно в 9 раз.

Соединенные активные фракции обесс олив ают и конце нтрируют до 1/1 0 объема ультрафильтрацией с использованием мембраны.

Концентрат подвергают препаративному изоэлектрофокусирующему гельэлектрофорезу. Апиквоту концентрата наносят на пластинку из полиакриламидного геля (0,2Ф10х10 см) с rpa15 диентом рН от 5,6 до 6, 1, созданным с помощью 1 ml obiline (1КВ). Электрофорез проводят при напряжении

2400 В в течение 16 ч при 15 С. Гель нарезают на куски шириной 10 мм и

20, белок элюируют с помощью 20 мИ буфера трис-НСl (рН 7,8). Описанную операцию повторяют. Элюаты, имеющие цитотоксическую активность, объединяют и концентрируют с помощью ультрафильтрации. Концентрат наносят на колонку (0,7х25 см) с ВхО"Gel Р-6(В10-:

RAD) и обессоливают. Результирующий обессоленный образец является однородным с точки зрения электрофоре30 тического анализа в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и его используют s качестве очищенного полипептида человеческого ФНО для проведения анализа.

Пример 6. Способ получения лиофипизованного полипептида человеческого ФНО.

Раствор очищенного полипептида человеческого ФНО,. полученный по

g0 ппрри ме рру 55, используют для получения лиофилизованного полипептида человеческого ФНО.

10 мл раствора очищенного полипептида человеческого ФНО, имеющего цитотоксическую активность 2,2i10 ед. (LM), смешивают с 0,1 объема SX

NaC1 содержащего 10Х человеческого сывороточного альбумина и 20X D-маннита. После доведения рН раствора до

6,8 раствор стерилизуют фильтрованием через мембрану (размер пор 0,2 мкм).

По 5 мл стерильного раствора помещают в стеклянные сосуды и лиофильно высушивают. Каждый сосуд содержит по

10 ед. (LM) очищенного полипептида человеческого ФНО.

Пример 7 (справочный). Получение к-ДИК кроличьего ФНО.

19 173

1. Получение и-РНК ФНО из кроличьих альвеолярных макрофагов.

Кроликам (вес приблизительно

2,5 кг) внутривенно вводят. мертвые сухие клетки Prop оп1Ъас car ium аспез в дозе 100 мг на кролика. Через 8 дней кроликов забивают. Легкие несколько раз промывают фосфатным солевым буфером через трубку, введенную в трахею животного, и собирают аль-. веолярные макрофаги. От 12 кроликов получают приблизительно 3) 10 альвеолярных макрофагов.

Альвеолярные макрофаги суспендируют в среде RPMI-1640, содержащей

10 эмбриональной бычьей сыворотки,. и высевают в чашки Петри (диаметром

8 cM) с плотностью 2 10 клеток на

7 чашку. Их предварительно культивируют при 37 С во влажной атмосфере, содержащей 5 двуокиси углерода.

После предварительного культивирования, проведенного в течение 1 ч, эндотоксин (липополисахарид, полученный из Е.coli), TPA (форбол-12-миристат-13-ацетат) и циклогексимид (ингпбитор синтеза белка) прибавляют до концентраций соответственно

10 мкг/мл, 10 нг/мл и 1 мкг/мл. Культивирование продолжают еще в течение

4,0 — 4,5 ч (общее время культивирования 5,0 — 5,5 ч), культуральную среду удаляют отсасыванием, макрофа и, адгезированные к чашкам, лизируют и гомогенизируют в 5 M раствора гуанидилцианата, содержащем О,б Нлауроилсакрозината натрия и 6 MM цитрата натрия. Гомогенизат выливают в

5,7 М раствор хлорида цезия, содержащий 0,1 М ЭДТА, и центрифугируют в течение 20 ч при 26500 об/мин с использованием ультрацентрифуги. Осадок растворяют в.небольшом количестве 7 М раствора мочевины, содержащего 0,35 М

ИаС1, 20 мМ трис-НСI (рН 7,4) и 20 мМ

ЭДТА, и выделяют осаждением этанолом.

От 12 кроликов получают 5,2 мг общей

PHK.

