Способ конструирования рекомбинантной плазмидной днк, кодирующей фермент деацетоксицефалоспорин с синтетазу/деацетилцефалоспорин с синтетазу

 

Изобретение касается получения плазмид, кодирующих фермент с активностью деаДектосицефалоспорин С синтетазы и деацетилцефалоспориа.С синтетазы. Сконструированы рекомбинантные плазмидные ДНК , рТТ507, pLT511, pPS58, pPS359, pPSbO, pPS61, pPS62, pIL502, обеспечивающие экспрессию DAOCS/DACS в клетках Escherichia co- li, Penicillium chrysogenum и Cepha- losporum acremonium.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 М 15/52

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4355306/13 (22) 03.03.88 (31) 021836 (32) 04.03.87 (33) US .(46) 07.06.92. Бюл. ¹ 21 (71) Эли Лилли Энд Компани (US) (72), Томас Доминик Инголиа, Стефен

Виатт Квййер, Сьюллен Мэри Сэмсон и

Пол Латер Скэтрад (US) (53) 575.224.2; 577 ° 2(048) (088.8) Изобретение относится к генетической инженерии, касается получения . ппазмидных ДНК, кодирующих фермент с активностью деацетоксицефалоспорин С синтетазы (DAOSC) и деацетилцефалоспорин С синтетазы (DACS).

DAOCS катализирует реакцию, в которой из пенициллина N образуется (DAOS) и является экспандазой; DACS . катализирует образование деацетилцефалоспорина (DAS) и DACS по реакции гидроксилирования. Эти реакции являются основными этапами биосинтеза важных антибиотиков, таких как цефалоспорины из Cephalosporium acremo.nium и 7 g-метоксицефалоспорины из . Streptomyces c1avu1igerus.

Фрагмент ДНК, кодирующий активность DACS/DAÎCS, выделяют из геномной ДНК Cephalosporium acremonium и»

„„ЯЦ„„1739856 АЗ

2 (54) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК,КОДИРУЮЩЕЙ

ФЕРМЕНТ пЕАЦЕТОКСИЦЕФАЛОСНОРИН С СИН

ТЕТАЗУ/ДЕАЦЕТИЛЦЕФАЛОСПОРИН С СИНТЕТАЗУ (57) Изобретение касается получения плазмид, кодирующих фермент с активностью деацектосицефалоспорин С синтетазы и деацетилцефалоспорин;С синтетазы. Сконструированы рекомбинантные плазмидные ДНК., рТТ507 pI T511, рР$58, pPS359, рРЗЬО, pPS61, рР$62, рП 502, обеспечивающие экспрессию

ВАОС$/DACS в клетках Escherichia coli, Penicillium chrJJsogenum H Cephalosporum acremonium. используют для построения векторов экспрессии, .которыми трансформируют штаммы ЕзсЬегхсЬха со11..

Сырые клеточные экстракты из трансформированных E.coli проявляют активность DAOCS/DACS без .какой-либо предварительной активации. Сконструированные в кторы и трансформанты обеспечивают эффективное получение больших количеств активного фермента DAÎCS/DACS. фермент DAOCS/DÀÑS можно применять для продуцирования рАОСИ и DACS и дли гидроиоилирораииа фр цефалоспоринов для образования новых (ф антибиотиков.

Рекомбинантные плазмидиые ДНК могут быть использованы для создания штаммов Penicillium, "Cephalosporium> продуцирующих пенициллиновые и цефалоспориновые антибиотики.

39856 4 способах построения векторов экспрессии при трансформации широкой разноя видности организмов, продуцирующих пенициллиновые и цефалоспориновые антибиотики.

ДНК, кодирующие DACS/DAOCS, вьщеляют с регуляторными последовательностями, которые контролируют транскрипцию. Описаны новые регуляторные последовательности, которые могут использоваться в новых способах для обеспечения трансляции и транскрипции любого генного продукта в Cephalosporium. Эти регуляторные последовательности особенно эффективны в С.acremo- .

nium.

Описаны регуляторные сигналы гена

DACS/DAOCS, расположенные у 3 -конца 0 кодирующего гена DACS/DAOCS Cephalosporium acremonium. Эти 3 -регуляторные

t последовательности кодируют термийацию транскрипции и полиапенилирование

-PHK, а также сигналы обработки гена

DACS/DAOCS. Помещение этих сигналов в 3 -конце гена усиливает экспрессию

I гена в Cephalosporium.

10 20 . 30: 40,, 5 -А АСС TTG TAC GGA GAA TTA AGG СТТ GCA CGA ТТС САТ GGC GGT СТС

50 60 70 80 . 90

GAC.GAT CAG GGA ССА TGC АСС АТА CAT АТТ СТС CTG CGA ACC AAG ААС

100 .. 110 . 120 . 130 140

° GAG AAG AGA АСТ CGA TGG CTT СТТ ATG АТТ CGT TGA САА ААС ТТС ACA

150 . 160 170 180 . 190 .

AGA САС TCG TGG GTT ТАС AAT GCT АСА TTG ACG TGT GCG GCC AAG GCT

GAG GGG

200 210

AAG CAG GGC GTC ACT ТАС GGC ТАА GTA GCA GTT GTC Т

220 230

240 : 250 260 270

60А GTT ССТ СС6

С G CGT AAG СТА CGA GGT GGG GTT TGA GAT ATA ТАТ АТА

270 280

290 300 310

CCG CTT TGA САА С

340 350 360

С Т ТТС GTT СТС ACT. GGG ATC TTG TGA АТС CTT

ТТС CTC TTG CAG AAC ТТТ ССТ ССА CGC ТАС ТСС ТСТ САА GTC АТС GCT

3 17

В предлагаемом описан усовершенствованный способ трансформации Penicillium рекомбинантными ДНК. Эта нова система трансформации использует amds ген Aspergillus nidulans. Используя ацетамид (CH>CONHz как единственный источник углерода или азота на пластинах трансформации, можно отобрать клетки хозяина Реп сд11 шп, трансформированные вектором, содержащим ген

amds, от нетрансформированных, которые не в состоянии расти на данных ппастинах ввиду того, что клетки хозяина Penicillium дикого типа не выражают .активность ацетамидазы.

Предлагаемые рекомбинантные плаз» мидные ДНК могут быть использованы для получения штаммов Paecilomyces s

Streptomyces, в частности S.clavuligerus, которые экспрессируют DAOCS/

/DACS Хотя ДНК, кодирующую DACS/

/ЭАОСБ, выделяют из Cephalosporium асгешопхшв, плазмидная ДНК, содержащая этот ген, может быть использована для построения векторов экспрессии .DACS/DAOCS в широкой разновидности клеток хозяев. Большинство организмов, которые продуцируют пенициллины и цефалоспорины, используют общйй пред- " шествующий пенициллин N, субстрат для

DAOCS. Фрагменты ДНК, кодирующие

DACS/ПАОСЗ, могут использоваться в

Последовательность ДНК штамма Brotsu Cephalosporium acremonium, кодирующая как активность DACS так и активность DAOCS представлена в виде .

