Способ очистки рекомбинантного фактора некроза опухоли

 

Изобретение относится к биохимии , в частности к способу очистки физиологически активного вещества., Способ заключается в том, что водный раствор, содержащий неочищенный человеческий ФИО, полученный генно-инженерным методом, подвергают колоночной хроматографии, используя колонку, заполненную связанным с красителем сшитым агарозным гелем., 8 табл

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СО1.1ИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

„„SU» 1630602 (51)5 А 61 К 37/02, С 12 И 15/28

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

flQ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Бег Бег Ser- Arg Thr ProSer Asp Lys Pro Val Ala His Ча1 Ча1

) Ala Asn Pro Gln Л1а Glu Gly Gln Leu Gln Trp Т,г.u Asn Arg Arg

Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Чаl Glu Leu Arg Asp Asn Gln

Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val

Lr u Phe Lya Gly Gln Gly Cxs Pro Ser Thr 11з.н Val Lcu Lcu Thr (21) 3985474/13 (22) 22.11.86 (31) 59-246184 (32) 22.11.84 (33) JP (46) 23.02.91. Бюл. Ф 7 (71) Асахи Касей Когио Кабусики

Кайся (Л. ) (72) Юнити Кадзихара, Такао Киета н Хироси Хаяси (1Р) (53) 575. 224. 2 (088. 8) Изобретение относится .к биохимии, в частности к способу очистки физиологически активного вещества, причем указанное физиологически активное вещество является веществом, полученным по методике с рекомбинантной ДНК с использованием рекомбинантной ДНК, содержащей ДНК, кодирующую вещество, которое обладает цитотоксической активностью против L-M клеток и способно индуцировать геморрагический некроз трансплантированной MetA саркомы в ВаЬ В/с мьппей.

2 (54) СПОСОБ. ОЧИСТКИ РЕКОИБИНАНТНОГО

ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ (57) Изобретение относится к биохимии, в частности к способу очистки физиологически активного вещества.

Способ заключается в том, что водный раствор, содержащий неочищенный человеческий ФНО, полученный генно-инженерным методом, подвергают колоночной хроматографии, используя колонку, заполненную связанным с красителем сшитым агарозным гелем., 8 табл.

Человеческий фактор некроза опухоли является веществом, полученным по традиционной методике с рекомбинатной ДНК, содержащей ДНК, кодйрующую ФНО, Человеческий ФНО проявляет цитотоксическую активность против L-M клеток и индуцирует геморрагический некроз трансплантированой Net А саркомы у BaL В/с мышей. Человеческий ФНО представляет собой полипептид, имеющий следующую аминокислотную последовательность:

1630602

His Thr Ile Ser Arg Xle Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Х1е Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu

С1у Я1а Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly

Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Х

Arg pro Asp Tyr Leu Asp phe Ala Glu Ser Gly Gln Ча1 Tyr Phe

Gly Ile Х1е Ala Leu . мированных плазмидой, кодирующей ФНО со следующей нуклеотидной последовательностью:

Человеческий ФНО, имеющий указан" ную аминокислотную последовательность, получают в результате культивирования итаммов Е.соТ1, трансфорTCA ТСТ TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA

ВСЯ ЛЛС ССТ СЛЛ GCT GAG GGG CAG СТС CAG TGQ CTG ЛЛС CGC CGG

GCC AAT GCC СТС CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT. AAC CAG

CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC СТС ATC TAC TCC CAG GTC

СТС TTC AAG GGC CAA GGC TGC ССС TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC

CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC

CTC СТС TCT GCC ATC AAG AGC ССС TGC САС AGG GAG АСС CCA GAG

GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG ССС ATC TAT CTG GGA GGG

GTC TTC CAG CTG GAG AAQ GGT GAC CGA СТС AGC GCT GAG ATC AAT

CGG ССС GAC TAT СТС GAC ТТТ GCC.GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT

GGG ATC ATT GCC CTG

Человеческий ФНО и указанную ДНК получают следующим образом„

Используют геномный набор (библиотеку) бактериофага пропилина и геном4> ный набор бактериофага человека. Ткани кролика или человека, например ткань поджелудочной железы кролика или человека, измельчают и обрабатывают, чтобы переварить ДНК и белковые ма50 териалы и получить при осаждении высокомолекулярную ДНК кролика или человека. Высокомолекулярную ДНК частично переваривают эндонуклеазами.

Полученные фрагменты ДНК фракцио—

55 нируют по размерам, получая фрагменты от 15 до 20 к. и. т., и клонируют, используя вектор Чарок 4А фага. Векторы упаковывают in vitro в частицы

sp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn заражающего фага, содержащие рДНК, и получают указанный геномный набор кролика или человека. кДНК ФНО кролика метят P-меченой эг вставкой, Каждый из геномных наборов бактериофаг/кролик и бактериофаг/человек помещают на пластины для фактического стечения массы бактерий и скринируют для гибридизации с P-меченой кДНК

ФНО кролика.

Из подходящих клонов изолируют соответствующую ДНК, определяют рестрикционные карты и анализируют по методу гибридизации Соутерна. Рестрикционные фрагменты, содержащие гены

ФНО кролика или человека, субклонируют в векторы, а затем секвенируют„

1630602

Основную последовательность кДНК ФНО кролика сравнивают с геном ФНО кролика для определения экзонов и интронов гена ФНО кролика. Сравнивают основную последовательность гена человеческого ФНО с основной последовательностью гена ФНО кролика для определения экзонов и интронов гена человеческого ФНО. Аминокислотную последовательность ФНО кролика, которая вычислена из основной последовательности, полученной делецией интронов гена ФНО кролика и сочетанием его азкенов, приводят в соответствие с аминокислотной последовательностью из

;основной последовательности кДНК ФНО ролика. Затем определяют аминокислотчую последовательность человеческого йНО, из основной последовательности

11НК, кодирующей человеческий ФНО, полученной делецией интронов гена, кодирующего человеческий ФНО, и объединением его экзонов. Кодируют человеческий ФНО в соответствующий вектор экспрессии для образования рекомбинантной ДНК, содержащей кодирующую

ДНК. Рекомбинантную ДНК используют для трансформации соответствующей клетки хозяина, что позволяет расти в культуре и экспрессировать желаемый человеческий ФНО. Полученный таким образом человеческий ФНО имеет

155 аминокислотных остатков в его зрелой форме, начиная с серина.

Водный раствор, содержащий неочищенный человеческий ФНО, подвергают колоночной хроматографии, используя колонну, заполненную связанным с красителем сшитым агаровым гелем, Перед проведением колоночной хроматографии водный раствор, содержащий неочищенный человеческий ФНО, частично очищают с использованием одной или сочетания традиционных биохимических методик, чтобы получить водный раствор, содержащий частично очищенный человеческий ФНО. В качестве подходящих биохимических методик для частичной очистки человеческого ФНО используют обессоливающую методику, в которой применяют сульфат аммония, ионообменную хроматографию для удаления белковых примесей, в которой применя-: ют анионообменную смолу, такую как

ДЕАЕ-Сефарозу, обработку водным раствором полимина P для удаления белковых загрязнений, методику гель-фильтрации, электрофореза и т.п. Раствор, содержащий физиологически активное вещество, подвергают колоночной хроматографии, используя колонку, заполненную связанным с красителем сшитым агарозным гелем. Водный раствор, содержащий физиологически активное вещество, включает как упомянутые водные растворы, содержащие неочищенный человеческий ФНО, так и водные растворы, содержащие частично очищенный человеческий ФНО.

Связанный с красителем сшитый агарозный гель приготавливают путем ковалентного связывания красителя в качестве лигнина со сшитым агарозным гелем. В качестве сшитого агарозного геля может быть применен любой сшитый агарозный гель, например Сефароза. В качестве красителя используют Цибакрон голубой ЕЗСА, Процион красный

НЕЗВ, Зеленый А.

Сшитые агарозные гели, связанные с красителем, являются коммерчески доступными. В качестве Цибакрона голубого РЗСА, связанного со сшитым агарозным гелем используют Блю Сафар розу CL-6В, Аффигель Блю, Матрекс

Гель Блю А и т.п. В качестве Проциона красного НЕЗВ, связанного со сшитым агарозным гелем, используют Матрекс Гель Ред А и т.п. В качестве

Зеленого А, связанного со сшитым агарозным гелем, используют Матрекс Гель

Грин А.

Указанным связанным с красителем сшитым агарозным гелем заполняют колонку и используют ее для колоночной хроматографии. Колоночную хроматографию проводят следующим образом.

Колонку, заполненную связанным с красителем сшитым агарозным гелем, уравновешивают буфером, содержащим

0,1 M NaC1 (ph 5,5-6,5). В качестве буфера используют фосфатный буфер и т.п. В уравновешенную таким образом колонку наносят водный раствор физиологически активного вещества. Предпочтительно, чтобы величина рН водного раствора сырого физиологичЕски активного вещества была установлена равной 5,5-6,5. Затем колонку промывают тем же самым буфером. После этого проводят элюирование, используя в качестве элюента буфер, имеющий более высокую концентрацию хлористого натрия, чем в буфере, использованном для уравновешивания колонки, например буфер, содержащий 0,5 M или более NaC1.

1630602 люирование также проводят с использованием в качестве элюента буфера, имеющего величину рН 8,0 или выше, Таким образом получают фракцию, содер-. жащую человеческий ФНО.

Согласно предлагаемому способу человеческий ФНО попучают в чистом виде с высоким выходом. 10

Связанный с красителем сшитый агарозный гель, используемый в изобретении, является устойчивым к водному щелочному раствору и к теплу и, следовательно, может быть подвергнут обработке водным щелочным раствором, чтобы легко удалить пирогены, которые являются нежелательными примесями для фармацевтического применения, и может быть стерилизован в автоклаве.

Очищенный таким образом, человеческий ФНО обладает противоопухолевой активностью, в то время как он 25 не оказывает токсического действия на нормальиле клетки. В опыте in vivo используют Met А саркому, трансплантированную мьппам, при введении мыши

300 единиц очищенного человеческого 30

ФНО который получен согласно изобретению, его активность оценена как (+). Такж.. наблюдается значительное ингибироваиие роста или регрессия ра" ка после. введения очищенного человеческого ФНО по сравнению с контролем — мьппью, которой был инжектиро-. ван физиологический раствор, на мышах, которым трансплантирована. карцинома Колен 26. Оценяют цитоток- 40 сическую активность против различных раковых клеток очищенного человеческого ФНО так же, как в опыте

in vitro с тем исключением, что используют азенокарциномы РС-8 клетки 45 (рак легкого) и нормальные клетки (клетки почки новорожденного человека), и клетки крайней плоти новорожденного человека в качестве контроля вместо L-М клеток, клетки инкубируют при 37 С в течение 72 ч вместо 37 С в течение 48 ч.

Полученный человеческий ФНО обладает отличной противоопухолевой активностью,.Следовательно, полученный человеческий ФНО является особенно полезным при клиническом применении человеческого ФНО в качестве противоопухолевого лекарства.

Применяют аналитический метод для оценки противоопухолевой активностй человеческого ФНО., Способ оценки in vivo активности

ФНО. Трансплантируют клетки Met А саркомы (2 10 клетки) подкожно каж5 дой BAL B/с мыши. Через 7 дней отбирают для оценки мышей с опухолями диаметром 7-8 мм без геморрагического некроза и с хорошей васкуляризацией. Образец человеческого ФНО (0,5 мл), разбавленный физиологическим раствором, инжектируют через хвостовую вену каждой мьппи. Активность образца оценивают через 24 ч по следующим критериям: (-) нет изменений; (+) слабый геморрагический некроз; (+): умеренный геморрагический некроз (центральный некроз, распространяющийся приблизительно на 50% поверхности трансплантированной опухоли);(+ +): значительный геморрагический некроз (массивный иекроз в центре трансплантированной опухоли, составляющий маленький жизнеспособный ободок вдоль периферии опухоли).