Фракцию общей РНК растворяют в

2 мл раствора ТЭ, использованного в примере 1 (1), и раствор нагревают о при 65 С в течение 5 мин. Добавляют раствор..NaCI до результирующей концентрации 0,5 М, наносят на колонку с олиго(дТ)-целлюлозой, предварительно уравновешенной ТЭ-раствором, содержащим 0,5 M NaC1. Поли(А)-и-РНК эчюируют с колонки ТЗ-раствором с

20 выходом 314 мкг. 200 мкг результирующей поли(А)-и-PHK подвергают злектрофорезу в 1 -ном агарозном геле в присутствии 6 М мочевины (рН 4) и фракционируют,на 7 фракций в соответствии с молекулярными размерами.

Поли(А)-и-РНК выделяют из каждого фракционированного геля, расплавляя его при 70 С в течение 10 мин, с о последующей экстракцией фенолом и хлороформом и осаждением этанолом.

Содержание и-PHK кроличьего ФНО в поли(А)-и-РНК, выделенной из каждой

15 фракции определяют и-PHK-трансляУ ционным анализом с использованием ооцитов Xenopus laevis.

Более высокую концентрацию и-PHK кроличьего ФНО выделяют из фракции, 2р соответствующей молекулярному размеру 1,6 — 2,7 т.п.о. (сокращенно называют обогащенной и-PHK кроличьего ФНО).

Фракцию, обогащенную и-РНК кроличьего ФНО, полученную таким образом, используют в последующих экспериментах.

2. Синтез к-ДНК. к-.ДНК синтезируют в следующих условиях. 4 мкг фракции, обогащенной и-РНК кроличьего ФНО, растворяют в

10 мкл 50 мМ буфера трис-НСI (рН

8,3), содержащего 10 мМ MgC12, 70 MM

КС1, 1 MM дитиотреитол, 0,5 мМ каждого из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов

35 дТТФ, дЦТФ, ДТФ и дГТФ (дСТФ åTaT

Р, удельная активность 4,4ЧО рас32. падов в минуту на 1 нмоль), 3 мкг олиго(дТ).f2 18 80 ед. обратной транскриптазы, полученной из вируса птичьего миелобластола, и инкубируют при 43 С в течение 50 мин. После о этого реакцию останавливают прибавлением ЭДТА. Результирующий гибрид

45 к-ДНК-и-РНК экстрагируют смесью фе-.. нол/хлороформ (1: 1) и выделяют из водной фазы осаждением этанолом. Матрицу и-РНК удаляют обработкой щелочью при 65 — 70 С. Синтетическую к-ДНК выделяют осаждением этанолом.

Осадок ДНК растворяют в 40 мкл

О, 1 М буфера Нерея (рН.6,9), содержащего каждый из четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов дАТФ, дТТФ, 55 дГТФ и дЦТФ в концентрации 0,5 мМ

70 мИ КС1, 5 мИ МяС12, 1,5 мМ 2-мер° t каптоэтанол и 8 ед. Е.со1 ДНК-полимеразы I (большой фрагмент) инкуо

Э бируют при 15 С в течение 20 ч для

21 17 синтеза к-ДНК. Реакцию останавливают прибавлением додецилсульфата натрия. к-ДНК экстрагируют смесью фенол/хло- . роформ и вьщеляют осаждением этанолом.

Результирующую к-ДНК растворяют в 100 мкл 50 мМ раствора ацетата натрия (рН 4,5), содержащего 1 MM ZnS04, 200 мИ НаС1, 0,57. глицерина и 0,5 ед. нуклеазы Sl и инкубируют при 37 С о в течение 20 мин для расщепления структуры. Реакцию останавливают прибавлением ЭДТА. Реакционную смесь экстрагируют смесью фенол/хлороформ, а затем диэтиловым эфиром . к-ДНК выделяют осаждением этанолом, 3. Получение олиго(дЦ)-концевой к-ДНК.

Полученную выше к-ДНК растворяют в 100 мкл буфера 130 MM какодилат натрия — 30 MM трис-НС1 (рН 6,8), содержащего 1 MM СоС1, О, 1 мМ дитиотреитол, О, 2 мкг поли(А), О, 1 мМ

Н-дЦТФ (удельная активность 5400 распадов в минуту на 1 пмоль) и 10 ед. концевой дезоксинуклеотидилтрансо феразы, инкубируют при 37 С в течение

20 мин для присоединения концов олиго(дЦ) к 3 -концам к-ДНК.