400 410 420

390

AAC CAC AGC A7C ААС ATG ACT ТСС ААО

G GTC ССС GTC ТТТ CGT СТС

ИЕТ THR SER LXS VAL PRO VAL РНЕ ARG LEU

1739856

5 10

440 450 460 470

GAC GAC СТС AAG AGC GGC AAG GTC СТС ACC GAG СТС GCC ОАО GCC GTC

ASP ASP LEU LYS SER GIY LYS VAI, LEU THR GLU LEU AIA GLU ALA VAL

15 20 25

480 490 500 . 5 10 520

АСС АСС AAG GGT АТС. ТТС ТАС TTG АСС GAG AGC GGC CTG GTC GAC GAC

THR THR ТУБ GLY ILE PHE TYR LEU THR GLU БЕф GLY LEU VAL АЗР ASP

30 35 40

530 540 550 560 . 570

GAC САС АСС TCG GCG CGT GAG ACG TGC GTT. GAC ТТТ ТТС AAG ААС GGA

ASP HIS THR SER ALA, ARG GLU THR CYS VAL ASP PHE PHE LYS ASN GLY . 45 50 55

580 590 600 610 620

AGC GAG GAG GAG AAG AGG GCC GTG ACG СТС ССС GAC CGT ААС GCC CGC

БЕК GLU GLU GLU LYS ARG ALA,VAL ТНК LEU ALA. ASP ARG ASN ALA ARG

GCC СТС GAG TGG GAG

ALA LEU GLU TRP GLU

АСС GAG JHR GLU

TCG GAC ТАС TCG ACG

SER ASP TYR SER THR

AT.Ñ GGC

ILE GLY

105

720 730 740 750 760

GGC ААС CTG ТТС CCG ААС CGG GGC ТТС GAG GAC GTC TGG CAG GAC. ТАС

GLY ASN LEU PHE PRO ASM ARG GIY PHE GLU ASP VAL TRP GLN ASP TYR

110 115 120

770 780 790 800 . 810

ТТС ОАС CGC ATG ТАС GGC GCA GCC AAG GAT GTC GCG CGC 6СС GTT СТС

PHE ASP ARG ИЕТ TYR И7 АТА АХА LYS ASP VAL ALA ARG ALA VAL LKU

125 130 135

820 830

ААС ТСТ GTG GGC GCC CCG СТС

ASN SER VAL GLY ALA PRO LEU

140 145

870 880

GAG TGC GAT ССС СТС СТС CGC

GLU CYS ASP PRO LKU LEU ARG

155 160

GCC GGG GAG

ALA GLY GLU

890

СТА CGG ТАС

LEU ARG TYR

GAC CGC GTC GCC GAA GAG

ASP ARG VAL ALA GLU GLU

960 970

СТА TCG АСС АТС ACG СТС

LEU SER TER П.Е THR LEU

190

930 940 950

GAA CCC СТС CGC ATG GGA ССС САС ТАС GAC

GLU PRO LEU ARG ЛЕТ ИХ PRO НТБ TYR АБР

180 .:185

980 990 1000

GTG САС CAG АСА GCC TGC GCC ААС GGC ТТС

VAL HIS GLN THR ALA CYS ALA ASN GLY РИЕ

195 200

CGC GGC ТТС ТСТ

ARG GLY PHE SER

ACG GGC AAG ТАС

THR GLY LYS TYR

650 . 660

AGC АСС GCC GTC GTC

SKR THR ALA VAL VAL

700 710

TGC ТАС ТСС ATG GGC

CYS TYR SER ИЕТ 6ТУ

100

850 860

GAC ATT GAT GAC ТТС 6ТС

ASP ILE ASP ASP PHE ЧАХ

900 910

ТТС CCC GAA GTG CCG GAG

РНЕ PRO GLU VAL PRO GLU

165 170

1739856

GAC GGA GAA

ASP GLY GLU

ТТС TGC GGC

PHE CYS GLY

CAG TGC GAG GTG

GLN CYS GLU VAL

GCC ATG GTC GTC

ALA ИЕТ VAL VAL

225

1130 1140 1150

AAG САС CGG GTC AAG ТСТ ССС GGG

LYS HIS ARG VAL LYS SER PRO GLY

245 250

1180 1190

CGC ACG TCG AGC GTC ТТС ТТС CTG

ARG TER SER SER VAL PHE PHE LEU

260 265

1110 1120

ACG GGC GGC AAG GTC.AAG GCG ССС

THR GLY GLY LYS VAL LYS ALA PRO

235 240

1160 . 1170

CGC GAC CAG CGC GTC GGC AGC AGC

ARG ASP GLN ARG VAL GLY SER SER

255

1200 1210 1220 1230 1240

CGG CCG ААС ССС GAC ТТС AGC ТТС AAC GTG CAG CAG TCG AGG GAG TGG

ARG PRO LYS PRO ASP PHE SER PHE ASN VAL GLN GLN SER ARG GLU TRP

270 275 280

1250 1260 1270 1280 1290

GGT ТТС AAC GTC CGC АТС CCG TCG GAG CGC ACG ACG ТТС AGG GAG TGG

QLY PHE ASN VAL ARG 1ЕЕ PRO SER GLU ARG THR THR PHE ARG GLU TRP

285 290 295

1300 1310 1320 1330 1340

СТТ. GGC GGG AAC ТАТ GTC AAC ATG CGG AGG GAT AAG CCG GCG GCA GCG

LEU GLY GLY ASN TYR VAL ASN ИЕТ ARG ARG ASP LYS PRO ALA. ALA ALA

300 .305 310

1350 . 1360 1370 1380 1390

GAG GCG GCT GTC ССС GCG GCT GCC ССТ GTC ТСТ АСС GCA GCT ССТ АТА

GLU ALA ALA VAL PRO ALA АЬА ALA PRO VAL SER THR ALA А1 А PRO ILE

315 320 325 330

1400 1410 1420 1430

GCC АСТ TAG GGA АСС CGC CGA TCG AGT ААТ ААА ТСТ ACG GGA GTT ТАА

ALA THR

1440 1450 1460 1470 1480

GAA GAA AAA TTG ССС ТАТ ААА TTG CTA ААТ ТТТ TAA AAC ACA AAG CAT

1490 1500 1510 GAG TGT САА GAG ТТТ CAA GTT ТСА А-3 . 1010

GTG AGC CTG

VAL SER LEU

CTC ССС GGC

LEU PRO GLY

220

1040 1050

ТТС GTC GAC СТС CCG ACG

PHE VAL ASP LEU PRO THR

1090 1100

GCG GTC GGC ACC CTG GCC

ALA VAL GLY THR LEU ALA

230

39856

10 экспрессии фермента DACS/DAOCS в

E.coli.

Построение плазмиды pIT507 вклю5 чает сшивку Sst I — - Bani.HI фрагмента размером 2,2 кв, кодирующего DACS/

/DA9CS плазмиды pIT503 с 5,8 кв

Nde I — - Ban HI фрагментом плазмиды

pCZR336, и синтезированйым фрагментом "60 п.о. Sst .I — Nde

1О

Плазмида pCZR336 включает образованный от ЯрЬ промотор, последовательность, активирующую трансляцию, оператор гена cI857, первую функциональную единицу наследственности

l5 (Цистрон ), кодирующую небольшой у! пептид, и последовательность ДНК, кодирующую производное hGH. При низкой температуре, составляющей 30 С,.бе0 лок, копированный на плазмидах

pCZR336 и pI507, является активным и способен подавлять активность промотора А рЬ, но при повышении температуры да 42 С белок сХ857 инактивируется и промотор ускоряет транскрипцию большого количества мРНК, кодирующей hGEI (pCZR336) или DACS/DAOCS (pIT507).

Плазмида pIT507 включает тот же первый цистрон, cI857 ген, промотор

30 « .»pL и последовательность, активирующую трансляцию, что и плазмида

;pCZR336, но включает кодирующую последовательность гена РАСЯ/DOACS от плазмиды рХТ503 вместо кодирующей

35 последовательности hGH. Ограничительный фрагмент 2,2 п.о. Sst I — - Ваш 1П плазмиды pIT503 включает большую часть кодирующей последовательности

DACS/DAOCS, остальная часть этой ко1п дирующей последовательности содержится в синтезированном фрагменте 60 п.о. Nde I — Sst I с небольшой модификацией по сравнению с последовательностью ДНК дикого типа, что об 51легчает последующую работу.

Последовательность

5 -CATATG-3, l(libel

3 -GTATAC-5

50 включает

5-ATG-3

11(3-ТАС-5, 9 - 17

Фрагменты ДНК, кодирующие фермент с активностью DACS/DÀÎCS, выделяют из штамма Cephalosporium acremonium; известного как штамм Brotzu который

Ф

Э .содержится в коллекции культур аМе- риканского типа, Роквилл, Иэрилэнд (хранится под номером ATCC 11550).

Геномную библиотеку ДНК штамма Brotzu строят. в бифункциональном космидном векторе рКС462А (существующим в E.coli К12 под номером NRRLB-15973) и исследуют .на наличие последсвательностей, гомологичных ряду 32 различных деоксирибоолигонуклеотидов. Этот ряд деоксирибоолигонуклеотидов был построен на основании информации о частичной аминокислотной последовательности фермента С. acremonium DACS/

/DAOCS и знании генетического кода.

Были отобраны клоны, гомологичные одному или нескольким из 32 различных деоксирибоолигонуклеотидов.

Идентифицируют плазмидные ДНК, кодирующие фермент DACS/DAOCS, из которых выделяют фрагмент 7 кВ Ваш HI,. включающий ген DACS/DAOCS, и встраивают его в коммерчески доступную плазмиду рпС8. Получают лазмиду

pIT503, которой трансформируют Е.coli

К12 JA 221 ° Трансформанты E.coli К12

JA 221/pIT508 депонируют в коллекции культуры Северной региональной науч" но-исследовательской лаборатории .(NRRu) Пеория,,П. 61604, под номером

NRR LB-.18170.

Плазмида pIT503 служит в качестве исходного материала для построения других векторов экспрессии. Эти векторы.пригодны для получения фермента

DACS/DAOCS в рекомбинантной клетке хозяина. Для этого осуществляют трансформацию клеток хозяина рекомбинантной плазмидной ДНК, которая включает: промотор и последовательность, активирующую процесс трансляции; последовательность ДНК, которая кодирует DACS/

/DAOCS и операбельно связана с ука занным промотором; культивирование трансформированной клетки-реципиента, трансформированной в условиях, обеспечивающих синтез фермента.

Плазмиду pIT503 выделяют из Е.coli К12 JA 221, используют для построения векторов экспрессии Е.coli

DACS/DA0CS. Плазмида pIT503 используется в качестве исходного материала для построения плазмиды pIT507, которая обеспечивает высокую степень которая кодирует аиинотерминальную метионильную группу SACS/DAOCS.

Плазмида pIT507 построена так, что промотор рЬ и последовательности, активирующие трансляцию, расположены, 11; 173 обеспечивая экспрессию ДНК, кодирую щей ПАСЯ/DAOCS.

При.температуре 42 "С Е. coli К12 ,Зй 109/pIT507, экспрессируется DACS/

/DA0CS (" 15 от общего клеточного белка). Сырые клеточные экстракты от этих E.coli К12 JM 109/pI507 (трансформант) способны катализировать конверсию пенициллина N в DAOS и РАЯ, в то время как клеточные экстракты от нетрансформированных клеток

Е.со1х К12 JM 109 не могут катализировать эту конверсию.

Многие штаммы V-.coli К1,2;обладают активностью эндогенной цефалоспориназы, кодированной локусом ampG, При этом осуществляют частичную очистку полипептида DAOGS/DACS так, что достигается оптимальная активность

DAOGS/ПАСЯ. Для этой цели достаточна очистка фермента посредством ДЕАЕтривакрила для отделения эндогенной

Е.coli цефалоспориназы от фермента

DA0CS/ПАСЯ. Для исключения вредных влияний цефалоспориназы используют штамм, дефектный по данному ферменту.

Один акой штамм Е.coli К12 А85 892 находится на хранении в Северном региональном научно-исследовательском центре под номером NRRLB-18096.

Плазмиды pIT507 и pIT511 эффективно продуцируют большие количества

DACS/DA0CS в Е. coli. Е. coli pIT507 продуцирует DACS/DAOCS в количестве, приближающемся к 15 от общего клеточного белка. Ввиду moro< что культивирование K.coli менее сложно,,трансформанты Е.coli pIT507 могут быть использованы в способе продуцирования

DACS/DAOCS более эффективно и более экономично, чем естественные продуценты ПАСЯ/DAOCS.

DAOCS может быть использована для продуцирования DAOCS из пенициллина

N в свободной от клеток системе. DAOS является не только полезным антибиотиком, но также может быть использован в качестве исходного материала для продуцирования .таких важных антибиотиков как цефалексин и другие цефалоспорины. DACS/DÀOÑß используют для трансформации пенициллинов иных, чем пенициллин N в новые цефалоспориновые производные.

Свободные от клеток экстракты пенициллина и образующих цефалоспорин организмов могут использоваться для синтеза не имеющих природного происхождения Р-лактамов. Предлагаемые

9856 12

vitro" мутантных генов, создаваемых таким образом, позволяет продуцировать белки с комбинациями мутаций.

Такой мутант ПАСЯ/ПАОСЯ получен с помощью pIT513.

40. Изменение количества генетической информации (вызывающее таким образом вставку или делецию аминокислот в полученном белке) в кодирующей последовательности DACS/DAOCS ДНК изменяет

55 соответственно кодированную аминокислотную последовательность.

Существует целый ряд плазмид, который увеличивает внутриклеточную концентрацию фермента DACS/DAOCS трансформированной клетки., содержащих:

ДНК, кодирующую фермент DACS/DAOCS; промотор и последовательность, активирующую трансляцию, оперативно связанную с геном DAOC/ПАОЯ ° Стойкие трансформанты могут быть получены лишь, если .данный вектор воспроизводится либо как внехромосомный элемент, либо как интегрированный в геномную

ДНК в клетке хозяина. Описанные плазвекторы экспрессии E coli могут быть использованы в способе получения

DACS/DAOCS для трансформации пенициллинов, которые в естественном виде в природе не встречаются, для образования новых антибиотиков или структур с антибиотическим ядром.