Способ оценки in vitro (аналитический метод с использованием L-M клеток).

Образец (0 1 мл) человеческого

ФНО, серийно разбавленный средой, и суспензию L-M клеток (0,1 мл, 1.10 клеток/мл) прибавляют в каждое углубление ЯС-камерной пластины микротитратора. В качестве среды используют минимальную основную среду Мгла содержащую 10% обьем/объем сыворотки новорожденного теленка. Пластины инкубируют при 37 С в течение 48 ч в атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода. В конце периода культивирования прибавляют 20 мкл 20%-ного водного раствора глутарового альдегида для фиксации клеток. После фиксации пластины промывают и дают им высохнуть и прибавляют 0,1 мп 0,05/ного раствора метиленового голубого для окраски жизнеспособных клеток.

Пластины тщательно промывают для удаления избытка метиленового голубого и дают им высохнуть. Затем в каждую ячейку добавляют 3%-ную соляную кислоту, чтобы экстрагировать метиленовый голубой из окрашенных клеток. Измеряют абсорбцию каждой ячейки при

665 нм. Абсорбция пропорциональна числу жизнеспособных клеток. Разбавление человеческого ФНО, которое соот1630602

l0 ветствует абсорбции вещества, равной

50 от абсорбции контрольной группы, в которую образец человеческого ФНО не был добавлен, получают графически

5 или путем расчета. Разбавление определяют как одну единицу мл.

Пример 1. Самкам кроликов, весящим 2,0-3,0 кг, инжектируют 50мг убитых Формалином P ropionibac terium acnes (Corynebac ter ium parvum) через ушную вену. Спустя 8 дней снова инжектируют ч ер ез ушную вену 100 мкг эндотоксина (липополисахарид из Escherichia coli 026:36), а через 2 ч собирают цельную кровь из сердца. К собранной крови добавляют гепаринат натрия в количестве 100 единиц на

100 мл. Затем кровь центрифугируют при охлаждении при 5000 об/мин в течение 30 мин для удаления клеток крови и нерастворимых твердых продуктов.

В результате получают плазму (2,4 л), имеющую цитотоксическую активность

ФНО сыворотки 3 10 ед/мл, от .40 кро4. ликов, К 2,4 л плазмы прибавляют 24 г целлита, Полученную смесь перемешивают 1 ч, а затем фильтруют. Фильтрат смешивают с 1,2 л 0,04 M транс-НС1буфера (рН 7,8), а затем наносят на колонку с ДЕАЕ-Сефарозой CL-6B, уравновешенной 0,04 M транс-НС1-буфером (рН 7,8), Колонку промывают 0,04 И трис-НСl-буфером, содержащим 0,1 М

NaC1 а адсорбированный ФНО элюируют, используя 0,04 И трис-НС1-буфер (рН 7, 2), содержащий 0,18 И NaC1. Фракции, обладающие цитотоксической активностью против Ь-клеток,концентрируютультрафиль- 40 трацией, Полученный таким образом концентрат наносят на колонку с Сефакрилом 8-200, уравновешенную 5 ьИ фосфатным буфером, и гель фильтруют,, используя тот же самый буфер. Активные 4 фракции концентрируют ультрафильтрацней, в результате чего получают очищенный ФНО, имеющий активность 3,5» 10 ед. и удельную активность 19 х

Х10 ед/мг.

Частично очищенный ФНО из сыворот- 0 ки кролика смешивают с полным адъювантом Фрейнда (1:1), а затем подкожно инжектируют в спину 12-недельным . самцам мышей BaL В/с. Повторяют опи, санную операцию через 2 и 4 недели после первой инъекции. Через неделю после последней инъекции собирают цельную кровь. Из собранной крови получают сыворотку, Полученную таким образом сыворотку прибавляют к культуральной среде для оценки цитотоксической активности ФНО против L-клеток в таком количестве, чтобы она была разбавлена в 500 раз в конечной концентрации.

Оценивают цитотоксическую активность

ФНО сыворотки кролика против L-клеток. ФНО сыворотки кролика не обла-. дает цитотоксической активностью против L-клеток. Из приведенного результата делают вывод,что мышиная сыворотка, полученная на этой стадии, содержит антитело и ФНО из сыворотки кролика.

Самкам кроликов внутривенно инжектируют убитые формалином клетки Propionibacterium аспез (Corynebacterium parvum). Семь дней спустя кролика подвергают трехеотомии и промывают легкое физиологическим раствором, в результате получают плавающие клетки.

Полученные таким образом клетки промывают физиологическим раствором. Используя в качестве культуральной среды Phun 1640, содержащей 10Х объем/

/объем сыворотки новорожденного тео ленка, клетки инкубируют при 37 С в атмосфере, содержащей 51 двуокиси углерода. Культуру клеток разделяют на

3 группы и в одну из них добавляют эндоксин, происходящий из Escherichia

coli (липополисахарид из Escherichia

coli 026:В6) в концентрации 10 мкг/мл.

В другую добавляют такое же количество стерильной воды. Надосадочный слой культуры клеток, к которой добавлен эндотоксин, проявляет цитотоксическую активность против Ь-клеток, и активность достигает максимальной величины за 7 ч. Такая активность подавляется антителом анти-ФНО, но не подавляется нормальной сывороткой мышей.

С ppyroA стороныу надосадочныи слой клеточной культуры, к которой не был добавлен эндотоксин, не проявляет цитотоксической активности против L-клеток.

К культуре клеток, к которой добавлен эндотоксин, затем добавляют радиоактивный L (5 ) метионин (13000 Ки/ммоль) (1 мКи/мл). Надосадочный слой анализируют электрофорезом на СДС-полиакриламидном геле

Концентрацию геля устанавливают

12,5 мас.X. После электрофореза гель обрабатывают ENHANCE и после окра1630602!

2 шивания экспонируют на рентгеновскую пленку. В надосадочном слое культуры клеток в присутствии эндоксина наблю- дают что образуется вещество имеюЭ

5 щее мол.м. около 17500.

Далее надосадочный слой каждой полученной культуры клеток подвергают электрофорезу на "ДС-полиакриламидном геле. После этого гель встряла !О кивают в течение 1 ч в 2,5%-ном NP40 а затем в воде в течение 2 ч. После встряхивания отделяют разрезанием каждую линию миграции и разрезают на отрезки шириной 2 мм в направлении, перпендикулярном направлению миграции. Каждую полоску культивируют с клетками и оцениваит цитотоксическую активность против L-клеток. В полосе, на которой надосадочный слой культуры клеток, содержащей эндотоксин,проявляется цитотоксичная активность против L-клеток в положении, соответствующем мол.м. 17500. В других положениях не наблюдается цитотоксич- 25 ности

Культуру клеток инкубируит в течение 2 ч после добавления эндотоксина, затем центрифугнруют для сбора клеток. Проводят экстракцию цитоплазматической PHK из собранных клеток и экстракцию мРНК из цитоплазматической РНК. Прибавляют 4 мл 4 М раствора гуанидиатиоцианата к 3 10 клеток, смесь .распыляют с помощью гомогенизатора, остатки извлекают центрифугированием и растворяют 2,4 r хлористого цезия. Смесь осторожно выливают в полномерную трубку, в которую заранее помещены 2,5 мл 5,7 M хлористо- 40

ro цезия и 0 1 мл раствора ЭЛТА (рН 7,5), а затем проводят ультрацентрифугирование при 30000 об/мин о в течение 12 ч при 20 С, используя ротор Неммана.

После удаления надосадочного слоя шарик растворяют в 1 мл 10 мМ буфера трис-НС1, содержащего 5 мМ ЭДТА и

1 мас.% объем СДС. Полученный раствор экстрагируют 4:1 по объему смесью хлороформа и 1-бутанола. К водной фазе прибавляют 0,05 объема 2 M ацетата натрия и 2,5 объема этанола, от0 стаивают при -20 С в течение 2 ч или более, в результате осаждается РНК.

Осадок собирают центрифугированием, 55 сушат, а затем растворяют в 500 мкл стерильной воды. В результате получают цитоплазматическую РНК.

Полученный раствор РНК нагревают при 68"С в течение 2 мин, после чего быстро охлаждают. К раствору прибавляют 500 мкл двукратной концентрации

10 мМ трис-ЭДТА-буфера (рН 7,4), содержащего 1 мМ ЭДТА, 0,1 мас.%/объем

СДС и 0,5 M хлористого лития),смесь наносят на 200 мг олиго-dT-целлюлозы, в колонке промывают 10 мл того же буфера (однократная концентрация).

Материал в колонке элюируют 2 мл элюирующего буфера, содержащего 10 мМ трис-НС1-буфера (рН 7,4), 1 мМ ЭДТА и 0,1 мас.%/объем СДС. К элюату прибавляют 0 05 объема раствора ацетата натрия и 2,5 объема этанола,смесь охлаждают до -20 С для осаждения. о

Осадок собирают центрифугированием и наносят на колонку с олиго-dT-целлюлозой, собирают фракции, адсорбированные в олиго-dT-целлюлозе. Извлекают 85 мкг мРНК, что определено с помощью УФ-спектрального анализа.

Растворяют 880 мкг мРНК в 250 мкл воды и полученный раствор наливают в

10 мл 5-25%-ного линейного градиента сахарозы по плотности. Градиент плотности сахарозы получают с помощью

ТБСО 570 гадиентера, используя трисбуферные растворы (содержание 25 мМ трис-НС1 рН 7,2, 2 мМ ЭТА и 1 мас.%/

/объем СДС), содержащие соответственно 5 и 25% сахарозы.

Проводят ультрацентрифугирование, используя ротор Бекмана Sn41, при

40000 об/мин в течение 12 ч при 4 С, собирают фракции каждые 400 мкл с помощью устройства для сбора фракций, а затем осаждают этанолом. Осажденные фракции центрифугируют и растворяют в стерильной воде.

Проводят трансляцию иРНК, используя социты Хепорцз laeves, фракционированную мРНК растворяют в стерильной воде до получения концентрации

1 мкг/мкл,ижкектируют раствор в социты в таком малом количестве, как

500 мл на клетку. Затем клетки культивируют в течение 24 ч в растворе

Барта (содержащем 7,5 мМ трис-НС1 рН 7,6, 88 мМ NaC1 1 мМ хлористого калия, 0,33 мМ нитрата кальция, 0,41 мМ хлористого кальция, 0,82 мМ сульфата магния, 2,4 мМ бикарбоната натрия, 13 И/мл пенициллина G u

18 мкг/мл стрептомицина), который содержит 1 мг/мл сывороточного бычье1630602

14 го альбумина. Осциты размещают в жидкой культуре стеклянной палочкой.

Жидкую культуру затем центрифугируют и оценивают надосадочный слой на ци5 тотоксическую активность против Lклеток. мРНК, которая должна быть транслирована, для получения полипептида, имеющего максимальную активность, седиментирует как 168 по размеру. Эта активность удаляется антителом анти-9НО но не удаляется нормальной сывороткой мышей, Используя 5 мкг фракционированной

15 мРНК, готовят двунитевую ДНК. Двунитевую ДНК фракционируют по размерам на 3,5%-ном полиакриламидном геле, получают 330 нг, примерно от 100 до 200 пар оснований. 7 нг этой фракции наращивают деоксиостатками, используя терминальную деоксилуилеотнлдилтрансферазу и отжигают 56 нг плазмиды pBR 322, которая была переварена Pst 1 и нарощена деокси -G-остатками.