Ф

Реакцию останавливают добавлением

ЭДТА. Реакционную смесь экстрагируют смесью фенол/хлороформ и диэтиловым эфиром. Олиго(дЦ)-концевую к-ДНК выделяют осаждением этанолом. Олиго(дЦ)-концевую к-ДНК растворяют в

10 1ф1 буфере трис-НС1 (рН-7,4), содержащем 1 MN ЭДТА и 100 MM NaC1,,таким образом, чтобы концентрация олиго(дЦ)-.концевой к-ДНК была равна

0,2 мкг/мл. . 4. Получение олиго(дГ)-концевой .!

ДПК плазмиды pBR322.

pBR322 (10 мкг) растворяют в

100 мкл 20 MN буфера трис-НС1 (рН

7,4), содержащего 10 &i MgC ., 50 мм (БН ) 80,1 и 10 мкг бычьего сывороточного альбумина, и прибавляют 15 ед. эндонуклеазы Pst I. Смесь инкубируют при 37 C в течение 1 ч, экстрагируют о смесью фенол/хлороформ. ДНК выделяют из водной фазы осаждением этанолом, растворяют в 200 мкл того же буфера, который используют для присоединения к концам к-ДНК (за исклю. чением того, что он содержит 80 ед. концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы Н-дГТФ вместо Н-дЦТФ), и инкубируют пои 37 С в течение 20 мин для при39855 22 соединения к концу приблизительно 10—

15 остатков дГ. Реакционную смесь экстрагируют смесью фенол/хлороформ и оли5 го(ДГ)-концевую днк плазмиды pBR322 выделяют из водной фазы осаждением этано-. лом. Результирующую концевую плазмидную

ДНК растворяют в том же буфере, который использовался для растворения олиго(дЦ)-концевой к-ДНК таким образом, чтобы концентрация концевой плазмидной ДНК была равна 2 мкг/мл.

5. Конструирование рекомбинантной плаз миды .

50 мкл раствора олиго(дЦ)-концевой к-ДНК смешивают с 50 мкл раствора олиго(дГ)-концевой ДНК pBR322 и смесь последовательно инкубируют при

65 С в течение 1О мин, при 57 С в те20 чение 120 мин, при 45 С в течение

60 мин, при 35 С в течение 60 мин и при комнатной температуре в течение

60 мин для достижения связывания.

6. Отбор трансформированных ор25 ганиэ мов °

Штамм Е.coli Х 1776 трансформируют полученной выше рекомбинантной плазмидой. Для этого Е.coli К 1776 культивируют при 37 С в 20 мл бульона L содержащего 100 мкг/мл диаминопимелиновой кислоты и 40 мкг/мл тимидина, до тех пор, пока мутность, измеряемая при 600 нм, не достигнет 0,5.

Клетки собирают центрифугированием при О С и промывают 10 MN буфером о

35 трис-НС1 (рН 7,3), содержащим 50 MM

CaC1 . Клетки снова суснендируют в

2 мл того же буфера и инкубируют при о

О С, в течение 5 мин. К 0,2 мл сус пензии прибавляют 0,1 мл полученного выше раствора рекомбинантной плазмиды . У оставляют стоять при ОаС на 15 мин и затем выдерживают в течение 2 мин при о

42 С. После этого прибавляют 0 5 мл использованного выше бульона LB c

"5 добавками и культивируют в течение

1 ч. Отбирают аликвоту культуры, наносят ее на пластинку агара с содержащим добавки бульоном LB содержащую 15 мкг/мл тетрациклина, и культивируют при 37 С в течение приблио зительно 12 ч. Отбирают трансформированные организмы, устойчивые к тетрациклину, которые используют в качестве набора к-ДНК.

?. Гибридизационный анализ.