Плазмида pIT507 пригодна для получения ПАСЯ/DAOCS в Е.coli не только из-за высоких уровней экспрессии фермента в этих клетках и из-за наличия маркера, присутствующего на данной плазмиде. Многие векторы кодируют Рлактамаэу и клетки, содержащие этот

I5 вектор, и могут расти в присутствии некоторых Р-лактамовых антибиотиков, таких как ампициллин. Однако, если желательно использовать свободный от клеток экстракт, содержащий ПАСЯ/

/DAOCS для целей построения Р-лакта-. мов, то нежелателен экстракт, который содержат активность /3-лактамазы. Так, плазмида pIT507 не кодирует 8-лактамазу, а использует стойкий к тетрациклину ген, который кодирует белок, не реагирующий с 8-лактамами. Осуществляют замену цистеиновой группы в положении 100 на серии в кодирующей зоне DACS/DAOGS плазмиды pIT513 данного вектора экспрессии. Этот обычный способ может использоваться для замены любой группы на любую из других 19 естественно кодированных аминокислот. Сращивание в условиях "in

173 миды включают также ген, придающий стойкость к антибиотику, либо какойлибо другой элемент, который обеспечивает средство отбора клеток хозяев, которые содержат данный вектор, но такие отбираемые элементы могут отсутствовать, когда вектор интегрируется в хромосомную ДНК клетки хозяина.

Векторы экспрессии в Penicillium u

Cephalosporium описаны следующим образом.

Плазмида pPS56 представляет собой вектор экспрессии Cephalosporium.

Плазмида рРБ55 представляет собой промежуточный продукт в построении плазмиды рРБ56. Плазмида рРЯ55 построена ns Hind III фрагмента плазмиды

pMLC12 и 2,3 т.п.о. Hind III фрагмента плазмиды рРБ34, который включает промотор С.acremonium IPR, слитый с кодирующей последовательностью гидромицин В фосфотрансферазы. Фрагмент

8am HI 7 кв, содержащий ген DACS/

/DAOCS плазмиды pIT503, слит с частично обработанной Bam HI плазмидои

pP$ 55, образуя плазмиду рРБ 56.

Промотор Cephalosporium acremonium и последовательность, активирующая трансляцию на плазмиде pIT503, расположены так, чо вызывают экспрессию

ДНК, кодирующей фермент с активностью синтетазы DACS/DAOCS, ввиду того, что при построении плазмиды pIT503 никаких делеций или вставок, действующих на промотор и последовательность, активирующую трансляцию не вводится в

ДНК, гранйчащую с 5 -концом.

Ген Penicillium IPS может быть встроен в высоко продуцирующие штаммы Penicillium с целью увеличения титра пенициллинов, продуцируемых при ферментации.

Плазмиды рЗБК2, pPS51, pPS52, pPS54 и pPS61 содержат ген amds u клетки Penicillium, заключающие эти плазмиды, и могут быть отобраны с использованием ацетамида. Плазмиды

pPS57 и pPS62 содержат гибридный ген, придающий стойкость к гидромицину, который использует плазмиды рР$59, в результате чего получают плазмиду рРБ61. Плазмида pPS61 предназначена для экспрессии фермента DACS/DAOCS

РепхсП1 шп, особенно P.chrysogenum.

Плазмиду pPS51 используют в качестве источника ацетамидного гена в других плазмидных построениях. Плаэмида pPS52 содержит ген DACS/DAOCS

9856 14 на фрагменте 7 т.п.о. Bam HI (от плазмиды pPS51) и синтезированную связывающую молекулу. Плазмида рРБ52 г обеспечивает экспрессию фермента

5 DACS/DAOCS. Плазмиду pPS52 используют для экспрессии фермента Cephalosporium либо в Penicillium.

Отбираемый маркер amds может быть введен в любой вектор экспрессии.

Вектор pPS54 включает ген amds от плазмиды рРЯ51 и ген Penicillium IPS.

Штаммы Penicillium обладают некоторой стойкостью к гидромицину. Оптимальные условия трансформации для использования НшК как отбираемого маркера требуют добавления чувствительных к гидромицину агентов. Способ отбора трансформантов Penicillium предлагает трансформацию рекомбинантной ДНК, включающей ацетамидный ген, клетки хозяина Penicj.ilium, а также культивирование трансформированной клетки в среде роста., которая содержит.ацетамид как единственный источник углерода или азота.

Источником ацетамидазного гена (amdS) от Aspergillus nidulans может быть плазмида рЗЯЕ (НИИ В-18182).

Создан промежуточный вектор, обозначенный как плазмида pPS51 который состоит из гена amds от плазмиды p3S2, слитой с плазмидой рЖС12. Плазмиду

pPS5i гидролизуют рестриктазой Hind

III„ обрабатывают фрагментом Кленова

35 и сшивают с фрагментом 2, 13 т.п.о., предварительно с затупленными концами, содержащим гибридный ген DACS/

/DAOCS, в результате чего получают плазмиду рРЯ60. Плазмида pPS60 содер40 жит промотор Penicillium IPS, расположенный рядом, для экспрессии коди- рующей последовательности DACS/DAOCS.

Осуществляют делацию двух небольших ограничительных фрагментов ХЬа1 из ф5 плазмиды рРБ60 создающей плазмиду рРБ58. Синтезированный связывающий фрагмент встраивают в ХЬа1; что обеспе- чивает операбельное связывание промото-, ра Penici 11ium I ХРЯ и кодирующей после"

50 довательности DACS/DÀOÑS, в. результате получая плазмиду pPS59. Плазмиду

pPS59 используют для выражения активности DACSfDAOCS в клетках в Penicillium и других клетках, в которых функционирует промотор Репхсд11 пш

IPS.

Плазмида pPS59 является промежуточным продуктом для построения векторов экспрессии: PenicØium. DACS/DAOCS

1739856

pPS 62 и pFS61. В обоих случаях фрагмент 2,1 т.п.о. Bam HI — Nru I плазмиды рРБ59 с затупленными концами посредством фермента Кленова используется как источник кадирующей последовательности DACS/DAOCS, слитой с промотором Penicillium IPS. Плазмиды

pPS61 и pPS62 содержат отбираемые маркеры rya Penicillium. Осуществляют слияние фрагмента 2,13 кв ллазмиды

pPS59 с расщепленной Hind III и обработанной фрагментом Кленова плазмидой рРБ57 и получают нлазмиду pES62.

Плазмида pPS62 является вектором экспрессии.

Промотор BAGS/DAOCS Cephalosporium acremonium также может функционировать в Penicillium (обсуждение плазмида pPS52 приведено), но оптимальные векторы выражения Penicillium используют проматор от гена Penicillin@a. Промотор Penicil lium IPS от плазмиды pLC1 {NRRI В-18181) связан со скелетом плазмиды рЯ С12 с помощью синтезированной связующей молекулы, в результате чего продуцируется плазмида рРБ53. Плазмида pPS53 является промежуточным продуктом в построении некоторых других кланирующих векторов и плазмид экспрессии. Содержащий промотор фрагмент Ваш НХ 1,0 кв плазмиды рРБ53 слит с фрагментом, кодирующим последовательность HmR 4, 3 т. п. о. Bam HI плаэмиды рРБ55, в результате чего образуется плазмида pPS57.

Плазмида pPS57 является промежуточным продуктам в построении вектора экспрессии Penicillium pPS62. Плазмида pPS62 содержит отбираемйй маркер (HmR) и гибридный DACS/DAOCS ген с кодирующими последовательностями как

ЭАСБ/DAOCS, так и HmR под контролем прамотора (2 копии) гена Penicillium

IPS.

Вектор экспрессии Penicillium

DACS/DAOCS без атбираемога маркера построен путем вставки содержащего промотар фрагмента 1,0 т.п.о. Bam HI плазмиды рР$53 в точку Bgl IT вектора выражения рХТ511 E,coli ДНК, кодирующей фермент DACS/DAOCS. Плазмида

pIT503 и производные, которые содержа целый ген DACS/DAOCS, используются для повышения способности к продуцированию антибиотика Cephalospor. inn ь родственных им клеток реципиентов, в которых функционируют промотор С .асщей DACS/DÀOÑÁ в геноме Cephalosðorium acremonium. Плазмида pIT503 включает промотор и последователь-" ность, активирующую трансляцию гена

DACS/DA0CS.

Плазмиды pIT503, pPS52 и pPS56 включают. промотор Cephalosporium

4р, acremonium и последовательность, активирующую трансляцию гена DACS/

/DAOCS. Промотор С.acremonium è последовательность,. активирующая трансляцию, расположенные на плазмидах

pIT503, pPS52 и pPS56, могут быть использованы для экспрессии целого ряда последовательностей ДНК. После45 довательность промотора C..acremonium и последовательность, .активирующая

5Q трансляцию, закодирована на фрагмен" тел 440 вр Sst I — Hind ХХЕ, расположены непосредственно над и в непосредственном соседстве с кодирующей последовательностью ВАСБ/DAOCS. Фрагмент, который включает указанный ограничительный фрагмент л440 п.о.

Sst Х - Н пй ХХХ, включает промотор

С.acremonium и последовательность, активирующую трансляцию.

remonium и последовательность, акти вирующая трансляцию. Плазмида рРБ56 включает также придающий стойкость к

5 гидромицину ген который функциониt рует в C.acremonium и .позволяет осу-. ществлять отбор трансформантов С.acremonium pPS56.

После отбора трансформант:Cephalosporium acremonium pPS56 нет необходимости в поддержании давления отбора гидромицина В в среде роста. Отборочное давление не требуется, поскольку трансформанты С.acremonium l5

pPS56 очень стойки. Эта стабильность является результатом трансформации плазмидюй pPS56. С.acremonium через хромосомную интеграцию.

Трансформированные клетки Penicil-.

lium могут быть отобраны с использованием гидромицина В.

Предлагается способ конверсии пе-. нициллина С и пенициллина V в соответствующие цефалоспорины с использованием DACS/DAOCS в Penicillium, который включает трансформацию клетки хозяина.Penicillium вектором рекомбинантной ДНК, который содержит ген, кодирующий выражение активности

DAOCS.

30 Плазмида pIT503 включает геномную

ДНК, составляющую более чем 3 кв, которая расположена ниже ДНК, кодирую17. 173

Последовательность промотора Cep halosporium acremonium è последова.тельность, активирующая трансляцию, е закодированы на плазмиде pIT503. Плаз" мида рЕТ503 содержит фрагмент 440 п.о. Sst I †-. . gind III, Промотор Cephalosporium acremonium и последовательность, активирующая трансляцию, могут быть использованы для экспрессии гетерологичной последовательности ДНК, Влияние промотора ВАСЯ/DAOCS с геном, стойким к бактериальному гидромицину В, позволяет использовать отбор с использованием гидромицина В в Cephalosporium, Описана последовательность окончания транскрипции и другие регуляторные сигналы в 3 -конце гена

DACS/DAOCS. Плазмида pIT503 и ее производные, такие как плазмида

pPS56, содержат дополнительно ДНК более чем 1 т.п.о. ниже точки начала транскрипции гена DACS/DAOCS в геноие Cephalosporium acremonium.

Часть этой 3 -регуляторной ДНК последовательности известна и описана следующим образом.

3 -TAG-3; является трансляционной

I .концевой последовательностью:

5>-ТAG GGA АСС CGC CCA ТСГ AGT ААТ

ААА ТСТ ACG GGA GTT TAA GAA GAA

ААА TTG ССС ТАТ ААА TTG СТА ААТ.