Полученную смесь вставляют Е.coli

К-12 (штамм НВ 101, АТСС, 33964),чтобы трансформировать штамм, В результате получают 12000 трансформантов.

ФНО кролика (активность: 5 10 единиц) подвергают электрофорезу на СДСполиакриламидном геле, Часть геля окрашивают Кумасси Бриллантовым голубым. Полосу в положении, соответствующем мол.м. 17500, вырезают из

35 геля и экстрагируют 1%-ным бикарбонатом аммония. Извлекают около 180 мг

ФНО в виде белка.

Растворяют 150 мкг извлеченного

ФНО в 75 мкл 1%-ного бикарбоната аммония, затем добавляют 3 мкг ТРСК о трипсина. Смесь инкубируют при 37 С в течение 4 ч. Затем смесь фракционируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонне, заполненной Космосилом 503 в качестве насадочного материала, чтобы в результате получить фрагменты, переваренные трипсином.

Высокочистый ФНО и его переваренные трипсином фрагменты .-затем подвергают обессоливанию на колонке с Сефадексом G-25 и сушат с замораживанием.

Очищенные ФНО и переваренные трипсином фрагменты каждые подвергают разложению Эдмана из N-терминала. Высвободившуюся на каждой стадии PTHаминокислоту анализируют традиционным методом с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, модель

SP 8100 обнаруживает, что ФНО имеет следующую N-терминальную аминокислот-. ную последовательность: Ser-Ala-Sez-Arg-Ala-Leu-,Ser-Азр-Lys-Pro-Leu-Ala-Hes-Val-Val-Ala-Ala-Asn-Pro-Glu-Va1-Glu-Gly-Gln-Leu -Glu.

Один из переваренных трипсином фрагментов имеет следующую N-терминальную аминокислотную последовательность: Glu — Thr — Pro Glu Glu Ala

Glu Pro Met Ala.

Олигодеоксинуклеотиды, комплиментарные основной последовательности мРНК, синтезируют согласно усовершенствованной фосфотриэфирной методике. При получении олигодеоксинуклеотидов 128 олигодеоксинуклеотидов, определенных из аминокислотной последовательности ФНО кролика, классифицируют на пять групп, а именно группы 16,16,32,32 и 32, и синтезируют в виде смеси олигодеоксинуклеотидов соответствующих групп. Осуществляют защиту у полученных олигодеоксинукле" отидов соответствующих групп согласно традиционной методике и очищают колоночной хроматографией, используя Сефадекс -50 и электрофорез на

20%-ном полиакриламидном геле, содержащем 7 M мочевины.

Полученные таким образом олигодеоксинуклеотиды соответствующих групп диализуют против О,! мМ трисЭДТА буферного раствора.

Каждый из очищенных олигодеоксинуклеотидов соответствующих групп метят, используя Т полинуклеотиднинезу и P-аденозинтрифосфат, а затем очищают колоночной хроматографией.

Радиоактивный материал включают в каждый из нуклеотидов соответствующих групп в количестве около 3 > 10 кпм/мкг. Олигодеоксинуклеотидные зонды, каждый полученный в виде смеси соответствующей группы, обозначены, как показано в табл.1.

Часть аминокислотной последовательности ФНО кролика, основная последовательность мРНК, определенная из аминокислотной последовательности

ФНО кролика, и основные последовательности синтетических олигонуклеотидных зондов соответствующих групп приведены в табл.1.

1630602

20 ры экспонируют на рентгеновскую плен- 25 полученные при расщеплении соответстОбрабатывают мРНК клеток, продуцирующих ФНО, раствором, содержащим

1 М глиоксаля, 10 мМ NaH P04 и 50 об.% диметилсульфоксида, при 50 С в течение 60 мин, а затем подвергают фракционированию, используя электрофорез на 1,1%-ном агарозном геле. Фракцио" нированную мРНК переносят на фильтр переносящего устройства электрофоретического типа. Затем мРНК на фильтре устройства обрабатывают 5 < Денхардт с раствором, содержащим 5«SSC раствор и 150 мкг/мл денатурированной ДНК сперматозоидов лосося, при

65 С в течение 2 ч, а затем обрабао тывают 5 v Денкардт с раствором со7

Э держащим l ° 10 кпм/мл, меченых, олигодеоксинуклеотидов и 5 х SSC расто вор, при 50 С в течение 2 ч. Полученный осадок на фильтре промывают

6 У SSC раствором последовательно четыре раза при комнатной температуре, о при 40,,50 и 60 С. Облученные фильтку XAR-5 ° В результате обнаруживают, что олигодеоксинуклеотиды, обозначенные как зонд MJ сильнее гибридизируется с мРНК.

Трансформанты переносят на целлюлозный фильтр и гибридизуют ДНК с меченым олигодеоксинуклеотидом (зонд

MJ) в тех же самых условиях, что в примере 12. Отбирают 49 колоний, которые сильно гибридизуются с меченными олигодеоксинуклеотидами (зонд

MJ) а затем фиксируют на другом нитроцеллюлозном фильтре. Затем, используя 49 колоний, проводят дальнейшую гибридизацию, чтобы отобрать девять колоний„ которые более сильно гибридизуются с меченными олигодеоксинуклеотидами (зонд MJ).

Получают примерно 5 мкг плазмиды из каждой из девяти колоний, Каждую из полученных плазмид расщ<епляют, используя растрикционные ферменты

Pst Х, Tag I Rsa I u Pvu II, затем проводят электрофорез на 1%-ном агарозном геле и сравнивают фрагменты, вующими рестрикционными ферментами, по их длине.

Результаты подтверждают, что все девять штаммов соответствующих девяти колоний содержат фрагмент, получаемый при расщеплении Pv« II u Rsa I, размером 50 п.о., и что большинство

55.из девяти штаммов имеют фрагмент, полученный расщеплением RsaI размером 200 п„о. Другими словами, результаты подтверждают, что девять штаммов имеют частично общие основные последовательности.

Раздельно культивируют семь штаммов, содержащих плазмиды, приведенные в табл.2, в 2 мл ЛБ-среды, содержащей 10 мкг/мл тетрациклина, до тех пор, пока оптическая плотность растворов не достигнет заданной величины, затем центрифугируют для получения соответствующего штамма.

Каждый из полученных штаммов отдельно добавляют в 2 мл физиологического раствора и разрушают озвучиванием. Полученные растворы центрифугчруют и определяют цитотоксическую активность против L-клеток полученных надосадочных слоев. В качестве контрольного теста повторяют ту we самую процедуру, используя штаммы, содержащие плазмиду рВК 322.

Подавляют цитотоксическую активность против I-клеток с помощью антитела анти-ФНО.

Культивируют штаммы Е.coli содержащие плазмиды рВК2-7 и pBR 18, в 1 л среды М9 содержащей 10 мкг/мл тетрациклина.

Определяют основную последовательность вставки каждой плазмиды в соответствии с химической процедурой

Максам-Диилберта. Определенная таким образом основная последовательность находится в согласии с частичными аминокислотными последовательностями, определенными в примере 9..

На этой стадии проводят конструирование плазмиды, используя рекомбинантную плазмиду pR 12, для получения прямой экспрессии ФНО в Е.cali используя 2а в качестве промотора.

Сначала переваривают 10 мкг плазмиды

pR 12 10 ед.Ара1 при 37 С в течение

2 ч, затем проводят электрофорез на

4%-ном полиакриламидном геле, чтобы выделить фрагменты 630 п.Оо Изолируют электроэлюцией из геля около lмкг фрагмента. Синтезируют дваолигодеоксинуклеотщ а:САТССАТСТСАССТТСТСССССС-3 . Ф и 5 -ССАЬАА(3СТ6АСАТС-3 .Затем фосфорилируют каждый 5 -конец олигодеоксинуклеозидов (около 100 ммоль), используя Т ц полинуклеотидиназу. После завершения реакции экстрагируют реакционную смесь фенолом, а затем

-8

17

1630602 хлороформом. Затем смешивают полученные синтетические олигомеры с 0 5 мкг

ApaI фрагментом 630 п.о. и осаждают этанолом. Фрагмент лигируют с синтео 5 тическими олигомерами при 4 С, используя 10 ед. Т ДНК-лигазы. После завершения реакции реакционную смесь осаждают этейолом и перемешивают с

20 ед. Baml при 37 С в течение 3 ч, затем проводят электрофорез на 4/ном полиакриламидном геле для извлечения электроэлюцией фрагмента 670п.о, Переваривают 1 мкг плазмиды pUC-8 с помощью BamHI и экстрагируют фенолом, а затем хлороформом, затем осаж-дают этанолом для получения вектора

Связывают 0 5 мкг полученного вектора с полученным фрагментом, имеющим

BamHI участок на обоих концах, содер- 20 жащим около 670 п,о, и кодирующим

ФНО, используя Т4 ДНК-лигазу, Трансформируют Е.cali используя полученный вектор, и культивируют на агаровой среде, содержащей 1 мМ ИПТГ и 25

0,004 мас.Х/объем Х-гал для получения около 200 белых колоний. Выделяют плазмиду ДНК из 100 таких трансформантов и переваривают ВашНЕ. В результате выявлено, что 15 плазмид со- 30 держат указанный BamHI фрагмент (около 670 п.о.), Дпя того, чтобы исследовать направление вставки, переваривают более 15 плазмид EcoRI, имеющих только один распознаваемый участок на его pUC-8, и 11 плазмид, имею35 щих только один распознаваемый участок на его участке фрагмента (примерно 670 п.о.), проводят электрофорез на 6/-ном полиакриламидном геле. 40

В результате определяют, что 7 плазмид имеют указанный фрагмент, состоящий из примерно 140 п.о., и что направление транскрипции Еас промотора Hà pUC-8 находится в соответствии 45 с тактовым для олигодеоксинуклеотидов, кодирующих ФНО.

Анализ последовательности ДНК показывает что эти семь плазмид имеют ту же самую последовательность и имеют желаемую нуклеотидную последовательность при -сопоставлении с lac-промотором синтетической ДНК и кДНК.

Конструирование других плазмид проводят с использованием плазмиды

pR 17, чтобы получить прямую экспрессию ФНО в Eocoli используя lacUV-5 в качестве промотора. Сначала переваривают 10 мкг плазмиды pR 1710 ед.

ApaI при 570С в течение 2 ч, проводят электрофорез на 4 -ном полиакриламидном геле, чтобы выделить фрагмент, состоящий из примерно 630 п.о. Электроэлюцией выделяют около 1 мкг фрагмента. Таким же образом, как в стадии 10, синтезируют два олигодеоксин клеотида:5:-ААТТСАТСТСАССТТСТСССССС3 и5 -CGAGAAGCTGACATG-3 . Затем фосфорилируют каждый 5 -конец обоих олигодеоксинуклеотидов (около 100 пмолей) используя ТЧ полинуклеотидкиназу.