Анализ с помощью гибридизации ко-! лоний проводят с использованием Pэ2, меченой пробы к-ДНК, которая имеет

23 1739855

24 плазмиду, содержащую к-ДЙК, кодирующую кроличий ФНО. Пробы P-меченой к-ДНК синтезируют по методике, описанной в разделе 2 с использованием и-PHK полученной из индуктивных альвеолярных макрофагов по методике, описанной в разделе 1, за исключением тогп, что используют Р-дЦТФ с высокой удельной радиоактивностью. Отбирают колонии трансформированных opI анизмов.,Из 20000 колоний выбирают 50.

Затем 20 из выбранных 50 колоний подвергают и-PHK-гибридизационно-ретрансляционному анализу. Плазмидную

ДНК экстрагируют из каждого трансформированного организма и фиксируют на нитроцеллюлозных фильтрах после термической денатурации. К фильтру прибавляют полученную в разделе 1 фрак" цию поли(А)-и-РНК, содержащую кроличий ФНО, и инкубируют при 50 С в течение 3 ч для достижения гидридизации. Прогибридизовавшуюся и-РНК выделяют и вводят в ооциты для определения того, представляет ли собой. вьщеленная РН1(и-РНК кроличьего ФНО.

В результате этого обнаруживают три колонии, имеющие плазмиды, содержащие к-ДНК, сильно гибридизуемую с.иРИ(кроличьего ÔÍÎ. Фрагменты к-ДНК получают из плазмиды, содержащей к-ДНК наибольшего размера (около. 750 п,.о.), расщеплением с помощью рестрикционной эндонуклеазы Ddg I и используют в качестве пробы для дальнейшего отбора. Эти фрагменты ДНК метят З Р. Отбирают колонии трансформированных организмов, имеющих плазмиды, содержащие к-ДНК, сильно гибридизуемую мечеными пробами. В этом испытании положительный результат дают 98 из 60000 колоний. Выделяют рекомбинантную плазмидную ДНК и к-ДНК вырезают расщеплением эндонуклеазой

Pst I. Из размеры определяют электрофорезом в полиакриламидном геле. Отбирают 17 колоний трансформированных организмов, содержащих вставки к-ДНК размером не менее 1 т.п.о. Из трансформированного организма, содержащеб

ro K-ДНК наибольшего размера (трансформированный организм.Р Х 1776/

/pRTNF 802; плазмида N pRTNF 802), выделяют клонированную к-ДНК и опре, деляют ее последовательность оснований. 4

8. Определение последовательности оснований клонированной к-ДНК.

Трансформированный организм

Х 1776/pRTNF 802 культивируют в бульоне LB, содержащем диаминопимели5 новую кислоту и тимидин. Клетки обрабатывают ДНК, расщепляют эндонуклеазой Psr I, очищают и получают клонированную к-ДНК. Фрагмент клонированной к-ДНК расщепляют затем различными эндонуклеазами и определяют последовательности оснований фрагментов.

Последовательность оснований с

277-го по 738-е основание является участком, кодирующим IfoJIHbIH кроличий ФНО. Основания с 34-го по 276-е являются последовательностью оснований, кодирующих полипептид„ необходимый для образования предшественни" ка кроличьего ФНО.

Пример 8 (справочный) . Вьщеление и очистка кроличьего ФНО.

Кроликам (в ес тела 2, 5 — 3, 0 кг) внутривенной инъекцией вводят по

50 мг умерщвленных сухих клеток Propiunibacterium acnes. Спустя 8 дней кроликам внутривенной инъекцией вводят по 100 мкг эндотоксина. Через 2 ч у каждого кролика забирают кровь сер,дечной . пункцией. Кровь смешивают со

100 ед. гепарина натрия на 100 мл

Ф клетки крови и нерастворимые соединения удаляют. От 400 кроликов получают 24 л плазмы.

К 24 л плазмы прибавляют ЭДТА (24 г) и 240 r цеолита, смесь пере35 мешивают в течение 1 ч, фильтруют через три фильтра с размерами пор 3, 1 и 0,2 мкм.