ТТТ ТАА AAC АСА AAG САТ GAG TGT

CAA GAG ТТТ CAA GTT ТСА А-3

Данная последовательность и последовательности, включающие 3 -регу> ляторные последовательности гена

DACS/DAOCS, могут быть введены в векторы экспрессии рекомбинантной ДНК.

Осуществлено впервые клонирование последовательности, которая кодирует фермент DAOCS. Кроме того, как аминокислотная, так и ДНК последовательность фермента экспандазы, особенно

DAOCS синтетазы Cephalosporium асгетоФ, a>urn> могут быть использованы для отделения ДНК, кодирующей экспандазу от про" дуцирующих -лактам организмов, Данная последовательность ДНК может быть использована для приготовления меченых проб, предназначенных для обнаружения кодирующих экспандазу последовательностей ДНК в продуцирующих лактаи организмах. Содержание G и С в кодирующих DAOCS ДНК, составляющие примерно 63Х приводит к тому, что данные ДНК пригодны для выделения

ДНК Shreptomyces, кодирующей DAOCS, s основном S. clavaligerus. ДНК

9856 18.

В обработанные лизоцимом клетки

50 вводят 3 мл лизирующего раствора (приготовленного смешиванием 3 мл

1ОХ-ного тритон-Х. 100 75 мл 0,25 М

ЕДТА, рН 8 0, 15 мл 1: M трис-НС1, рН 8,0 и 7 мл воды), перемешивают и

55 ют, 5

Streptomyces имеет высокое содержание G и С и достигает 70Х. Такое высокое содержание G и С в ДНК позволяет использовать их для выделения гамологичных Я.slavaligerus или других последовательностей ДНК, кодирую-щих DAOCS.

Пример 1, Культура Е,coli

К12 JA 221/pIT508 и выделение плазмиды pIT503.

1 л питательного бульона L (10 и триптона, 10 г NaC1 и 5 r дрожжевого экстракта на 1 л), содержащего

50 мкг/мл ампициллина, инокулируют культурой Е.coli К12 JA 221/pIT503 о и инкубируют в инкубаторе при 37 С до тех пор, пока оптическая плотность при 590 нм не составит 1 ед. поглощения. В течение этого времени в культуру вводят 150 мг хлорамфеникола. Инкубацию продолжают в течение

16 ч. Введение хлорамфеникола ингибирует .синтез белка и, таким образом, ингибирует дальнейшее деление клеток, но обеспечивает дальнейшую репликацию плазмиды.

Данную культуру центрифугируют при скорости вращения 6000 об/мин в течение 5 мин при 4 С. Полученный поо

/ верхностный слой удаляют и клеточную гранулу промывают в 40 мл TES буферного раствора (10 мИ трис-НС1- рН

7,5; 10 NaC1 и 1 мМ этилендиаиинтетрауксусная кислота (ЕДТА) и затем снова гранулируют. Поверхностный слой удаляют и клеточную гранулу замораживают в баке со смесью сухой лед— этанол, а затем оттаивают. Оттаянную клеточную гранулу снова суспендируют в 10 мл раствора 25Х-ной сахарозы и 50 мМ ЕДТА. В данный раствор вводят и перемешивают с ним 1 мл лизоцимного раствора концентрацией

5 мг/мл; 3 мл 0,25 И ЕДТА, рН 8,0 и 100 мкл рибонуклеазы А концентрацией 10 мг/мл. Затем эту смесь инкубируют на льду в течение 15 мин. полученный раствор инкубируют на льду в течение еще 15 иин. Лизированные клетки замораживают в бане со смесью сухой лед — этанол, а затеи оттаива19

1739856,. 20:

Клеточные осколки удаляют из раствора путем центрифугирования при вращении центрифуги со скоростью

25000 об/мин в течение 40 мин. Поверхностный слой экстрагируют буферным фенолом. В этот раствор вводят

30,44 СзС1 и 1 мл раствора этилбромида концентрацией 5 мг/мл. Затем .этот раствор доводят до объема 40 мл к декантируют в ультрацентробежную трубку. Эту трубку герметически эапаивают и раствор центрифугируют в роторной центрифуге при скорости центрифуги 42000 об/мин в течение 16 ч.

Полученную плазмиду, визуализированную ультрафиолетовым светом, выделяют, а затем помещают в трубку и роторную центрифугу, где осуществляют центрифугирование:со скоростью 50000 об/мин в течение 16 ч.. Любое необходимое регулирование объема осуществляют с использованием раствора TES содержащего 0,761 мг/мл CsC1. Затем плазмидную полосу выделяют, экстрагируют насыщенной солью изопропанолом с целью удаления этилбромида, и разбавляют (1:3) буферным раствором TES. В раствор вводят два объема этанола и затем его инкубируют при -20 С в течение ночи. Плазмидную ДНК гранулируют путем центрифугирования данного раствора в роторной центрифуге в течение 15 мин при скорости центрифуги 10000 об/мин.

ДНК плазмиды рХТ503, полученную таким путем (1 мг), суспендируют в

1 мл буферного раствора TES (10 мМ трис-НС1, рН 8,0, 1 мМ ЕДТА) и хранят при -20 С.

Последовательности концевого кодона, кодирующеи последовательности

Г

lрр, замещают íà Bam HI путем ввода синтезированной связующей молекулы

ДНК (5 -CCGGATCCGG-3 ) . Кодирующая последовательность последних тридцати пяти аминокислот липопротеина, трансляционный концевой сигнал и последовательность; соответствующая

3 -нетранслированной зоне информационной РНК, .следует за точкой Bam HI.

Плазмида рКЕ N021 включает также некоторые независимые последователвности на 850 т.п.о., расположенные ниже гена lрр в хромосоме E.co3i.

Примерно 50 мкг плазмиды: pKENIII обрабатывают с 25 рестриктаэами HpaII в 300 мкл буферного раствора IX Нраl

50 те. Фрагмент 950 п.о. HpaII изолируют и извлекают из геля путем электроэлюирования в диализный мешок. После экстракции смесью фенол/СНС1> и осаж55 дения этанолом, ДНК ("2,5 мкг) растворяют в 25 мкл TEN (10.мМ NaC1;

10 мМ трис-НС1, рН 7,4, 1 мИ ЭДТА).

Примерно 2 мкг фрагмента 950 п.о. .HpaII обрабатывают ферментом Alu I

25 (10 мИ трис-НС1, рН 7,4, 10 мИ NgC1<, 1 мМ КС1; и 6 мИ р-меркаптоэтанола) при 3? С в течение 2 ч. Смесь экстрагируют двукратно 300 мл смеси фенола с хлороформом в соотношении 50:50 и извлеченную водную фазу повторно осаждают 2,5 об. этанола и О, 1 об 3 M

Na0Ac Гранулу ДНК растворяют в

100 мкл электрофорезного буферного раствора и фракционируют íà 57. -ном полиакриламидном геле.

Пример 2. Построение плазмиды

pIT5O7.

Построение плазмиды pKEN021 и выделение фрагмента 5 1 т. и. о. Xba I —Bam HI осуществляют следующим образом.

Плазмиду рКЕМ021 получают из плазмиды pKENIII. Плазмиду pKENIII получают из Северного регионального научно-исследовательского центра (NRRL)., служба исследований в области сельского хозяйства, Перория, Иллинойс, 61604, Е.coli CC620, порядковый номер NRRL 15011.

Плазмида рКЕНХХХ имеет фрагмент 2,8 к EcoRI, который включает ген

Е.coli lрр.

В плазмиде pKEN021 фрагментл 650

Ьр EcoRI — Sal I плазмиды pBR322 замещают генной последовательностью

Е.coli lрр..Эти генные последовательности lрр включают фрагмент 462 п.о.

Alu I, расположенный кверху от первого триплета кодирующей последовательности lрр. Этот фрагмент 462 Ьр содержит промотор 5 -нетранслированную зону и точку рибосомного связывания.

Уникальный сайт рестрикции XbaI расположен в пределах точки рибосомного связывания 16 lI,o. перед метионином, инициирующим трансляции. Сайт рест-. рикции Pvu, находящийся вьппе бис, составляет 29: 1 во всех полиакриламидных гелях, за исключением особых случаев. Этот гель окрашивают в раст".. воре, содержащем 0,5 мкг/мл этилбромида., и визуалиэируют полосу ДНК в длинноволновом ультрафиолетовом све39856 22

2!

17 в 200 мкл раствора IXAlu I (50 мИ

NaC1, б мМ трис-НС1, рН 7,6, 6 мМ

NgC1< и 6 мИ Р-меркаптоэтанол) в течение 2 ч при 37 С. ДНК фракционируют в б -ном полиакриламидном геле, фрагмент 462 п.о. Alu Х.извлекают, (1 мкг).растворяют в 10 мл раствора (66 мИ трис-НС1, рН 7„6, 10 мИ ИяС1, 10 мМ дитиотреитол, 0,4 мИ АТР),.сoдержащего 150 пмоль фосфорилированного связующего звена EcoRI (5 -GGAATTCC-3 ) и 2 ед. Т4 ДНК-лига,.эы. После инкубации при 4 С в течение о

16 ч смесь прогревают при 65 С в течение 10 мин и разбавляют до состава раствора: 100 мИ трис-НС1, рН 7,2, 50 мМ NaCl, 10 MgC1 и 6 мМ / -мер-: каптоэтанол, содержащего 40 ед. фермента EcoRI. Через 2 ч выдержки при о

37 С образец экстрагируют смесь фенол/СНС1 и осаждают этанолом. Затем

ДНК растворяют в 20 мкл буферного раствора Т4 ДНК-лигазы, содержащего

Т4 ДНК-лигазу и О, 1 мкг обрабстанной щелочной фосфатазой и ферментом .EcoRI плазмиды pBR322. После сшйвки о при 4 С в течение 16 ч ДНК используют для трансформации Е.coli К1 2 НВ101 (КЗЗП В-15626). Трансформанты отбирают на агаровых пластинах, содержащих

12 мкг/мл тетрациклина и плазмид, выделенных из стойких колоний путем быстрой щелочной экстракции. Плазми дя, содержащая фрагмент 466 п.о.

Xba I — Ваш НХ, использована в качестве исходного материала для следующего этапа.