После завершения реакции экстрагируют реакционную смесь фенолом, а затем хлороформом. Затем смешивают синтетические олигомеры с 0,5 мкг заранее полученного ApaI фрагмента (около

630 п.о.), полученного из плазмиды

pR 17 и осажденного этанолом. Фрагмент лигируют с синтетическими олигомерами при 4 С в течение ночи, исо пользуя 10 ед.ТЧ. После завершения реакции реакционную смесь осаждают этанолом и переваривают 20 ед.EcoRI при 7ОС в течение 3 ч. Затем проводят электрофорез на 4%-ном полиакриламидном геле, чтобы извлечь фрагмент (около 670 п.о.) с помощью электро3 JlIOIJии о

Получают плазмиду рОР95-15.

Переваривают l мкг рОР95-15 с помощью EcoRI и экстрагируют фенолом, а затем хлороформом, потом осаждают этанолом, чтобы получать вектор.

Используя Т ДНК-лигазу, связывают

0 5 мкг вектора с фрагментом (около

670 п.о.), полученным при связывании синтетического олигонуклеотида с олигонуклеотидом, кодирующим ФНО. Трансформируют Е,coliJN101 (АТСС 33876), используя полученный вектор, и культивируют на среде, содержащей 1 мМ

ИПТГ и 0,004 мас. ./объем Х-гал, чтобы получить примерно 150 белых колоний.

Готовят плазмиду ДНК из 100 этих колоний и переваривают EcoRI. В результате обнаружено, что 12 плазмид содержат заданный EcoRI фрагмент (около 670 п.о ). Для того, чтобы проверить направление вставки, переваривают более 12 плазмид PVUH иРз Е и проводят электрофорез на 1,5%-ном агарозном геле. В результате определено, что четыре плазмиды имеют желаемые фрагменты (около 1280 п.о. и около 2600 п.о.) и что направление транскрипции lac UV5 промотора

1630602

19

Число мьш ей, которые полностью избавились от опухоли

Число мьией, использованных в испытании согласуется с таковым олигодеоксинуклиотидов, кодирующих ФНО.

Анализ основной последовательности показал, что эти четыре плазмиды имеют ту же последовательность, что и lac UV5 промотор, синтетические олигодеоксинуклеотид и кДНК должным образом объединены друг с другом.Полученные плазмиды обозначают pTNF—

lас UV.5-I.

Культивируют штаммы Е.coli содержащие плазмиды, полученные в примере 16, в 50 мл ЛБ-среды, содержащей ампициллин, в течение ночи. Затем штаммы переносят на 5 л ЛБ-среды, содержащее 100 мкг/мл ампициллина, и продолжают культивировать при 37 С в течение 3 ч. Добавляют туо да изопропил Р -Д-тиогалактопираноPезультаты показаны в табл.3.

Пример 2. Колонии Е.coli К-I 2 ) штамма МС1061 трансформируют каждой из pR18, рВ 2-7, рН 2-2 плазмид. Вчастности, колонии Е. coli К 12 штамм . NG1061 культивируют на ЛБ-среде до тех пор, пока оптическая плотность культурального бульона не достигнет 0,3 при 550 мм. Собирают 50мп выросшей культуры Е. coli, про- мывают 25 мл смеси, содержащей 10 мМ

МОПС (рН 7,0) и 10 MM КвС1 и снова суспен- дируют в смеси, содержащей 0,1 М МОПС (рН

6,5), 50 мМ СаС1, и 10 мМКвС1. Полученную| суспензию охлаждают на льду В тече 40 ние 30 мин, центрифугируют и суспендируют в 2 мл смеси, содержащей 0,1 M

МОПС (рН 6,5), 50 мМ СаС1 и 10 мИ

ВвС1 и 30 мкл ДМСО. К 200 мкл (аликвота) полученной суспенвнн отнепвно прибавляют 1О мкл раствора ДНК каждой плазмнды, Каждую из полученных смесей охлаждают на льду в течение 30мин, а затем нагревают в течение 60 с при

44 С, Сразу после этого добавляют

5 мл предварительно подогретой до

37 С ЛБ-среды к каждой из нагретых о смесей, затем инкубируют при 37 С в течение 1 ч. Полученный культуральный бульон центрифугируют для образования шариков клеток. Надосадочный слой

- 55 отбрасывают, добавляют ЛБ-среду и пе" ремешивают для повторного суспендирования каждого из клеточных шариков. зид до конечной концентрации 1 MM.

Продолжают культивирование еще 6 ч, затем охлаждают. Затем штаммы собирают центрифугированием. Штаммы вносят в 5 л 0,04 м трис-НС1-буферного раствора (рН 7,8) и разрушают озвучиванием, чтобы получить раствор белка штамма. Полученный раствор обладает цитотоксической активностью против Ь-клеток 5-10 ед/л.

Раствор очищают, чтобы получить

1,2 10 ед/ФНО. Удельная активность

ФНО составляет 6,8-10 ед./мг.

Образец (0,2 мл) ФНО подвергают оценке в анализе in vivo.

Через 20 дней после инъекции образца наблюдают за развитием опухоли и определяют дозу извлечения по следующему уравнению:

Каждую из полученных суспензий инокулируют на пластину с ЛБ-агаром, содержащим 30 мкг/мл тетрациклина, затем инкубируют в течение ночи при.

37 С. В результате получают колонии устойчивых к тетрациклину трансформантов, каждый из которых трансформирован плазмидой pR 18 ° рВ 2-7 или рВ2-2.

Каждый из трансформантов, трансформированный плаэмидами рВ 2-7 или

pR 18, выращивают и амплификации плазмиды собирают, лидируют трансформанта и сушат плазмидную ДНК, Иллюстративно устанавливают, что каждый из трансформантов инокулируют в ЛБ-среду, содержащую 30 мкг/мл тетрациклина, и инкубируют при 37 С при энергичном встряхивании. Эту стадию повторяют, чтобы достичь роста трансформанта и амплификации плазмиды. Культивированный трансформант собирают центрифугированием при 4000g в течение 10 мин при 4 С. Надосадочнйй слой отбрасывают. Полученный шарик промывают в 100 мл охлажденного льдом

GTE (0,1 M NaC1, 10 мМ трис-HCl рН7,8 и 1 мМ ЭДТА), проводят лизис при кипячении в растворе 20 мг/мл лизоцима в 10 мМ трис НСl рН 8,0. Вязкии продукт переносят в трубку ультрацентрифуги и центрифугируют при

21

22

1630602

25000 об/мин в течение 30 мин при

4 С.для получения раствора ДНК. Измеряют объем раствора ДНК. На каждый

1 мл добавляют точно 1 г твердого

5 хлористого цезия и тщательно смешивают до тех nop,пока. вся соль не растворится. Прибавляют 0,8 мл раствора этидий бромида (10 мг/мл в Н О) на каждые 10 мл раствора хлористого цезия. Окончательная плотность раствора равна 1,55 г/мл, а концентрация этидий бромида составляет примерно

600 мкг/мл. Раствор хлористого цезия переносят в трубку, подходящую для центрифугирования, а остальную часть трубки заполняют легким парафиновым маслом. Центрифугирование проводят при 45000 об/мин н течение

36 ч при 20 С для получения двух полос ДНК (верхняя полоса состоит из линейной бактериальной ДНК и nicker циркулярной плазмидной ДНК, а нижняя полоса состоит из замкнутой циркулярной плазмидной ДНК). Нижнюю по- 25 лосу ДНК собирают н стеклянную трубку через гиподермическую иглу, вставленную в боковую стенку трубки, Удаляют этидий бромид и диализуют водную фазу против ТЕ-буфера. Раст- 30 вор ДНК плазмиды обрабатывают РВКазой и экстрагируют равным объемом уравновешенного фенола. Водную фазу наслаивают на колонку Био-Гель А-150, уравновешенную ТАЕ (pH 8,0) и О,l

СДС, ДНК в колонке промывают и используют для сбора фракций резервуар

ТЕ с 0,1/ СДС, Фракции осаждают этанолом чтобы получить чистую ДНК плазмиды, 40

При проведении указанных процедур получают 250 мкг чистой ДНК плазмиды рВ 2-7 и 134 мкг чистой ДНК плазмиды

pR 18.

Берут 40 мкг ДНК плазмиды рВ 2-7, 45 переваривают Рв ? рестракционным ферментом и подвергают электрофорезу на

4 -ном акриламидном геле. После электрофореза ДНК окрашивают и вырезают желаемую полосу деления.

Используя 500 мг изолированной вставки Pstl, проводят ник-трансляцию. Для ник-трансляции вносят

80 пмоль радиоактивного dOTP и 25мкл реакционной системы (при 400 Ки/

/ммоль), К смеси, состоящей из

2,5 мкл раствора А (раствор йНТР)„, 2,5 мкл раствора В (500 нг испытуемой ДНК, а именно вставки Pstl), ф

1,3 мкл холодной dCTP (65 пмоль, 50 пмоль/мкл ИСТР) и 11,2 мкл раствора Е (Н О) прибавляют 2,5 мл раствора 1 (ДНК-аза -1, ДНК-полимераза I) и проводят реакцию при 15 С н тече-о ние 60 мин. Затем прибавляют раствор

Р (стоп-буфер) н реакционной смеси для прекращения реакции, далее прибавляют носитель тРНК, дважды осаждают зтанолом и растворяют в 500 мкл воды. Удельная активность на 1 мкг

ДНК составляет 9,3 ° 10" кпм.

Переваривают 80 мкг ДНК плазмиды

pR 18 рестрикционным ферментом RSal и проводят электрофорез на 4/-ном полиакриламидном геле. Следующие целевые полосы вставки вырезают и очищают с помощью колонки: около

640 п.о. — 3,77 мкг (извлечение 52/); около 175 п.о, — 1,77 мкг (извлечение 50/).

Вставка выше примерно 640 п,о ° обозначена 3-фрагментом pR 18 р 18 (означает 3-нетранслируемую область

pR 18), а вставка выше примерно

175 п.о, обозначена pR 18 с (означает кодирующую область pR 181.

Кроме того, повторяют приведенные процедуры, используя Pstl u Mstll рестрикционные ферменты вместо рестрикционного фермента Psal, чтобы получить следующую полосу: около 450п.о.

3,65 мкг (извлечение 60%). Приведенную вставку обозначают как 5-фрагмент pR 18.

Используют P-меченую вставку плазмиды рВ 2-7 в качестве гибридизующего зонда, чтобы скринировать

10 бляшек бактериофага Чарон 4А/человеческий геномный набор, полученных путем вставки в участок связывания Чарон 4А EcoRI фрагментов переваренной человеческой ДНК. Используют метод гибридизации бляшек, Поскольку не все бактериофаги в исходной культуре содержат необходимый генетический материал для приготовления человеческого ФНО, используют зонд, который имеет основную последовательность, комплиментарную гену ФНО кролика. Бляшки ДНК-фага, имеющие желаемый генетический материал, включающие радиоактивный зонд, являются идентичными по своей радиоактивности. Из набора изолируют девять гибридизированных бляшек.

Процедуры и условия являются следующими.

1630602

23

40

l. Число бляшек 1 ° 10 (4il0" бляшек на 150-миллиметровую пластину у 25).

2. Перенос на нитроцеллюлозные фильтры.

3. Гибридизация: добавление зонда-вставки 1,25 10 кпм/мл рВ 2-7, 42 С, 19,5 ч.

4. Промывка: 2 к SSC - О,l СДС

10 при комнатной температуре, погружение 10 мин х 4, 1 х SSC — 0,1Х СДС при

50 С, погружение 30 мин 2.

5. Экспозия: XAR-5 "80 С 39 ч.