К 24 л фильтрата прибавляют 12 л

0,04 М буфера тряс-НС1 (рН 7,8), на40 носят на колонку (27 45 см) с DEAESepharose, уравновешенную 0,04 M буфером трис-НС1 (рН 7,8), содержащим О, 1 М NaC1. После этого колонку промывают 75 л буфера трис-НС1 8рН 7,8), <5 7, 8), содержащего 0,1 M NaC1, и затем

50 л 0,04,М буфера трис-НС1 (рН 7,8), содержащего О, 15 M NaC1 после чего элюируют 0,04 М буфером трис-НС1 (рН 7,2), содержащим О, 18 М NaC1.

5О Элюат фракционируют на фракции по 8 л и собирают фракции, обладающие цитотоксической активностью. Активные фракции объединяют и разбавляют равным объемом 0,04 M буфера трис-HGl (рН 7,8)< Разбавленный раствор наносят на колонку (10 х13 см) с DEAR-Яерharose. Колонку промывают 1 л 0,04 M буфера трис-.НС1 (рН 7,8), содержаще5

25 17 го 0,1 M NaCl, элюируют 5 л 0,04 Я буфера трис-НС1 (рН 7,2), содержащего

О, 18 М NaC1, фракционируют на фракции по 250 мл и фракции, обладающие цитотоксической активностью, собирают и объединяют.

Активную фракцию нагревают при

60 С в течение 30 мин и быстро охо лаждают до 4 С. Холодный раствор концентрируют ультрафильтрацией.

Результирующий концентрат наносят на колонку (5х80 см) с Sephaeryes-200, уравновешенную 0,005 М фосфатным бу-. фером (рН 7,4), содержащим О, 1 M

NaCl, и элюируют тем же буфером.

Элюат фракционируют на фракции по

40 мл и активные фракции собирают, объединяют и концентрируют ультрафильтрацией.

Концентрат наносят на колонку с

Zn -хелатной сефарозой . Колонку (j,6 20 см) наполняют хелатной сефарозой (смола с фиксированной иминодиуксусной кислотой), промывают

120 мп раствора хлорида цинку (1 мг/

/мл) и уравновешивают 0,05 M фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим

0,1 M NaC1. После этого в колонку вводят концентрат, полученный на предыдущей стадии, элюируют тем же буфером. Собирают фракции, не адсорбирующиеся на колонке. Цитотоксическая активность почти полностью вы деляется в этих фракциях.

Активные фракции, полученные на предьдущей стадии, концентрируют и наносят на колонку (1,5890 см), уравновешенную 0,005 М фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим О, 15 M NaC1, элюируют тем же буфером и собирают активные фракции. Этот образец представляет собой очищенный кроличий плазменный ФНО.

Полученный таким образом очищенный кроличий плазменный ФНО.используют в примерах 3 и 4 .

Пример 9 (справочный). Определение N-концевой и С-концевой аминокислотных последовательностей кроличьего ппазменного ФНО.

Очищенный кроличий плазменный

ФНО, полученный в примере 2, используют для определения N-концевой и

С-концевой аминокислотных последо-. вательностей. N-концевую аминокислотную последовательность определяют разложением по способу Эдмана. Результирующие фенилтиогидантоинамино39855 26 кислоты идентифицируют жидкостной хроматографией высокого давления.

С-концевую аминокислотную последовательность определяют ферментативным способом с использованием карбоксипептидаз. Очищенный кроличий плазменный ФНО расщепляют карбоксипептидазами А и 7 при молярном соотношении фермента и субстрата, равном соответственно 1:25 и 1:1000. Свободные аминокислоты, выделяющиеся из

С-окончания кроличьего. плазменного

ФНО в результате двойного отщепления, идентифицируют с помощью аминокислотного микроанализатора.

Установлено, что N-концевые и Сконцевые аминокислотные последова тельности кроличьего плазменного ФНО являются следующими:

N-окончание — Ser-Ala-Sar Arg-Ala° ° оо

С-окончание — ....Ча1-Tyr-РЬе-G l ó- TI e-Т? е- А1а-L eu.

25 Пример 10 (справочный). Полу. чение антитела против кроличьего плазменного ФНО °

Раствор ФНО, содержащий 1,9 10 ед. (L-929) очищенного кроличьего плазменного ФНО, полученного в првмере 2, эмульгируют с равным объемом полного стимулятора фрейнда и эмульсию вводят подкожной инъекцией в спину морских свинок в нескольких местах. Животных иммунизуют таким же 5 способом через 1,3 и б нед. Кроме того, через 6 нед такое же количество очищенного кроличьего плазменного

ФНО вводят внутрибрюшинной инъекцией вместе с гелем гидроокиси алюминия.