Примерно 2 мкг этой.плазмиды, обработанной 2 ед. фермента Hind III . в 50 мкл буферного раствора IX Hind

ХХХ (6О мИ NaC1; 1О мИ трис-HCl, рН 7,4, 10 мМ MgC1 и б мИ /З-меркап-. тоэтанол) в течение 1 ч при 37 С, экстрагируют смесью фенол/СНС1>, осаждают этанолом, растворяют в .200 мкл буферного .раствора нуклеазы

ХХ SI (300 мИ NaC1; 30 мИ NaOAc, рН 4,25, 3 мИ ЕпС1 ) и обрабатывают

200 ед, нуклеазы S 1 в течение ч при 15 С. Реакцию прекращают путем о экстракции смесью фенол/СНС1, ДНК .осаждают этанолом. Обрабатывают ферментом Hind III растворяют в 10 мл буферного раствора Т4 ДНК-лигазы, содержащего 20 пмоль фосфорилирован"

I ных связующих звеньев Ваш HI (51 -CCGGATCCGG-3 ) и 2 ед. Т4 ДНКлигазы. После 16 ч инкубации при о ..4 С реакционную смесь нагревают при -

65оС в течение 10 мин и затем разбавляют до 100 мл до получения буферного раствора IX Bam HI (150 мМ

NaC1 20 мИ трис-НС1, рН 8,0, 10 мИ

МяС1 и 6 мМ f5-меркаптоэтанол), содержащего 20 ед. фермента Bam HI.

После 2 ч инкубации при 37 С смесь подвергают очистке в 1 -ном агарозном геле. Этот гель окрашиваются этилбромидом, и более крупный фрагмент (4,5 т.п.о.) извлекают из геля.

Фрагмент имеет когезионно связанные концы Bam HI, Его растворяют в

20 мкл буферного раствора Т4 ДНКлигазы, содержащего лигазу Т4,.ДНК.

Через 16 ч вццержки при 4 С ДНК используют для трансформации Е.coli

20 К12 НВ!Oi (NRRLB-15626). Трансформанты отбирают на устойчивость к ампициллину при 100 мг/мл и на чувствительность к тетрациклину при 10 мкг/

/мл. Плазмиды отобранных колоний исследуют на отсутствие точки Hind ХХХ и на присутствие единственной точки

Bam HI. Последовательный гидролиз

EcoRI, SalI приводит к образованию двух фрагментов размером 466 и 305 п.о. и значительно более длинного фрагмента. Плазмиду. с такими характеристиками модифицируют для превращения точки EcoRI расположенной выше промотора lрр, в ограничительную точку Hind III.

Модификацию проводят путем частичного гидролиза 2 мкл плазмиды в

100 мкл буферного раствора IX EcoRI с ограничительным .ферментом EpoRI..

Реакцию прекращают нагреванием при

"0 65 "С. ДНК экстрагируют смесью фенол/

/СНС1 и осаждают этанолом. ДНК растворяют в 200 мл буферного раствора -. нуклеазы IX S1 содержащего 1000 ед/

/мл нуклеазы Я1, и инкубируют при

12 С в течение 1 ч. Реакцию прекращают экстракцией смесью фенол/СНС1э.

ДНК осаждают этанолом и суспендируют в 10 мкл буферного раствора Т4 ДНКлигазы, содержащего 20 цмоль фосфо50 рилированного связующего звена Hind

III (5 -CCAAGCTTGG-3 )и 2 ед. Т4 ДНКлигазы. После 16 ч инкубации при 4 С смесь нагревают в течение 10 мин при

65©С, разбавляют до 150 мкл с полу

55 чением композиции буфера IX Hind III, содержащего 1О ед. ограничительного ,фермента Жпй ХХХ, инкубируют в те чение 2 ч при ЭУ С и затем фракциони. :руют в Я-ном агарозном гела. ДНК

23; 17 ,извлекают, очищают, растворяют в

20 мкл буферного раствора Т4-лигазы, содержащего Т4-лигазу, инкубируют в течение 16 ч при 4 С и используют для о трансформации Е.coli HB101 (МНИ В-15626). Плаэмиду ДНК трансформант

ApR анализируют. Отбирают плазмиду с фрагментом 500.п.о. EcoRI — Hind ХХХ. Эту плазмиду затем используют как вектор для клонирования 3 -зоны гена lрр. 2 мкг этой плазмиды гидролизуют в 50 мкл буферного раствора

ХХ Яа1 I (150 мИ ИаС1, 6 мИ трис-НС1, рН 7,9, 6 .мИ MgClz 6 мИ Р-меркаптоэтанола) с 2 ед. фермента Sal I в тече- . ние 1 ч при 37 С. Реакционную смесь разбавляют до 150 мкл с получением композиции буферного раствора Bam HI, содержащего 2 ед. фермента Bam HI.

После инкубации ч при 37 С добаво ляют примерно 2,5 ед. щелочной фос. фатазы и инкубируют при 65 С в течение 1 ч..ДНК экстрагируют смесью фенол/CHCl, осаждают этанолом, растворяют в TEN и используют как вектор клонирования для фрагмента 3 -lрр, Для получения фрагмента lрр3

10 мкг плазмиды рКЕХХХХ гицролизуют в 200 мкл буферного раствора IX HpaI содержащего 10 ед. фермента НраХ, в а течение 2 ч при 3? С. После экстракции смесью фенол/СНС1 и осаждения этанолом ДНК растворяют в 10 мкл

;буферного раствора Т4-лигазы ДНК, содержащего 20 пмоль фосфорилированного связующего звена Sal I

,(5 -GGTCGACC-3 ) и Т4 ДНК-лигазу. Инкубируют в течение 16 ч при 4 С. Лио газу инактивируют путем нагревания .при 65ОС в течение 10 мин. Полученный материал разбавляют до объема 100 ìêë, получают композицию буферного раствора IX Яа1 I, содержащего 10 ед. фермента Sal I, и инкубируют в течение 1 ч при 37 С. Реакционную смесь

I разбавляют.до 300 мкл, получают композицию буферно о раствора IX Pvu ХХ (60 мИ NaCI, 6 мИ трис-НС1, рН 7,5, 6 мИ MgC1 и 6 мИ /э-меркаптоэтанол), содержащего 10 ед. фермента Pvu II.

Через 1 ч инкубации при 37 С ДНК фракционируют в 5Х-ном полиакриламидном геле. 0,5 мкг фрагмента 950 п.о. извлекают, очищают и растворяют. в

TEN.

0,2 мг этого фрагмента разбавляют в 20 мкл буферного раствора Т4 ДНКлигазы, содержащего 20 пмоль фосфори39856 24, экстрагируют смесью фенол/СНС1, осаждают этанолом и растворяют в

24 мкл TEN содержащего 40 пмоль фосфорилнрованного связующего звена

Bae Hl., Смесь инкубируют в течение

2 ч при 22 С, в течение 16 ч при 4 С, а затем в течение 10 мин при 65 С.

55 лированного связующего звена Ваш HI (5 -CCGGATCCGG-3 ) и 2 ед. Т4 ДНКлигазы, и инкуоируют в течение 16 ч при 4 С. Полученную ДНК нагревают о в течение 10 мин при 654С разбавляют до объема 100 мкл с образованием композиции буферного раствора IX Bam HI, содержащего 20 ед. фермента Bam HI, инкубируют при 37 С в течение 2 ч и затем фракционируют в 5Х-ном полиакриламидном геле с целью удаления избытка связующих молекул.

Полученный в результате фрагмент

950 п.о. с когезионно связанными концами Bam НХ и Sal I очищают и раство . ряют в 20 мкл буферного раствора Т4

ДНК-лигазы, содержащего 0,2 мкг гидролизованной Bam HI — Sal Х плазмиды

2О 105 и Т4 ДНК-лигазы. После инкубации в течение 16 ч при 4 .С ДНК используют для трансформации E.cooli K12 НВ101 (NRRL В-15626). Плазмиды клонов анализируют на наличие фрагмента Sal I-25 Bam HI, и отбирают плазмиду (5,.2 т. п.о.), которую обозначают pKEN021.

10 мг плазмиды pKEN021 гидролизуют: в 200 мл буферного раствора Bam H1,,содержащего 10 ед. каждого из ферментов Bam H1 и ХЬа Х в .течение 1 ч при о, 37 С. Затем обрабатывают 2,5 ед. щелочной фосфатазы в течение 1,5 ч при

65 С, экстрагируют смесью фенол/СНС1>, о осаждают этанолом и растворяют в

50 мп TEN для последующего использования.

° °

Построение плазмиды рНИ575 ведут следующим образом.

Плазмиду ptrED50ch GH 800 используют в качестве источника ДНК, со-, . держащей части кодирующей последовательности hGH, которая содержит уникальную ограничительную точку, на

6 п.о. ниже трансляционного концевого, кодона данной кодирующей последовательности. Эту. точку заменяют на точку Ваш НХ по описанной методике.

6 мкг плазмиды ptzpED50ch GH 800 гидролизуют 6 ед. $ша I в 200 мл раство ра IX Sma I (15 мИ трис-НС1, рН 8,0, 6 мИ И8С1о, 15 мИ КС1 и б мИ/3-мер- каптоэтанол) в течение 15 ч при 37 С, 739856

25

TCCCCTCTCGAGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCG-3

l t l l ll l l t l f l l l t t l l l l ill l l l l l l l l 1l ll t

AAGGGGAGAGCTCCGAAAAACTGTTGCGATACGAGGC-5 25

Когезионно связанные концевые звенья

Bam HI образовываются путем гидролиза с ограничительным ферментом Bam HI

Гидролиз приводит к образованию фрагмента 69I п.о. с когезионно связанными концами Bam HI.

Фрагмент ДНК сшивают с 0,2 мкг .-.ь. гидролизованной Bam НХ и обработанной щелочной фосфатазой ДНК плазмиды

pBR322. Через 16 ч инкубации при 4 С данный материал используют для трансформации Е.coli К12 JA 221 (NRRL

В-15014). Трансформанты отбирают на агаровых пластинах, содержащих

100 мкг/мл ампициллина. Плазмиды выделяют и идентифицируют путем анализа ограничительного фермента и методом гель-электрофореза. Желаемые плазмиды, обозначенные как рИИ575, содержат фрагмент 700 п.о. Bam HI.

Построение плазмиды р1101 ведут следующим образом.

Кодирующая последовательность зрелого hGH содержит одну точку

Рпи РХХ,,составляющую 47 п.о. от первого нуклеотида трансляционной

„5 -CTAGAGGGTATTACATATGGATTTCCCAACCAT

ll il f Ill ll l1it il ll ll l 1i ll ll <

3 - TCCCATAATGTATACCTAAAGGGTXGGT

°

20 инициирующей точки. 25 мкг плазмидЬ

pNN575 гидролизуют в 250 мкл раствора Bam HI с 25 ед. фермента Bam HI при 37 С в течение 1 ч. Фрагмент 691 п.о. Bam HI извлекают из 6Х-ного полиакриламидного,геля и очищают. Одну треть этого фрагмента (эквивалентно

8 мкг плазмиды) гидролизуют в 100 мкл раствора Fnu PII (6 мИ NaC1; б мИ трис-НС1, рН 7,4, 6 мИ ИяС1 и 6 мМ

Р-меркаптоэтанол) с 2,5 ед. фермента

Fnu PII в течение 1,5 ч при 37 С.