В приведенном скрининге получают

12 штаммов-кандидатов. Проводят второй скрининг. Далее, используя эти штаммы, проводят третий скрининг таким же образом, как упоминалось, чтобы получить девять штаммов, содер20 жащих требуемый фрагмент. Используя полученные штаммы, проводят четвертый скрининг, чтобы подвердить, что девять штаммов содержат требуемый фрагмент. Полученные девять бактериофагов, содержащие требуемый фрагмент, обозначают HG-1 -HG-9 соответственно

Используют 10 бляшек бактериофага Чарона 4А (геномный набор кролика, который получен с использованием переваренной ДНК кролика вместо переваренной человеческой ДНК. Используют

6,7 10 бляшек бактериафага Чарон

4А (геномный набор кролика) вместо

106,бляшек бактериофага Чарон 4А (ге" номный набор человека). Таким образом, получают два бактериофагных штамма (RG-1 и RG-2), содержащих геномный набор ФНО гена кролика.

Получают ДНК HG-3, HG-6, HG-7 каждого бактериофага, Суспендируют б 10 клеток E.coli

<о

LE 392 в 18 мл CM н прибавляют 3 10

yF и бактериофага и заражают Е.coli при 37 С в течение 20 мин. Затем полученную смесь прибавляют в 3 л Н Зет бульона и встряхивают культуру при

37 С в течение 23 ч. Прибавляют к о смеси 60 мл СНС1 и проводят встряхивание еще 30 мин. Добавляют в смесь хлористый натрий до конечной концентрации 1 М, смесь отстаивают 15 мин, затем центрифугируют, получая надоса- дочный слой Затем к смеси прибавляют полиэтиленгликоль (мол,м. около 6000), 55 чтобы концентрация полиэтиленгликоля стала 10 мас.Х/объем, и оставляют стоять при 4 С на 22 ч. Бактериофаги собирают центрифугированием. Полученные бактериофаги суспендируют в 28 мл

CM и прибавляют равный объем CHCl .

После перемешивания в течение 30 с смесь центрифугируют, получая водную фазу. К водной фазе прибавляют CM чтобы общее количество стало 30 мл.

Прибавляют 26,4 r СНС1 к полученной смеси и осторожно растворяют, затем приводят ультрацентрифугирование (45000 об/мин 20 ч),,чтобы получить бактериофаги в виде полосы. Полученную смесь, содержащую бактериофаги, диализуют против 10 мМ NaC1 — 50 мМ трис (рН 8) — 10 мМ MgClz. Затем к смеси прибавляют ЭДТА,,протеинаэу К и СДС, чтобы их концентрации были соответственно 20 мМ, 50 мкг/мл и

0,5 мас. /объем. Затем смесь обрабатывают при 65 С в течение 1 ч и эксо трагируют фенолом, смесью фенола и

СНС1 (1:1 по объему), а затем CHCl>.

Полученную водную фазу диализуют против 10 MM трис (рН 8) — 1 мМ ЭДТА.

Поглощение водной фазы в УФ-спектре показывает, что получена чистая ДНК бактериофага HG-3.

Повторяют практически ту же самую процедуру, что описана для получения

ДНК бактериофага HG — 3 и ДНК бактериофагов HG — 6 и HG - 7.

Пров одя т бл оттинговый анализ Сау- . терна полученных ДНК, Процедуры и условия являются следующими.

1. ДНК: HG-3 825 нг каждый; HG-б

935 нг каждый; НС-7 685 нг каждый.

2. Переваривание различными рестрикционными ферментами: 10 ед. ВапНТ+

+ 10 ед. EcoRI; 10 ед. BamHI + 10ед.

EcoRI; 10 ед, HindIII; 10 ед. HindIII

+ 10 ед. EcoRI; 10 ед. PVU II; 37 С, 3 ч.

3. Электрофорез: 0,8Х-ный агарозный гель, ТАЕ, 28 в, 15,5 ч.

4. Перенос на нитроцеллюлозные фильтры.

5. Прегибридизация: 30 мл ФДСО, 42оС, 6 ч

6. Гибридизация: 5 -фрагмент (1 ° 10 кпм/мл) pG18, 42ОС, 14 ч.

7. Промывка; 2A SSC — 0,1Х СДС при комнатной температуре, погружение 10 мин 8 4, 1 SSC — О, l СДС при

50 С, погружение 30 мин х 2 ° о

8. Экспозиция: XAR-5, -80 С, 2 интенсифицированных скрининга, 14 ч.

1630602

Результаты гибридизации приведены в табл.4.

Проводят блоттинговый анализ по

Саутерну. В результате обнаружено, что 5 -фрагмент pG 18 гибридизуется с одной полосой фрагмента из фрагментов, которые получены расщеплением

RG-1 и RG-2 с каждой Bam HI, ЕсоК1, HindIII, Bg1III и Fam HI+EcoRI.

Используют метод Лэнди. Перева— ривают 33 мк ДНК HG-3 EcoRI при 37 С в течение 3 ч. Перевар подвергают электрофорезу íà 1Х-ном низкоплавком агарозном геле (условия; ) х ТАЕ, 20 в, 14,5 ч). Полосу 2,9 п.о. изолируют из агарозного геля. В частности, вырезают участок геля с полосой 2,9 п.о. и нагревают при 65 С в течение 15мин, Z0

-0

Извлекают из расплавленного геля

EcoRI — расщепленный HG-Ç, имеющий длину 2,9 п.о. 1здесь и далее называемый как "HG" EcoRI 2,9 п.о. фрагмент) путем трехкратной экстракции 25 фенолом, а затем трехкратной экстракции эфиром, затем осаждают этанолом, содержащим ацетат аммония, Таким образом получают 637 нг (выход около

301) HG 3 EcoRI 2,9 п.о. фрагмента.

Связывают 255 нг полученного фрагмента с.56,5 нг расщепленной EcoRI, используя 2,5 ед. Т4 лигазы при 4 С в течение 20 ч.

Трансформируют Е.coli К 12 штамм

JM83, используя полученный продукт связывания. Конкретно культивируют

Е.coli К 12 штамм JM83 на ЛБ-среде до тех пор, пока оптическая плотность культурального бульона не до- 40 стигнет 0,3 при 550 нм. Собирают

50 мл растущей культуры E.coli К 12 штамм JM83 промывают 25 мп 10 мМ

МОПС (рН 7,0) — 10 MM NaC1 и повторно суспендируют в 25 мл 0,1 M МОПС (рН 6,5) — 50 мМ CaC1< - 10 мИ КвСХ.

Суспензию охлаждают на льду в течение 30 мин, центрифугируют и повторно суспендируют в смеси 2 мл О,1 M

МОПС (рН 6,50) — 50 мМ СаС1 — 10мИ

КвС1 и 30 мкл ДМСО. Прибавляют к

203 мкл суспензии 10 мкл водного раствора продукта лигации, содержащего

10 кг продукта лигации. Смесь охлаждают на льду в течение 30 мин, а затем нагревают при 40 С в течение

60 со Сразу после этого к нагретой смеси прибавляют 5 мл предварительно подогретого до 37 С ЛБ-бульона,заО тем инкубируют при 37 С в течение

1 ч. Полученный культуральный бульон центрифугируют и отбрасывают надосадочный слой. Прибавляют ЛБ-среду к полученному шарику клеток и затем инокулируют ЛБ-пластину, содержащую

30 мкг/мл ампициллина и 40 мкг/мл

Х-гал. Колонии, содержащие Е,coli

К 12 штамм JM83, которые трансформированы плазмидами, имеющими вставку, являются белыми, тогда как колонии, содержащие Е.coli К 12 штамм JM83, которые трансформированы только плазмидой, являются голубыми. Полученными белыми колониями снова инокулирунт ЛБ-пластину, содержащую 30 мкг/мл ампициллина и 40 мкг/мп Х-гал, для подтверждения.

Из полученных белых колоний отбирают десять колоний (бактериальные клоны) и скринируют их, используя мини-препаративную технику.

В частности, каждую колонию культивируют в течение ночи на ЛБ-среде, содержащей 30 мкг/мл ампициллина.

Собирают растущие клетки и суспендируют в растворе, содержашем 2 мг/мл лизоцима, 50 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА, 25 мИ трис-НС1 (рН 8,0).Суспензию отстаивают при комнатной температуре в течение5 мин, затем добавляют

200 мкл 0,2 н. NaOH-1Я СДС. После медленного перемешивания суспензию оставляют стоять при комнатной температуре на 2 мин. После этого добавляют 150 мкл 3 М ацетата натрия о (рН 5,2), оставляют стоять при -20 С в течение 10 мин, затем центрифугируют в течение 15 мин для извлечения полученного надосадочного слоя. К надосадочному слою прибавляют 900 мкл холодного этанола, затем центрифугируют 5 мин для получения осадки. Полученный осадок промывают 70У.-ным этанолом и сушат, чтобы получить плазмиду ДНК. В описанном способе получают десять плазмид ДНК.

Каждую плазмиду растворяют в 10 мИ трис-0,1 мМ ЭДТа (рН 8,0), перемешивают EcoRI и подвергают электрофорезу для рестрикционного анализа. Условия переваривания и электрофореза следующие.

Переваривание: раствор плазмиды

ДНК, одна пятая количества, полученного выше; KcoRI, 3 ед.; 37 С; 1,5 ч.

Электрофорез: 17-ный агарозный гель; 1 х ТАЕ; 120 в; 2 ч.

1630602

27

Указанный рестрикционный анализ показывает, что восемь из десяти клонов являются положительными. т.е. восемь клонов имеют 2,9 п..а, фрагмент. Из восьми положительных клонов отбирают один клон и обозначают Е.

E.coli К 12 штамм JM83 (pHGE) (АТСС

39656).

Получают 1,89 мг pHGE ДНК, с тем исключением, что используют Е.coli

К 12 штамм JM 83 (pHGE) вместо Е.coli рН 2-7 и pR 18.

Переваривают 30 мкг RG-1 с помощью

EcoRI. Из полученной смеси фрагментов извлекают фрагмент, имеющий длину около 3 5 п,о., но с тем исключением, что используют приготовленную смесь фрагментов и 0,87-ный низкоплавкий агарозный гель. Получают

1,0 мкг RG-1 фрагмента, расщепленного EcoRI (около 3,5 п.о.). Связывают полученный расщепленный EcoRI фрагмент RG-1 (3 ° 5 п.о.)c pUC13 переваренной FcoRI используют полученный расщепленный ЕсоКХ фрагмент (3,5 п.о.) вместо расщепленного

EcoRI фрагмента HG-3 (2,9 п.о.).

Производят трансформацию Е.coli

К 12 штамма JM83 и скринирование бактериальных клонов. Полученный клон обозначаит как Е.coli К 12 штамм

JM 83 (pRGE) (ATCgC 39655).

Получают 1,70 мг pKGE ДНК с тем исключением, что используют Е.coli

К 12 штамм ДМ83 (pRGE) вместо рН 2-7 и pR 18.

Проводят рестрикционный ферментный анализ ДНК pHGE.

Процедуры и условия следующие.

1. Переваривание ДНК рHGE с помощью EcoRI: 18,6 мкг ДНК pHGE, 64 ед. FcoKI 37 С, 2 ч, 2. Осаждение этанолом: осаждается, 3. Добавление дистиллированной воды для осаждения: приготовление раствора 1 мкг/мл EcoRI-расщепленного

pHGE.

4. Переваривание различными рестрикционнымн ферментами: 1 мкг р HGE/Есо KI, Рестрикционные ферменты: 5 ед.

Pvu l1,5 ед. Pvu 11+ 10 ед.Psal, 10 ед.