"0 Цельную кровь отбирают сердечной; пункцией через 9 нед после первой иммунизации, центрифугируют и получают антисыворотку, содержащую антитела против кроличьего плазменного ФНО.

4> Антисыворотку пропускают через колонку, снабженную сывороточными белковыми компонентами нормальных кроликов. Проводя операцию три раза, получают очищенные антитела, специфи 0 ческие по отношению к кроличьему плазменному ФНО. Иммуцоэлектрофорез и методики двойной диффузии через гель подтверждают, -что это антитело образует одну полосу осадка с очищенным кроличьим плазменным ФНО, Этот раствор антитела, разбавленный приблизительно в 60000 раз, обладает способностью нейтрализовать 50Х

1739855

Thr P io Se r Asp Ly

Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln. Leu

Asn Ala Leu

Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala

ЛГ9 Asp Asn

Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu

Gln Leu Val Val Pro ger G3;u Gly Бои Tyr

Leu X1e (1п С1у

Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly

Суз Pro Ser Thr His Val Leu Leu

Thr His Thr Х1е Ser Arg Xle Л1а Val Ser

Ьуя Ча1 Asn Leu Leu Ser Ala

Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro

Thr

Tyr Gln

Tle Ьуя (;lu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu

Pro Xle Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu

Glu .уа Gly Лыр Arg Leu Ser Ala Glu 1le

Авп Arg Pro Asp Tyr .Leu.Азр Phe Ala Glu

Ser С1у Gln Val Tyr Phe Gly Ile Хlе Ala

T4r Glu Ser Net Хlе Arg Asp Ual Glu

А1а Glu Glu Л1а Leu Pro Xyo Lys Thr

Ser !

Ьаа

G1y Ser Arg Arg Cys. Ьец

G1y Pro G1n

Leu Ser Leu

G1y

Phe Ser Phe Leu Хlе Ча1

The Leu Phe .Cys Leu Leu

Gly Ala Thr

Phe Gly Val

Хlе Gly Pro Gln Arg Glu

His

Asp Leu Зес Leu Х1е Ser

Glu Phe Pro Arg

Pro Leu Ala G1n

Ala Val Arg ... (Хс), 27 от 500 ед. (L-929) цитотоксической активности кроличьего плазменного

ФНО, а разбавленньй в. 1000 раз может полностью нейтрализовать 50 ед. (ЬИ) цитотоксической активности кроличье- . го плазменного ФНО.

Формула и з обретения

Способ получения полипептида, об5 ладающего активностью фактора некроза опухоли человека, характеризующегося формулой А или В, или

Иес-х-В-В, где А представляет собой: и

s Pro Val Ala His Val

Составитель Т.Забойкина

Техред M.дидык Корректор M,Ïàòàé

Редактор B.Петраш

Заказ 2013 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101

29 1739855 заключающийся в том, что культиви- дующей злюцией линейным градиентом руют штамм бактерий Escherichia coli NaC1 от 0 до 0,3 М, обессоливанием

Тя1 03/рНТТ26 или Е. co li НВ101/pHTR91 . активных фракций, концентрированием или E.coli НВ101/pHTS11 5 или Е.coli ультрафильтрацией, иэоэлектрофокусиНВ101/pHTS37 или Е.coli HB101/pHTRP3 рующим гель-электрофорезом в буфере

5 или E.coli HB101/pHTRD4 в LB бульоне, с градиентом рН 5,6 — 6,1, элюировамодифицированной M-9 среде или ТС нием полипептида с помощью трис-НС1 среде при 37вС, получают клеточный при рН 7,8, объединением элюатов и лизат, центрифугируют его, очищают 1О концентрированием с помощью ультрапутем нанесения лизата на колонку : ;фильтрации и гель-фильтрации на кос дЕАЕ-сефарозой, уравновешенную лонке с Био-гелем. трис-НС1 буфером с рН 7,8 с после