Электрофорез в 6Х-ном полиакриламидном геле и стандартные процедуры извлечения используют для извлечения фрагмента ДНК 538 п.о., содержащего кодирующую последовательность послед-, них 175 аминокислот hGH после чего осуществляют трансляцию стоп-сигнала.

Двунитевой фрагмент ДНК синтезируют фосфотриэфирным способом, соединяя зону промотора 1рр с кодирующей зоной hGkI. Этот двунитевой фрагмент

ДНК имеет следующую последователь-. ностье

Данный фрагмент получают фосфотриэфирным способом, посредством которого готовят следующие фрагменты:

1) 5 -CTAGAGGGTA-3 ;

2) 5 -TTACATATGGATTTCC-3

3) 5 -CAACCATTCCCCTCTCGAGGC-3

4) 5 -ТТТТТСАСААСС-3 ;

5) 5 -CTATGCTCCG-3 ;

6) 5 -CGGAGCATAGCGTT-3

7) 5 -GTCAAAAACCCT-3 ;

8). 5 -CGAGAGGGGAAT-3

9) 5 -GGTTGGCAAATC-3

10) 5 -САТАТСТААТАСССТ-3

Используя их осуществляют ступенчатую реакцию катализированного связывания Т4-лигазы:

5 — .нефосфорилированный сегмент 1

-f смешивают с фосфорилированными сегментами 2, 9 и 10 и подвергают воздействию Т4-лигазы с образованием дуплекса 1 ДНК; этот дуплекс извлекают методом препаративного гельэлектрофореза в 153-ном полиакриламиде j

5 -нефосфорилированный сегмент 6 смешивают с фосфорилированными сегментами 3, 4, 5, 7 и 8 и подвергают воздействию Т4-лигазы ДНК с образованием дуплексной формы ДНК 2; этот

24 мкл раствора с использованием

Т4 лигазы ДНК. После инкубации в течение 16 ч при 4 С смесью трансфоро мируют E.coli JA 221 (NRRL В-15014), Трансформанты отбирают на агаровых пластинах, содержащих 110 мкг/мл.ампициллина, и культивируют.

Построение плазмнды рХ103 ведут следующим образом.

Последовательность гена hGH в плазмиде рХ101 содержит точку Xho I на 24 основания ниже. трансляционной инициирующей точки и точки "Xba I в . дуплекс очищают электрофорезом в

157-ном полиакриламидном геле;

ДНК дуплексы 1 и 2 соединяют вмес- те посредством Т4-.лигазы, образуя ДНК дуплекс 1100, который очищают электрофорезом в 10Х-ном нолиакриламидном геле; этот ДНК дуплекс ферментно фосфорилируют с использованием Т4-полинуклеотидкиназы и -32 P-ATP, noc4g редством описанной процедуры.

Плазмиду рХ101 строят путем сшивания 0,1 пмоль (0,4 мкг) фрагмента

Xba I — Ваш HI плазмиды pKEN021, 0,025 пмоль синтезированного фрагмента ДНК и 0,3 пмоль (0,08 мкг) фрагмента 538 п.о. плазмиды рБИ575 в

27

1739856 28 некодирующей зоне 5 . 25 мкг плазмиды рующей последовательности hGH. Этот

pl!01 гидролизуют в 250 мкл раствора двунитевой ДНК фрагмент имеет укаSam HI с 25 ед. ХЬа I .и 25 ед. #ho I заннуи последовательность: при 37 С в течение ч. Больший фрагЛССАТТССССТС-3 мент очищают от агарозного геля по (1) описанной методике, Двунитевой фрагмент ДНК синтеэи" Данный фрагмент получают методом руют фосфотриэфирным способом с вво- распознавательного фосфотриэфирного дом короткой открытой рамки считыва- 1и способа, посредством которого полуния (цистрон) в переднюю часть коди- чают следующие сегменты:

5»-СТАСАСССТАТТААТААТСТАТАТТСАТТТТЛАТЛАССАССЛАТАЛТСАТАТССАТТТСССА

3 -TCCCATAATТЛТТАСАТАТААСТААААТТАТТСССTCCTTAGTATACCTAAAGGGT

» 1

1) 5. -СТАСАСССТАТТААТЛАТССАТАТТСАТТТТААТААССАС-3

2) 5 -GAATAATCATATGGATTTCCCAACCATTCCCCTC-3

3) 5 -TCGAGAGGGGAATGGTTGGGAAATCCATATGATTATTCCTCCTT-3

4) 5 -АТТЛАААТСАЛТАТАСАТТАТТААТАСССТ-3

Используя приготовленные сегменты, 20 осуществляют соединение путем смешивания 5 — нефосфорилированных сегментов 1 и 3 с 5 -фосфорилированными . сегментами 2 и 4 и воздействия на данную смесь Т4-лигазой. Полученный »5 дуплекс очищают путем электрофореза в 107.-ном полиакриламидном геле. ДНК дуплекс затем ферментно фосфорилируют с использованием Т4-полинуклеаотидокиназы и $-.32 P-ATP. Для этого плазt

30 миду LGH в1103 строят путем сшивки

0,1 пмоль (0,4 мкг) фрагмента ХЬа I —Х1»о Х плазмиды р1101 с 0,025 пмоль синтезированного фрагмента ДНК в

24 мкл раствора, с использованием Т4лигазы ДНК. После инкубации в течение 16 ч при 4 С смесь используют для трансформации Е.coli jA 221 (NRRL

-15014). Трансформанты отбирают на агаровых пластинах, содержащих

100 мкг/мл ампициллина, и обычным образом культивируют.

Построение Е.coli К12 RV 308/

/рЬ 110 А ведут следующим образом.

1,мкг плазмиды рЬ110 ДНК гидролизуют 3 ед. фермента Nde I в объеме 45

20 мкл раствора 1,0 M NaC1, 0,50 М трис-НС1, рН 7,5, 0,10 мМ И@С1 .и

10 мИ дитиотритиола .в течение 1 ч при

37 С, экстрагируют смесью фенол/хлороформом и осаждают этанолом. ДНК ппазмиды рЬ110 растворяют в 50 мкл раствора Кленова IX (40 мИ КРО, рН

7,5, 6,6 мИ И8С1, 1,0 мМ 2-меркаптоэтанол, 33 мкИ d-ATP 33 мкМ d СТР;

33 мкИ d-GTP и 33 мкМ TTP). Два мкл 55 (10 ед. ) крупного фрагмента ДНК пойолимераэы 1 Е.coli известного как фрагмент Кленова, вводят в данную

ДНК и смешивают с ней. Реакционную смесь инкубируют при !64С в течение

1 ч, реакцию завершают путем экстракции фенолом и ДНК очищают. Гидролиэованную Ййе 1 и обработанную фрагментом Кленова ДНК сшивают Т4-лигаэой

ДНК при 4 С в течение 16 ч. Полученную ДНК используют дня трансформации

RV308 штамма Е.coli К12 (NRRL

В-15624). Трансформанты отбирают на

L-агаровых пластинах, содержащих

100 мкг/мп ампициллина, плазмиды отделяют от полученных колоний путем быстрой щелочной экстракции. Так отбирают плаэмиду pL110А, не содержащую точку Nde I, Построение фага yL110B путем точечно-специфического мутагенеза проводят следующим образом.

Для построения фага И?ЗТсЗ 50 мкг плазмиды рЬ110В в 50 мкл раствора

TEN вводят в 25 мкл раствора. 10Х

Hind III и 170 мкл воды, добавляют

5 мкл (50 ед.) фермента Hind III u инкубируют при 37 С в течение 2 ч.

Добавляют 13 мкл 2 M трис-НС1., рН

7,4 и 5 мкл (" 50 ед) фермента EcoRI и инкубируют в течение более 2 ч при

37 С. Реакцию прекращают экстракцией о фенолом, насыщенным TEN, фенол удаляют путем экстракции хлороформом.

ДНК плазмиды рЬ110 осаждают, центрифугируют, проводят электрофорез в

tX-ном агарозном геле и выделяют фрагмент EcoRI — Hind 111 4,3 т.п.о.

Примерно 5 мкг ДНК фага в13шр18 растворяют в 50 мкл раствора ТЕ, гидролизуют Hind III u EeoRI ферментами, как описано, обрезая Hind III — EcoRI, и очищают фрагмент размером 7,25 т. п.о.

56 30

Трансформанты, содержащие ДНК фага

m13Tc3, идентифицируют путем анализа ограничительного фермента их фаговой

ДНК.

Для получения однониточной ДНК фага mi3Tc3 1,5 мл ночной. культуры

Е.coli К 12 1И 109/ш13ТсЗ подвергают центрифугированию и 100 мкл поверх-. ностного слоя, содержащего фаг m13Tc3, используют для инокуляции 25 мл культуры Е.coli )И 109 при О.P..660 = 0,4—

-0,5. Культуру инокулируют в течение

6 ч при 37 С с аэрированием.. В течение этого времени культуру центрифугируют и полученный поверхностный слой (20 мл) переносят в новую трубку. 2 мл раствора, содержащего 20Х полиэтиленгликоля (PEG) б000 и 14,6Х

NaCl, вводят в этот поверхностный слой центрифугирования, который затем инкубируют на льду. в течение 20 мин.

Полученный поверхностный слой центри" фугируют в течение 25 мин. Осадок снова суспензируют в 500 мкл буферного раствора ТЕ. Раствор ДНК двукратно экстрагируют насыщенным фенолом ТЕ и двукратно хлороформом.

Затем осаждают.однонитевую ДНК с использованием NaOAC и этанола, и подвергают центрифугированию. Осадок промывают 707-ным этанолом, высушивают и растворяют в 60 мкл Н О.

Иутагенез проводят следующим образом.

Фрагмент однонитевой ДНК, используемый в мутагенезе, синтезируют в автоматическом синтезаторе ДНК. Этот фрагмент имеет указанную последовательность:

5»-СССЬТССТСТЬЬАТАСТСТАСЬСССА-3

Он гомологичен .зоне, окружающей точку

Bam HI (5 -GGATCC-З»),в придающем стойкость к тетрациклину гене плазмиды рВК322, с той разницей, что группа А, вторая от 5 -.конца (или третья, от 3»-конца), представляет собой С в плазмиде pBR322. Такая замена не изменяет аминокислотный состав придающего стойкость к тетрациклину белка, но устраняет точку Вата HI.

Примерно 1.0 пМ мутантной затравки и универсальной затравки М13 обрабатывают отдельно 10 ед. (ВИ) Т4-полинуклеотидоксиназы s 20 мкл раствора киназы ХХ (60 мМ трис-HCl, рН 7,8, 15 мИ 2-меркаптоэтанола, 10.мМ MgC1g. и 0,41 мкМ -ATP) в течение 30 мин йри 37 С. Обработанную киназой ДНК

17398

29:

100 нг фрагмента 4,3 т.п.о.