Psal, 4 ед. Nst 11 3 ед. Aval, 9 ед.

РзИ37С,2ч.

5. Электрофорез: 2Ж-ный агарозный гель, 1 М ТЛЕ, 28 в, 14,5 ч.

6. Перенос на нитроцеллюлозный фильтр.

7. Первая прегибридизация: 30 мл

ФДСС, 42 С, 6 ч.

8. Первая гибридизация: 5-фрагмент (5 ° 10 кпм/мл) pR 18 (получена на стадии 4), 42 С, 14 ч, 9. Промывка: 2

111. Экспозиция: XAR-5 ° -80 С, 2 интенсивных скрининга, 17,5 ч.

11. Отмывка:0,5 М NaOH 1,5 М NaC1 (погружение 1 мин), 0 ° 5 M трис—

1,5 M NaCl (погружение 1 мин), Зк$БС (погружение 1 мин) °

12. Экспозиция: время экспозиции составляет 19 ч.

13. Вторая прегибридизация.

14. Вторая гибридизация: вставка рВ 2-7 (получена на стадии 3), 43 С, 16,5 ч.

15. Промывка.

16. Экспозиция: время экспозиции

25 составляет 19 5 ч.

17. Отмывка.

18. Экспозиция: время экспозиции составляет 20 ч.

19. Третья прегибридизация; 3—

° I

30 фрагмент (4,5 10 кпм/мл), pR 18, 42ОС, 15 ч.

21. Промывка.

22. Экспозиция.

Пример 30. Рестрикционный ферментный анализ ДНК-плазмиды pRGE.

Осуществляют рестрикционный ферментный анапиз ДНК-плазмиды pRGE, Используют Е.coli К 12 штамм

JM83 (pHGE) и E.coli К 12 штамм ЗИ83

40 (pRGE) вместо Е.coli К 12 штамм MC

МС01061, имеющий рВ 2-7,,и Е.coli

К 12 штамм МС1061, имеющий pR 18. Таким образом получают 150 мкг каждой

ДНК-плазмиды pRGE и ДНК-плазмиды

45 рНСЕ.

Определяют основные последовательности pRGE и pHRGE, Последовательность pR 18 сравнива50 ют с таковой для pRGE, чтобы разъяснить структуру, включая экзон и интрон, гена ФНО кролика. Затем основную последовательность pRGE сравнивавт с таковой для pHGE, чтобы изучить гомологию и согласованную последовательность вокруг границы между

55 интроном и экзоном. Таким образом выясняют структуру, включая зкзон и интрон, гена человеческого ФНО.

1630602

Последовательность, кодирующая ФНО кролика и ФНО человека, показана ниже. В основных последовательностях верхний ряд показывает основную последовательность, кодирующую ФНО кролика (R), а нижний ряд — основную последовательность, кодирующую ФНО человека (Н):

R QCA AAC CCG CAA GTG GAG GGC CAG СТС CAG TGG CTG AGC CAG CGT

Я GCA AAC ССТ CAA GCT GAG GGG CAG СТС CAG TGG CTG AAC CGC CGG

R GCG AAC QCC CTG CTG CGC AAC GGC ATG AAG СТС ACG GAC AAC CAG

Я GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG

CTG GTG QTG CCG GCC GAC GGG CTG TAC СТС ATC TAC TCC CAG GTT

Я CTG QTQ QTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC ТСС CAG GTC

R CTC TTC AGC GGT СРА GGC TGC CGC ТСС --- TAC GTG СТС CTC ACT

H СТС TTC AAG GGC CAA GGC TGC ССС TCC ACC CAT GTG СТС СТС ACC

R CAC ACT GTC AGC CGC ТТС GCC GTC ТСС TAC CCG AAC AAG GTC AAC

Я CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC ТСС TAC CAG АСС ЖЖ GTC AAC

СТС СТС ТСТ GCC ATC AAG AGC ССС TGC CAC CGG GAG ACC ССС GAQ

Я СТС СТС ТСТ GCC ATC AAG AGC ССС TGC CAG AGG GAG ACC CCA, GAG

R ОМ QCT QAG ССС ATG GCC TGG TAC GAG ССС АТС TAC CTG 6СС GGC

Я GQQ QCT ВО GCC AQ ССС TGQ ТАТ GrsG CCC ATC ТАТ CTG GGA GGG

Ф

R QTC ТТС CAG TTQ GAG AAG GGT GAC CGG СТС AGC ACC GAG GTC AAC

Я 6ТС ТТС СЛО СТО СА6 ЪАО 66Т ба СбА СТС АСС ССТ СЛ6 ЪТС ЛАТ

R CAQ.ССТ САО TAC CTG GAC CTT GCC GAG TCC GGG CAG GTC TAC ТТТ

Я CGG ССС GAC TAT СТС GAC TTT GCC GAG ТСТ GGG CAG GTC ТЛС ТТТ

R GQG ATC ATT GCC CTG

Я QGG АТС АТТ GCC CTG

В реакционный реактор на 500 мкл из нержавеющей стали с фильтрами из нержавеющей стали на каждом его конце помещают 20 мг полистирольной смолы, с которой связано сукциантной связью 2,0 мкМ нуклеозида. Смолу обрабатывают бромидом цинка (1 i!) в смеси метиленхлорида и изопропанола

85:)5) для удаления диметокситритильной (ДМТ } защищающей группы, промывают диметилформамидом, пиридином и ацетонитрилом, сушат в токе азота.

К высушенной смоле прибавляют раствор

20 мкМ ДИТ-нуклеотида и 60 мкИ мезитиленсульфонилнитротриазола в 200 мкл пиридина. Проводят реакцию сочетания при 45 С в течение 20 мин. Повторяют

-о

45 этот цикл снятия защиты и сочетания для последовательных нуклеотидов до тех пор, пока на смоле не будет желаемый олигодеоксинуклеотид. Затем смолу обрабатывают для удаления с нее олигодеоксинуклеотида и очищают, Таким образом получают следующие олигодеоксинуклеотиды:

3 TCA GCT ТСТ CGG GCC CTG AGT GAC АЛС ССТ CTA.GCC САС GTA GTA

Я TCA TCT ТСТ CGA ACC CCG AGT GAC AAG ССТ GTA GCC CAT СТТ GTA.

32

1630602

51-ААТТСАСТСАТСТТСТССААСССССАСТСАСАА-3

3 -СТАСАСТАСААСАССТТСССССТСАСТСТТССС-5 ;

5 1-СССТСТАССССАТСТТСТАССАААСССТСААСС-3 ;

3 -ACATCGGCTACAACATCGTTTGGGAGTTCGACT-5 . (1) (2) (3) (4) 35

Переваривают 10 мкг плазмиды рНСЕ 20 ед. Есо I.Ïoñëå электрофореза на 1%-ном низкоплавком агарозном геле элюируют фрагмент 2,9 п.о.

Этот фрагмент вставляют во фрагмент

Есо I из репликативной формы М13мр9 фага. М13Мр9 фаг отбирают потому,что

I он особенно пригоден для получения фрагментов ДНК. Продукт трансформируют в Е.coli М103 БРЛ.

Готовят однониточнуи ДНК М13Мр9HGE.

Олигодеоксинчклеотид (4)

3 -АСАТССССТАСААСАТССТТТТСССАСТТССАСТ.--.20

5, полученный на стадии 14, используют в качестве делетора для интрона 3. Делетор для интрона 3 обозначают Е3-4. 25

Делетор ЕЗ-4 имеет основную последовательность, которая является комплиментарной основной последова- тельности оснований до (Екзон 3) и после (Экзон 4) интрона 3, который 0 должен быть деленирован. Проводят делецию интрона 3 следующим образом.

Фосфорилируют 164 нг (15 пмоль)

Е3-4 °, используя Т -киназу и прибавляют 3 мМ АТР, чтобы иметь шаблон

M13Mp9-HGE (1,65 мкг, 0,5 пмоль).

Реакционную смесь нагревают при 6УС, охлаждают до комнатной температуры в течение 5 мин и,наконец, охлаждают на ледяной воде.К dATP, dCTP, ЖТР, dTTP и АТР (0,4 MN) прибавляют 5 ед. фрагмента Кленова, 10 ед. Т -лигазы в Хин-буфере, 10 мМ трис-НС1 (рН 7,2), 2 мМ МоС1< и мМ (3-меркаптоэтанола.

Реакционную смесь (конечный объем

50 мкл) инкубируют 30 мин при 4 С, а затем 30 мин при комнатной температуре. ДНК из первичной реакции олигонуклеотида используют для трансфекции Е.cali JM103. Бляшки, полу" ченные этим путем, пикируют на УТ50 пластины. Полученные колонии гибриди" зуют при 55 t- в течение 2 ч с P -Меченым Е2-4. На этой стадии делектор используют в качестве зонда для идентификации последовательностей ДНК, имеющих соответствующую комплиментарную основную последовательность, после того, как был делецирован интрон. Фаг изолируют из этих колонии, которые гибридизуют с делетором.

Полученный фаг помещают на пластину и бляшки,,пикируют на УТ-пластины. Клонам дают гибридизоваться при

55ОС в течение 2 ч с P ìå÷åíûì

92

Е3-4. Получают положительные клоны и определяют аминокислотную последовательность ДНК-фага, чтобы отобрать тот фаг, у которого интрон 3 полностью делетиронен. Один такой фаг обозначают мр9-HGE 3-1.

Репликативную форму ир9- НСЕ ДЗ-1 переваривают EcoRI. Изолируют фрагмент FcoRI и клонируют в рВ 327 расщепленную EcoRI, чтобы получить плазмиду рНСЕ 3-1.

Конструирование другой плазмиды проводят, используя плазмиду рНСЕ З-1> чтобы получить такую плазмиду, кото1 рая будет непосредственно экспрессировать ФНО в E ° coli используя,lас

UV 5 в качестве промотора. Сначала переваривают 1О мкг плазмиды рНСЕаЗ-1

10 ед. Aval u EcoRI при 57ОС в течение 2 ч и проводят электрофорез на

4 -ном полиакриламидном геле, чтобы изолировать фрагменты. Электроэлюцией изолируют примерно I мкг фрагмента из геля. Синтезируют по методике стадии 14 два олигодеоксинуклеотида

5 -ААТТСАТСТСАТСТТСТССААС-3 и 5

TCGGGGTTCGAGAGAAGATGACATG-З, Затем фосфорилируют каждый 5 -ко-1 нец обоих олигодеоксинуклеотидов (около 100 пмолей), используя Т -полинуклеотидкиназу, После завершения реакции реакционную смесь экстрагируют фенолом, затем хлороформом. Затем полученные таким образом синтетические олигомеры смешивают с

0 5 мкг заранее полученного Ача1EcoRI фрагмента из плазмиды pHGE 3-! и осаждают этанолом. Эти фрагменты связывают при 4 С в течение ночи, исо пользуя 10 ед. Т -лигазы.

После завершения реакции смесь осаждают этанолом затем проводят электрофорез на 4/-ном полиакриламидном геле, чтобы извлечь фрагмент электрЬэлюцией.

1630602

Конструируют плазмиду рОР95-15.

Переваривают 1 мкг ðÎÐ95-15 EcoRI и экстрагируют фенолом, а затем хлороформом, потом осаждают этанолом, чтобы получить вектор. Связывают

0 5 мкг полученного вектора, используя Т+-ДНК-лигазу, с полученным фрагментом. В соответствии с процедурой

E.coli M101 (ATCC 33876) трансформируют, используя полученный вектор, и культивируют на агаровой среде, содержащей 1 мМ ИПТГ в 0,004 мас.%/

/объем Х-гал, чтобы получить около

100 белых колоний.

ДНК-плазмиды получают из этих трансформантов и переваривают EcoRI, чтобы идентифицировать эти плазмиды, содержащие целевой EcoRI фрагмент. Для того, чтобы исследовать направление вставки, эти плазмиды переваривают

PvuII u PstI и проводят электрофорез на 1,5%-ном агарозном геле, чтобы отобрать плазмиды, имеющие фрагмент около 1280 пар оснований и около 2600 25 пар оснований, указывающих, что направление транскрипции lacUV5 промотора согласуется с направлением олигодеоксинуклеотидов, кодирующих ФНО.

Анализ основной последовательнос- 30 ти показывает, что эти две плазмиды имеют одинаковую последовательность и что lacUV5-промотор и синтезиро-. ванные олигодеоксинуклеотиды и ДНК должным образом скомбинированы друг с другом. Полученная плазмида обозначена pHTNF-lacUV5-2.

Е.coli, содержащую pHTNF-lacUV5-2, культивируют на традиционной питательной среде. Биоанализ продукта на 40

ФНО-активность показывает почти такую же активность, какую получают с плазмидой pTNT-lacUV5-1 5-1 ° содержащей ген ФНО кролика, под контролем lacпромотора, Пример 35. Используя плазмиду pHGE и олигодеоксинуклеотиды (1)(4), готовят pHTNFlacUV5-1.

Пример 3 ° 1 ° Культивируют обычным методом E.coli содержащую плазмиду pHTFlacUV5-1. Для получе50 ния желаемого человеческого ФНО к полученной культуре добавляют 1 мМ

ИПТГ, чтобы вызвать индукцию, а затем инкубируют культуру для получения клеток Е.coli. содержащих ука55 занный человеческий ФНО. Клетки со° бирают центрифугированием, затем обрабатывают ультразвуком в 1 л 0,04 М трис-НС1-буфера (рН 7,8), в резуль-. тате чего получают экстракт клеток, содержащий указанный человеческий

ФНО.

Экстракт клеток имеет активность

4,5 1О и/или улельную активность

3,0 10 ll/ìã, Экстракт клеток наносят на колонку с ДЕАЕ-Сефарозой CL-6B, в достаточной мере уравновешенную 0,04 M трис-НС1-буфером (рН 8,0). Колонку промывают 0,04 M трис-НС1-буфера (рН 8,0), а затем проводят элюцию, используя 0,04 M трис-НС1-буфер (pH 8,0), содержащий 0,1 М NaC1, в качестве элюента. Фракцию, обладающую цитотоксической активностью против 1;клеток, концентрируют ультрафильтрацией, чтобы получить сырой раствор, имеющий удельную активность

4,0 10 И/мг.

Сырой раствор наносят на колонку с Сефакрилом 6-200, уравновешенную

5 мМ фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 0,15 М NaC1. Проводят гельфильтрацию при добавлении того же буферного раствора в колонку. Фракцию, обладающую цнтотоксической активностью против L-клеток, концентрируют ультрафильтрацией для получения очищенного раствора, обладающего цитотоксической активностью против

L-клеток 2,0 ° 10 П/мл и содержащего

5 человеческий ФНО, имеющий удельную активность 7,5 10 11/мг.

Очищенный раствор смешивают с разным объемом полного адъювакта

Фрейнда и эмульгируют для получения эмульсии. Полученную таким образом эмульсию вводят подкожно BAL В/с самцам мыши 3 раза с интервалом в 2 недели, чтобы осуществить иммунизацию мьгли. Количество введенной эмульсии составляет 0,2 мл введение-мышь. После 4 недель от третьего введения эмульсии мыши вводят 0,5 мл очищенного раствора, чтобы провести окончательную иммунизацию.

Через 3 дня после окончательной иммуниэации мышь умерщвляют и измельчают селезенку мьппи. Селезенку разрезают на кусочки, затем фильтруют под давлением, используя сетку из нержавеющей стали, для получения клеток селезенки. Затем клетки суспендируют в минимальной основной среде Игле для получения суспензии клеток селе36

1630602

40 зенки в МБМ. Клетки селезенки и клетки мисломы мышей (Р ) Х63-Ag3U1 каждые промывают МЕМ 3 раза и смешивают в соотношении 4:1, затем центрифуги-„ руют при 800 об/мин в течение 15 мин для получения осадка. К осадкам в центрифужной трубке постепенно прибавляют 2 мп 44Х объем/объем раствора полиэтиленгликоля 2000 в МЕМ для получения смеси. Центрифужную трубку, содержащую смесь, медленно вращают в о водяной бане при 37 С в течение 1 мин для проведения плавления клеток. Затем к смеси прибавляют 1 мл MEM и мед- 5 ленно вращают центрифужную трубку, содержащую смесь. К смеси затем прибавляют МЕМ в соотношении 2 мл/мин в таком количестве, что общий объем полученной в результате смеси становится 10 мл. После этого смесь центрифугируют при 600 o6/мин в течение

5 мин для получения осадка. Осадок суспендируют в среде Розевел. Парк

Мемериал Инститьют (здесь и далее 25 упоминается как "PIIMH"), содержащей

10 сыворотки новорожденного теленка, для получения суспензии, соцержащей клетки в количестве 7 10 клеток миеломы/мл. Суспензию инокулируют в каждое углубление пластины микротитратора с 96 углублениями в количестве 0,1 мл/углубление.

День спустя в каждое углубление добавляют 0,1 мл РПМИ 1640-10i СНТ среды, содержащей ГАТ (1 10 М ги7 поксантина, 4 10 М аминоптерина и

1,6 10 M тимидина)(здесь и далее упоминается как ГАТ-среда). После этого каждые 3 или 4 дня в каждом углублении заменяют половину среды свежей ГАТ-средой. Через 7 дней после добавления РПМИ 1640-10_#_ СНТ среды, содержащей ГАТ, наблюдают рост клеток гибридомы в нескольких уг- 45 лублениях и 2 или 3 недели спустя наблюдают рост клеток гибридомы почти во всех углублениях.

0,1 мл надосадочного слоя культуры в углублении, в котором наблюдают рост клеток гибридомы, помещают в каждое углубление пластины микротитратора с 96 углублениями, в которых зафиксирован челевеческий ФНО, и ос-. тавляют пластину микротитратора на

l ч при комнатной температуре. Клетки в каждом углублении промывают физиологическим раствором, содержащим

0 1Х сывороточного бычьего альбумина. К промытым прибавляют 10000-кратно разведенный раствор антимышиного

IgG, меченого периксадозой, в количестве 0 1 мл/углубление и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Затем клетки промывают физиологическим раствором, содержащим О,IХ сывороточного бычьего альбумина. К промытым клеткам прибавляют раствор субстрата (30 мг о-фенилендиамина, 7 мкл ЗОХ-ной водной перекиси водорода, 10 мп 0,1 M лимонной кислоты и 10 мл 0,2 М динатрийфосфата) в количестве 0,15 мг/углубление. 30 мин спустя измеряют поглощение в каждом углублении при

492 нм для установления углублений, содержащих клетки, продуцирующие антитело.

Клетки в каждом углублении, которые показывают высокую активность антила, отбирают, используя стеклянный капилляр, и клонируют для получения клоновь Клоны подвергают скринироваиию, используя в качестве критерия активность антитела, таким же образом,. как было описано, чтобы получить 2 клона, которые обладают высокой активностью антитела, а именно гибридную клеточную линию Н117С и гибридную клеточную линию НШ2Р.

Каждый из полученных клонов культивируют в PIIMH 1640 среде, содержащей IOX OHT для умножения клеток клонов, Затем собирают клетки клонов и суспендируют в РПМИ 1640 среде, содержащей 15Х СНТ и IOX диметилсульфоксида. Полученную таким образом суспензию хранят в жидком азоте.

Каждый 1 10 клеток обоих гибридомных клеток, полученных на стадии

4, инокулируют в брюшную полость мыши BAL В/с, которым заранее введено

0,2 мл пристана (2,6,10,14-тетраметилпенотедекана) интраперитопеально, чтобы получить асцитную жидкость.

Спустя 10 дней 3-5 мл асцитной жидкости собирают от мыши.

К 10 мл асцитной жидкости, полученной на стадии 5, прибавляют 2,66 r сульфата аммония (35Х насыщения) и

1 полученную таким образом смесь пере-, мешивают при 4 C в течение ночи, в о результате чего образуется осадок.

Осадок отделяют центрифугированием и наносят на колонку с ДЕАЕ-Сафарозой:

CL-6Б, уравновешенную 0,01 М фосфатного буфера (рН 8,0)i Колонку промывают тем же самым буфером, а затем

1630602 элюируют, используя 0,01 Г1 фосфатный буфер (рН 8,0), содержащий 0,2 М NaC1 в качестве элюента. Фракции, полученные снизу колонки, подвергают электрофорезу на полиакрю;амидном геле, чтобы определить фракции, содержащие моноклональное антитело. Получают 97 мг моноклонального антитела, продуцированного гибридной клеточной линией

Hll7C, и 199 мг моноклонального антитела, продуцированного гибридной клеточной линией НИ 2Р.

Определение подкласса проводят с использованием анти иного ХЗС

Н117С и НШ 2F принадлежат к классу

IgGl „

Очищенный раствор человеческого

ФНО разбавляют MEM культуральной средой, содержащей 1ОХ СНТ, для получения растворов, содержащих концентрации 20 и 200 g/мл. Два полученных моноклональных антитела разбавляют той же самой культуральной средой, чтобы 25 получить растворы соответствующих концентраций. Оба раствора помещают в каждое углубление пластины микротитратора с 96 углублениями в количестве

0,05 мл/углубление. После инкубирования при 37 С в течение 1 ч в каждое углубление .прибавляют 0,1 мл суспензии, содержащей 10 L-клеток/мл той же самой культуральной среды. После этого повторяют практически ту же са35 мую процедуру, что описана для опыта

in vitro для определения цитотоксической активности против L-клеток.

Одновременно также проводят исследование, в котором не прибавляют ни человеческого ФНО, ни моноклонального антитела, и исследование, в котором не прибавляют моноклонального антитела, но прибавляют человеческий ФНО.

Результаты приведены в табл.5, где указана доза удаления активности по величине, вычисленной из уравненияо

Оба моноклональных антитела полностью удаляют активность не человеческого ФНО при высоких концентрациях. При низких концентрациях HIII2F моноклональное антитело обладает более высокой дозой удаления, чем моно- 55 клональное антитело Н117С.

Применяют устройство для тонкослойного гель-изоэлектрического фокусирования для измерения изоэлектрических точек обоих моноклональных антител. Измерения проводят с использованием фармалита рН3-10.

Обнаружено, что моноклональное антитело Н117С и моноклональное антитело НШ2Е имеют изоэлектрические точки 6,7-7,0 и 6,2-6,5 соответственно.

Диализуют 50 мл водного раствора, содержащего 150 мг моноклонального антитела Hll 7С, против водного раствора, содержащего 0,5 Г1 NaC1 и 0,1 M карбоната натрия, прибавляют диализованный раствор антитела к 50 мл на" бухшей смолы Сефароза СЕ-4Â, активированной цианогенбромидом. Смесь осторожно перемешивают при 4 С в течение ночи дпя проведения реакции. После завершения реакции смолу хорошо промывают водным раствором, содержащим 0,5 M NaC1 и 0,1 Г1 карбоната натрия. Затем смолу смешивают с 50 мл

1 M водного этаноламина, осторожно перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч, в результате чего защищаются непрореагировавшие активные группы. Затем смолы хорошо промывают 8 М водной мочевиной и физиологическим раствором, чтобы получить смолы, связанные с моноклональным антителом .Н117С для использования в качестве адсорбента при аффинной хроматографии. !