Hind III - EcoRI плазмиды рЬ110 смеllIHBa»oT с 100 нг фрагмента 7,25 т.п. о. Hind III — Ecokl фага М13 mp18, 2 мкл буферного раствора лигазы 10Х, 1 мкл (!00 ед.) Т4-лигазы ДНК и

14 мкл H 0. Смесь инкубируют при

15 С в течение 1,5 ч..

1 мл. ночной культуры Е.cо1х К12

jM 109 Е.cali К12 jM 101 используют

10 для инокуляции 50 мл питательного бульона L, полученную культуру инкуо бируют при 37 С с аэрацией до тех пор, пока О.D 66o не достигает значения от 0,3 до 0,4. Клетки повторно

I5 суспендируют в 25 мл 1.0 мИ NaC1, инкубируют на льду в течение 10 мин, собирают центрифугированием, снова суспензируют в 1,25 мл 75 мИ СаС1, аликвоту (200 мкл) этих клеток удаляют, вводят в 10 мкл сшитой ДНК, приготовленной как указано, и инку бируют на льду в течение 40 мин. За тем инкубируют при, 42 С в течение 2 мин, аликвоты (1, 10 и 100 мкл) удаляют и вводят в 3 мл верхнего агара (Ь питательный бульон с 0,57ным агаром, поддерживаемом в расплавленном состоянии при 45 С), который о также содержит 50 мкл 2Х-ного Х-Gal, S0 мкл 100 мИ .ХРТС и 200 мкм Е.coli K12 jM 109 в логарифмической фазе роста). Смесь клетки — верхний агар помещают на пластины с Ь агаром, содержащим 40 мкг/мл X-Gal.(5-бромо-4- 35 хлоро-З-,индолил-P-D-тиогалактозид) и 0,1 мИ IPTG (изопропил-P-D-тиогалактозид). Пластины инкубируют при

37 С в течение ночи.

Прозрачные колонии используют для 40 инокуляции 2 мл питательного бульона

Ь, полученные в;результате культуры. инкубируют при 37 С с аэрацией в течение 2 ч (отсутствие синего цвета говорит о том, что произошла желае-. 45 мая вставка ДНК). Затем культуры : центрифугируют и 200 мкл полученного поверхностного слоя вводят в 10 мл культуры (О.D., = 0,5). Е.cali K12

jM 109, выращенйой при 37 С с аэра- Я} цией. Эти культуры инкубируют еще в течение 30 мин при 370С, а затем клетки гранулируют путем центрифугирования и используют для получения репликативной формы рекомбинантного фага, -который они содержат. Двунитевую репликативную форму ДНК фага выделяют из клеток с использованием l процедуры, описанной в. примере 1.

311

173 используют в операции мутагенеза, для чего смешивают 300 нг (1,2 мкл) однонитевого фага m13Tc3, 1 пИ (2 мкл) универсальной затравки, 1 пМ (2 мкл) мутагенной затравки, 2 мкл 10Х ананеляционного буферного раствора (100 мМ трис-НС1, рН 7,5, 1 мМ ЕДТА и 500 мМ NaC1), и 12,8 мкл Н О, инкубируют при 80 С в течение 2 мин, при 50 С в течение 5 мин и охлаждают; до комнатной температуры.

5 мкл раствора 10Х (500 мИ трисНС1, рН 8, 1 мИ ЕДТА. 120 мМ MgClg), 5 мкл 2 мМ d АТР, 1 мкл 6 мМ раствора в каждом из d GTP TTP u d СТР, 1 мкл (2 ед.) фермента Кленова, 1 мхл (100 ед.) Т4-лигазы ДНК и 17 мкл ананелированной ДНК инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч, при

37 С в течение 2,5 ч и затем в течение ночи при 4 С. о

Реакцию останавливают посредством двух экстракций насыщенным TE фенолом и двух экстракций СНС1 . ДНК осаждают этанолом и NaOAc, осаждают центрифугированием, повторно суспензируют в 50 мкл Н О и 6 мкл буферного раствора 10Х I добавляют к,раствору

ДНК.

Раствор ДНК распределяют поровну в три трубки. В две из них вводят примерно 200 ед.. SI нуклеазы. Одну реакционную смесь SI инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин, а другую — в течение 10 мин. Реакцию прекращают путем экстракции реакционной смеси насыщенным ТЕ фенолом, экст- ракцией хлороформом и осаждением этанолом. Не подвергнутый обработке образец

ДНК служит в качестве негативного контрольного образца.

Осадок ДНК повторно суспензируют в 20 мкл H 0. 10 мкл полученного раствора используют для трансформации Е.coli.

Двунитевую репликативную форму

ДНК выделяют примерно из 48 колоний как описано и отбирают на присутствие точки Ваш HI (pL110B). Изоляты .без точки Bam HI отбирают описанным путем получения однонитевой ДНК.

Для построения плазмиды pL110C

5О мкг репликативной формы ДНК фага

pL110B гидролизуют в 250 мкл буферного раствора IX Nhe I (50 мМ NaC1, 6 мИ трис-НС1, рН 7,5, 6 мМ MgC1

6 мМ -меркаптоэтанол), содержащего, 50 eä. фермента Nhe I при 37 С в те чение 2 ч. Добавляют 5 мкл 5 И NaC1„

9856 32 а затем 5 мкл (50 ед.) фермента

Sa1 I и гидролизуют в течение 2 ч при 37оС. Фрагмент 422 п.о. Nhe I .

Sa1 I содержащий зону, придающую стойкость тетрациклину, выделяют из акриламидного геля.

ДНК плазмиды pL110A гидролизуют ферментами Nhe I — Sal Х в аналогичных условиях .получая Nhe I — - Sal I фрагмент размером 6, 1 т.п.о.

100 нг каждого из полученных фрагментов сшивают с использованием обычной процедуры. Плазмида pL110C придает устойчивость Е. coli к тетрациклину, но:не имеет точки Ваш НХ в тетрациклиновом гене.

Для построения плазмиды pCZRIII сшивают фрагмент 3,5 т.п.î. EcoRI—

20 Psc Х плазмиды pLI10 С (содержащей неповрежденную кодирующую последовательность) с фрагментом размером

3 т.п.о, EcoRI — Pst Х плазмиды рХТ160. Плазмида pIT160 содержит фрага мент 3 т.п.о. EcoRI — Pst I, образо ванный от плазмиды pL110C, вставленной в гидролизованную EcoR I — Ppt I плазмиду PUC18. Фрагмент содержит ген устойчивости к тетрациклину с той разницей, что точка Сlа Х исключена.

Плазмида рХТ160 несет. устойчивость к 10 мкг/мл тетрациклина и в ней отсутствует ограничительная точка

С1а Х. 50 мкг ДНК плазмиды р?.110С инкубируют в объеме 250 мкл IX

З5 Ecokl раствора, содержащего 10 мкл (50 ед.) Есор, в течение 2 ч при

37 С. Затем вводят 1 мкл (5 ед.) фермента Rst Х и инкубацию продолжают при 37 С. Аликвоты удаляют при40 мерно каждые 5 мин и экстрагируют смесь фенол/СНС1, Эти аликвоты собирают и смесь подвергают электрофорезу на агарозном геле. Желаемый

EcoRI — Pst I фрагмент 3,5 т.п.о. содержит неподвергнутый воздействию ген ЬСП и включает внутреннюю точку

Pst I. Фрагмент очищают и сшивают с фрагментом Гзt I - EcoRI размером

3 т.п.о. плазмиды pIT160. Полученной

®О ДНК трансформируют Е.coli К12 jM 109 и желаемую плазмиду обозначают

pCZRIII характеризуя с помощью известных методик.

Для поатроения плазмиды рСЕВ336

50 мкг плазмиды рХ103 инкубируют в

250 мкл высокосолевого буферного раствора IX содержащего по 50 ед. фермента. Ваш HI и .Xba I в течение

33

2 ч при 37ОС; Фрагмент 650 п.о.

Xba I — Bam НТ, содержащий первый . цистерон и ген кодирующей последовательности LGH, отделяют и очищают в акриламидном геле. 50 мкг плазм @ы рСЕВТТТ гндролиэуют .ферментами ХЬа Т и Bam HI и .большой фрагмент очищают.

Фрагменты сшивают друг с другом и трансформируют Е.coli К12 RV308.

Плазмнду pCZR336 идентифицируют.

Построение плазмиды pI104.

5 -TATGACTTCCAAGGTTCCCGTCTTTCG CTAG

I!ill llllllll!!!3!!!(!!!!1!!!! 3»--ACTGAAGGTTCCAAGGGCAGAAAGCAGAT

Эта связующая молекула синтезирована в автоматическом синтезаторе . ДИК в виде двух одиночных нитей. Мо« лекула имеет несколько изменений: об разование точки Nde I, включающей. трансляционную инициирующую точку; .замена С на А в третьем положении кодона 10 (лейциновый кодон), поскольку CTC и СТА эквивалентны, образуя точку ХЬа Т; замена С на Т в третьем положении четвертого кодона (валиновый кодон), поскольку GTC H

- GTT эквивалентны.

5 мкг плазмиды pUC 19 растворяют в 50 мкл раствора IX Sst I (50 мМ .NaCl, 50 мИ,:трис-НС1, рН 7,5, 10 мИ

MgCl<), содержащего 10 ед. фермента Sst Т, и инкубируют 2 ч при 37 С

Концентрацию NaC1 увеличивают до

150 мИ путем добавления 1 мкл 5 M

NaC1 добавляют 2 мкл (10 ед.) фер" мента Nde I и инкубируют еще 2 ч при

37 С. ДНК осаждают центрифугирова нием.

Примерно 100 нг гидролиэованной плазмиды pUC19 смешивают с 1 пмоль синтезированного связующего звена и

Т4-лигазой ДНК. Лигаэной смесью — . трансформируют клетки Е.coli К12

jM 109, аликвоты высевают на чашки . с L-агаром, содержащим 100 мкг/мл

= ампициллийа, 40 мкг/мл Х-gal u

40 мкг/мл IPTG.

1739856

10

ACGACCTCAAGAGCGGCAAGGTCCTCACCGAGCT-3 ! !!!!!!1!!(!!!!!!! !!!!! 11!!!!!!!

TGCTGGAGTTCTCGCCGTTCCAGGAGTGGC-5»

С последовательностью, что и синтезированный фрагмент.

Окончательное построение плаэми" ды pIT507 проводят следующим образоме

Плазмнду рТТ507 получают путем сшивки фрагмента Sst I — Bam HI плазмиды pI503 со вставкой Nde I—

Sst I плазмиды pI104 и Nde:I — Ваш HI

° фрагментом плазмиды pCZR336. Фраг- .

-мент 2,2 т.п.о. Sst Т вЂ” Bam HI плазмиды рТ503 получен путем полного гидролиза Ваш HI и .частичного гидролиза Sst I. Для этого плазмиду

pIT503 в количестве 50 мкг растворяют в 250 мкл раствора:IX Sst Т, содержащего 50 ед. Bam HI è инкубируют при 37 С в течение 2 ч. Затем

"вводят 1 мкл (-10 ед) фермента Sst I.