Повторяют практически ту же самую процедуру, что описана для приготовления смол, связанных с моноклональным антителом HLII2F, Смолы, связанные с моноклональным антителом Н117С, служат для набивки колонки (2,5g 8 см) .

Пример 3.2. Е.cali содержащую плазмиду pHTNF — laclJV 5-1, культивируют традиционным образом и собирают клетки. Клетки лизируют в

2 л 0,02 М трис-НС1-буфера (рН 7,8)p в результате чего получают клеточный экстракт, содержащий человеческий ФНО. Экстракт имеет активность

5,2.10 11/мл, а содержащийся в нем человеческий ФНО имеет удельную активность 4,2 104 И/мл.

К экстракту прибавляют стептомицин в таком количестве, чтобы получить конечную концентрацию 0,7 мас.Х/

/объем для получения осадка нуклеиновых кислот. После удаления осадка

1630602

39

Результаты приведены в табл.8 вместе с результатами, полученными в примере 1

Формула и з о б р е т ения

1. Способ очистки рекомбинантного фактора некроза опухоли, включающий разрушение бактерий Escherichia coli, трансформированных рекомбинантной

ДНК с геном, кодирующим фактор некроза опухоли и имеющим следующую нуклеотидную последовательность:

УСУ, TCT TCT. Cgg ACC CCG AGT GAC AAG ССТ GTA GCC CAT GTT GTA

ДСЛ Д7iС Сст СдЛ. Сст GAG GGG CAG СтС CAG TGG CTQ AAC CGC CGG

GCC AAT GCC CTC СТС GCC AAT GGC С1С GAG CTG AGA GAT AAC CAG (."1 С 4* ТС С» 1 Л CCA 1 (P, (;y

CTC TTC AAG GGC САА GGC TGC (. 1 Г» l ÀC ("1 С И С ТАС Ъ С CAG И C

ССС ТОС АСС СЛт GTG СТС CTC ДСС

GTC TCC TAC CAG ACC AAQ СТС AAC

CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC

CTC. СТС TCT GCC ATC AAG AGC

ССС TGC CAG AGG GAG АСС ССА GAG

TAT GAG ССС АтС TAT CTG ОСА GGQ

GGG GCT GAG GCC AAG ССС TGG центрифугированием надосадочный слой наносят на колонку с ДЕАК-Сефарозой

СЬ-Е,уравновешенную 0,02 М трис-НС1буфером (рН 8,0). Колонку промывают

5 тем же самым буфером, а затем проводят элюцию, используя 10 мМ фосфатный буфер (рН 7,5) содержащий О,1 М хлористого натрия, в качестве элюента, чтобы получить сырой раствор (А), 0 имеющий удельную активность 3,90

Х 1 0 М/мг.

После установления рН б с помощью соляной кислоты сырой раствор А наносят на колонку с Голубой Сефарозой

С1гбВ, уравновешенную 10 мМ фосфатного буфера (pH 6,0), содержащего 0,1 М хлористого натрия. Колонну в достаточной мере промывают и после этого проводят элюирование,используя 10 мМ фосфатньпЪ буфер (рН 8,0}, содержащий

0,5 M хлористого натрия, в качестве элюента, чтобы получить фракцию, содержащую очищенный человеческий ФНО, Что касается экстракта, то в надоса- 25 дочном слое, полученном при удалении нуклеиновых кислот„ сыром растворе А и фракции, полученной колоночной хроматографией в соответствии с изобретением, удельную активность, сте- 30 пень извлечения и очистки определяют в соответствии с приведенными методиками. Результаты приведены в табл.б.

Пример 4. Сырой раствор А очищают с использованием колонки с моноклональным антителом,которой является колонка, заполненная смолой, связанной с моноклональным антителом.

Колонку уравновешивают 50 мМ фосфатного. буфера (рН 7,Я, содержащего

0,15 М хлористого натрия, и наносят на колонку сырой раствор А. После достаточной промывки проводят элюиро - вание с использованием 0,1 M глицина/ хлористого натрия (рН 10,0), в качестве элюента, чтобы получить фракцию, содержащую очищенный человеческий

ФНО, В полученной таким образом фракции определяют удельную активность, степень извлечения и очистки. согласно упомянутым методикам.

Результаты приведены в табл.7 вместе с результатами, полученными в примере 1, Пример 5. Повторяют практически ту же самую процедуру, что и в примере 1, с тем исключением, что используют отдельно Матрикс.Гель Ред А и

Матрикс Гель Ред В вместо Голубой (Блю) Сефарозы СЬ-6В в .результате чего получают фракции, содержащие очищенный человеческий ФНО.

В полученных таким образом фракциI ях определяют удельную активность, степень извлечения и очистки согласно приведенным методикам.

41 1630602 — CAG CTG GAG AAG GGT СЛС CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT

° °

ССС ССС GAC TAT.ÑTÑ GAC TTT ССС GAG TCT GGG СЛО GTC TAC ТТМ

GGQ ATC ATT GCC CTG, путем центрифугирования и ультразву- лиганда Green А, Cibacron, Blue 13вА, - ковой обработки в 2 л 0,02 М трис-НС1 Procion Red НРЗв, уравновешенным прос рН 7,8, нанесение клеточного зкст- тив 10 ммоль фосфатного буфера с ракта на колонку с ДЭАЭ-сефарозой, рН 6,0,,содержащего 0,1 М NaC1, проуравновешенной против 0,02 М трис- ведение гель-фильтрации с прибавлеНС1-буфера, промывание тем же буфе- нием того же буферного раствора и ром при рН 8,0, элюирование 10 ммоль концентрирование фракции, обладающей фосфатным буфером, содержащим 0 1 N цитотоксической активностью против

NaC1, при рН 7,5, нанесение раствора Ь-клеток, с помощьв ультрафильтрации, без дополнительной очистки на колон- 2. Способ по п,i, о т л и ч а ю- ку набитую сшитым агарозным гелем шийся тем, что фактор некроза

Э с ковалентно иммобилизированным кра- опухоли является полипептидом, имеюсителем с использованием в качестве 1цим следующую аминокислотную последовательность:

Ser Ser Ser. Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Чаl Ala His Ча1 Val

Ala Asn Pro Gln Ala G1u Gly Gin T.,eu Gln Тгр Ьеu Asn Arg Arg

Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln

Ьеи Val Чаl Pro Ser Glu Gly Leu Tyr I eu Xle Tyr Ser Gln Val

3 r!u Phe Ьуа Gly Gln Gly Суг Рз.о Яег Thr 11iã, Ча1 Leu Leu Thr

i His Thr Хlе Ser Arg Хlе Ala Va1 Ser Tyr Gln Thr Lys Чаl Asn Т,еп Ьеи Бег А1а Х1е Ьуз Яег Рко Сув С1и Лгу С1и Т11г Рго С1и

Ж.у Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Хlе Tyr Leu Gly Gly

Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly esp Arg Leu Ser Ala Glu Xle Asn

Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala G1u.Ser Gly Gln Val Tyr Phe

Gly Ile Ile Ala Leu, Таблиц °

G1u

Ь Л1а

Неc p cî

Аиннокнслотиак последовательКарбоксильный

Л1а

Аиинньо(G lu терминал терминал ность хсс стл xcc IAG xcG IAG IAG

G cAT GG нтс GGG нтс мтс с cAT NGG нтс ссс итс мтс

GC CAT ZGG ИТС AGC NTC ИТС

Gc слт ZGG нтс ссс мтс нтс

Gc cAT zGG итс TGc итс мтс з (3

I

З

I б

5 з( з

З( з з з и RNA

Зонд ИП

Зонд И!

Зонд н!

Зонд НК

Зонд Н!.

П р н и е ч а н и е. Х представлкет собой остаток рибонукленновон кислоты А, С, С нлн U; т — остаток рибонуклеиновой кислоты А или С(Н - остаток деокснрибонуклеиновой кислоты Т илн С; Н - остаток деоксирибонуклеиновой кислоты А или С; Z - остаток деоксирибонуклениовой кислоты А,С,С или Т.

1630602

Таблица 2

Цитотоксическая акOD 600

Число отожПпазмида венных пар оснований тивность против

L-клеток, ед/мл

1,369

1,605

1 364

1,618

1,458

1,438

1,514

1,677

35 (10 (10 (10

15, (10 (10 (10 рН 2-2 рВ 2-3 рВ 2-7

pR 9

pR 12

pR 18

pR 25 рВ згг

Таблица 3

Оценка .активности образцов после 1 дня

Доза извлечения после

20 дней

Количество мышей,использованИнжектированное количество ФНО кролика, продуцированного

E.coli, единиц-мышь ных в испы- + + ++ +++ . танин

2 ° 1ОКонтроль (физиологический раствор) 1 4 5/5

О О

Таблица4

Клон (бак- Гибридизация по величине фрагтериофаг) мента, п.о., с зондом (pR 18) Фермент

5 -конец

3 -конец

Bam HI

Bam HI

ЕcoRI

EcoRI

HindIII

FcoRI

HindIII

0,9

0,9

0,9

PVUI I

Л р и и е ч а н и е. Символ "а — — -" означает тот не самый гибридизуемый фрагмент.

HG-3

-6

-7

HG-3

-6

-7

НС"3

-6

-7

НЬ-3

-6

"7

HG-3

-6

-7

HG-3

-6

5 0 О О О/5

6,7

11,2

9,2

2,9

2,9

2,9

2,9

2э9

2е9

2,9

2,9

2 ° 9

9,7

4,1

9,7

2 ф2

1 9

2,2

1630602

Таблица 5

Концентрация физиологически

Концентрация моно

Доза удаления акВид моноклонального антитела клональнотивности, % го антитела,мг/мкл активного вещества, M/ìï

46

3,2

0,2

HlI7С

200

20

Н1112

93.

200

Таблицаб

Удельная Извлече- Степень активность ние, % очистки, U/ìã раз

Стадия

4,2 10

100

1,0

Культуральный экстракт

После удаления нуклеиновых кислот

После обработки ДЕАЕСефаоозой (сырой раствор А)

После обработки Блю

Сефарозой С1;6В

4,8 - 10 76

3,9 10 65

1,5 . 10 63

9,3

35,7

Стадия

Удельная активность, Ц/мг

39 ° 10 100 10

1,5 1О 90

l 4 10 55

3,6

Сырой раствор А

После обработки

Блю Сефарозой

С1 -6В

После обработки на колонке с моноклональным антителом

32

2,0

3,2

0,2

32 .2 0

Таблица 7

Извлече- Степень ние, % очистки, раз

47

1630602

Таблица 8

Степень

Удельная Извлечеактивность, ние, Х

П/мг

Стадия очистки раз

3,9 10

1,0

100

Сырой раствор А

После обработки

Блю Сефароэой

СЬ-6В

После обработки

Матрикс Гель

Ред А

После обработки

Матрикс Гель

Грин А

1,5 ° 10

3,8

1,4 ° 10

3,6

1,4 10

3,6

Составитель Н.Кузенкова

Редактор С.11ек арь Техред JI. Сердюков а Корректор М. Демчик

Заказ 1545 Тираж 474 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101