35 и инкубируют при 37ОС.

50 мкг ДНК плазмиды pCZR336 сус-i пендируют в 250 мкл высокосолевого раствора, содержащего по 50 ед. ферментов Nde I или Ваш НТ и вццержио

40 вают при 37 С в течение 2 ч.

Фрагмент- 5,8 т.п.о. Nde I—

Ваш HI плазмиды pCZR336, который не имеет кодирующей последовательности

LGH, выделяют из агарозного геля.

g5 100 мкг плазмиды рТ104 суспензируют в 500 мкл раствора IX Sst I, содержащего 100 ед. фермента Sst I, инкубируют при 37 С в течение 2 ч, концентрацию NaC1 увеличивают до

5Q 150 мМ путем добавления 10 мкл 5 М

NaC1 вводят 20 мкл (100 ед.) фермента Ийе Т и инкубируют 2.ч при

37 С. Фрагмент размером 60 п.о. очищают в 157-ном агарозном геле.

100 нг фрагмента Nde I — Bam EII

5,8 т.п.о. плазмиды.pCZR336, 100 нг

Чашки инкубируют при 37оС в тече.ние ночи. Колонии, содержащие плазмиду беэ вставки, имеют:синий цвет, а колонии, которые содержат плазмнду со .вставкой, — белый. Отбирают нес" колько белйх колоний и осуществляют их отбор методом рестрикционного анализа на присутствие фрагмента ж60 п.о. Nde Т вЂ” Sst I с той.же

34

Плазмида рСЕР336 представляет - co-» бой вектор, несущий промотор Я Т..

Для соединения DACS/DAOCS с промотором% pL в плазмиде pCZR336 необходимо использовать синтезированное связующее звено ДНК. Это связующее звено соединяет точку Nde плазмиды

pCZR336 с точкой Sst I в кодирующей последовательности DACS/DAÎCS и имеет приведенную структуру! фрагмента "2,.2 т.п,о. Sst I — Bam HI плазмиды рТТ503 и 50 нг фрагмента

60 п.о. Sst I - Nde I плазмиды .

l739856 36 рП04 сшивают Т4-лигазой и используФ ют для трансформации клеток Е,со1 .

Клетки выращивают при 30 С, Трансо форманты идентифицируют путем анализа их ДНК.

Пример 3. Определение продуцированной Е.coli активности DACS/

/DA0CS.

Культура Е.coli К12 jM 109/pIT507 для выражения активности DACS/DAOCS.

Трансформанты Е.coli K12 jM109/ о

/pIT507 выращивают при ЗО.С в течение ночи в 500 мл питательного бульона (содержащего 10 мкг/мл тетрациклика) в роторном инкубаторе, вращаю". щемся со скоростью 250 об/мин. Клетки разбавляют (1:10) и дополнительно инкубируют в течение 1 ч при 30 С в о тех же условиях выращивания. Температуру воздуха затем повышают до

42ОС и инкубацию продолжают дополнительно в течение 6,5 ч. Чувствительный к температуре с 1857 ЯрЬ.промотор, установленный так, что обес-. печивает выражение DACS/DAOCS на ппазмиде pIT507, инактивируется при

42 С и, таким образом, допускает экспрессию DACS/DAOCS. После инкубации клетки собирают путем центрифу- гирования и используют как предпоч. тительный источник продуцированной

Е.coli активности DACS/DAOCS.

Активность экспандазы и гидроксилазы в клетках Е.cali К12 jM109/

/pIT507, выращенных при 42 С, Примерно 14 г клеток Е.coli К12

)М109/рХТ507, приготовленных по примеру 3, повторно суспензируют в трисGEDA растворе (15 мМ трис-HCI, рН

7,5, 10 -ный глицерин; 10 -ный этанол, ;10 мИ дитиотреитол и 10 MM аскорбат) в общем объеме 20 мл. Клетки разрушают ультразвуком при 4 С. о

В ходе пропускания звука осуществляют.многократный ввод фенилметилсульфонилфторида (pMSF) до тех пор, пока окончательная концентрация не достигает 2 MM. Добавляют дезоксирибонук-. леазу и сульфат магния до концентрации соответственно 1 мкг/мл и 2 мМ, Суспенэию центрифугируют со скоростью 40000 )lg в течение 30 мин. Поверхностный слой заключает в себе сырой экстракт фермента DACS/DAOCS.

Этот экстракт объемом 13 мл вводят в 50 мл колонку цЕАЕ-трисакрил, предварительно уравновешенную с 15 мМ трис-GDEA (рН 7,5). Колонку промывают четырьмя объемами 15 мМ буферного раствора трис-GEDA и затем линейным градиентом от 0,015 MM трисGEDA до 0,3 мИ трис-GEDA. Фракции по 5 мл собирают; фермент элюируется как один основной пик активности.

Ферментную активность определяют, осуществляя анализ, основанный на жидкостной хроматографии высокого давления. Катализированную экспандазой реакцию осуществляют в течение

15 мин при 30 С с использованием

0,28 мИ пенициллина Б 60 мМОГ-кетоглутарата (L-КС), 0,06 мИ сульфата железа (двухвалентного), 0,67 мМ аскорбата, 1, 00 мМ дитиотреитола, О, 05 MM .ATP и О, 0008 — О, 008 ед, фермента в 1 мл 50 мИ трис-lIC1 (рН

7,5. Катализ ированная гидроксилазой реакция осуществляется при 36 С в той же среде с DAOC с концентрацией

0,05 мИ вместо пенициллина N.

Реакции останавливают путем добавления 1 мл этилового спирта. Осажденный .продукт отделяют центрифугированием при 4000фg в течение 5 мин.

Поверхностный слой, содержащий ферментные продукты реакции, анализи руют методом жидкостной"хроматографии высокого давления следующИм образом. Активность эксплантазы определяют путем измерения образования как DAOC, так и DAC из пенициллина

N ввиду явной бифункциональности

35 фермента. Активность гидроксилазы определяют путем измерения образования DAC из DAÎC.

Аликвоты (от 20 до 100 мкл) по,верхностных растворов анализируют

40 на ВАОС и DAC посредством жидкостной хроматографии высокого давления (ИРЬС) с использованием внешних стандартов. DAC u DAOC разделяют с помощью колонки с радиально упакованными

45 спрессованными микроБондпэк НН (0,8х10 см) с подвижной фазой 2 ук- . сусной киалоты, 0,4 метилового спирта, 6 - 7 ацетонитрила и 87 — 92 воды (рН 5,8). Скорость потока сос50 тавляет 1,5 - 2,0 мл/мин, детектирование осуществляют при 260 нм (цефалоспоринхромофор). Результаты анализа воспроизводимы с 2 -ным отклонением при дубликатных анализах, катализированных как экснандазой, ..так и гидроксилазой.

Пример 4. Построение плазмиды р?Т511

39856

37

17

Плазмида pIT507 (пример 2) содержит геномную ДНК 1,4 п,о., расположенную ниже трансляционной концевой точки кодирующей последовательности DACS/DAOCS. Для того, чтобы уменьшить длину этой ДНК все, кроме

120 п.о., удаляют путем использования ограничительной точки Xba I, расположенной ниже трансляционного стопкодона в конце кодирующей последовательности DACS/DAOCS.

10 мкг плазмиды pIT503 расщепляют в 50 мкл раствора IX Sst I, содержа-щегол 10 ед. ограничительного фер-. мента ХЪа I при 37 С в течение 2 ч.

10 мкг плазмиды рХ104 суспензируют в -50 мкл раствора IX Sst I c

10 ед. каждого,из ферментов Sst Х и

Ваш НТ, и инкубируют в течение. 2 ч при 37 С. 5 — конец Ваш HI дополняют ферментом Кленова.

100 нг фрагмента ХЬа Т (дополненного) — Sst I плазмид,ы pIT503 смешивают с 100 нг плазмиды pI104, выва- ренной с Bam НХ (дополненного)Sst I, и.трансформируют в E=coli K12

j N109. Плазмиду pI105 идентифици- руют методом анализа ограничительного фермента. Плазмида pI105 ценна, поскольку слияние дополненных концов

Xba I и .Bam HI достигаемое при построении плазмиды pI105, реконструирует точку Bam НХ (хотя .точка Xba I разрушается).

50 мкг плазмиды рХ105 растворяют в 250 мкл высокосолевого раствора

IX содержащего 50 ед. каждого из ограничительных ферментов Nde I u

Bam HI, и инкубируют 2 ч при 37 С.

Фрагмент 1, 1 т.п.о. Nde I — Bam HI очищают в акриламидном геле. 100 нг фрагмента смешивают с 100 нг большого фрагмента Nde I — Bam HI плазмиды

pCZR336, лигируют и трансформируют в

E.coli К12 jN109. Трансформанты Е.coli К2 jN109/piI 511 идентифицируют путем анализа ограничительного фер мента их ДНК. Клетки Е,coli К12 дИ109 могут быть использованы как источник активности DACS/DAQCS согласно пропедуре, описанной в примере 3, Пример 5. Построение плазми» ды pIT513, Кроме мутаций вставки и делеции. аминокислотный состав и последовательность генного продукта DACS/DAOCS могут быть изменены путем замены основной пары в кодирующей белок зоне.

38:

Известный- способ точечно направленной мутации описан в примере 2.

Представлякиций интерес ген сначала клонируют в m13 фаг, создавая ?годходящий источник однонитевой ДНК.

5 мкл ?113ш18 ДНК инкубируют в 50 мкл раствора ХХ Sst Х; содержащего " 10 ед. фермента Bam HI, 2 ч при 374С.

50 мкг плазмиды рХТ511 -инкубируют в 250 мкл буферного раствора IX

Sst I, содержащего 50 ед. каждого из ферментов Bam НХ и Bgl II в течение 2 ч при 37 C. ТЬчка Bgl II

15 находится в 5 -некодирующей зоне выше начального трансляционного кодона кодирующей последовательности DACS/

DAOCS вектора.pIT511,: а точка

Bam HI находится примерно на 100 п.о.

20 ниже трансляционного стоп-кодона.

Фрагмент 1 ° 1 т.п.о. Ваш НТ вЂ” Bgl II плазмиды pIT511 очищают обычным об " разом в акриламиде.

100 нг гидролизованной с Bam HI

25 ДНК фага N13mp18 вводят в 100 нг очищенного фрагмента Вага HI — Bgl II ппазмиды pIT511. Смесь лигируют и ,трансформируют в Е.coli K12 )И109.

Плазмида, полученная в результате желаемой вставки, имеет фрагмент, 30 ориентированный так, что 5 -конец кодирующей последовательности DACS/

/DA0CS (точка BglII) находится около гена 1ас 2, а 3 -конец данной кодирующей последовательности (точка

35 Bam HI) находится около гена lac I на векторе М13, Соответствующий изолят обозначен как mIT113.

Синтезируют мутагенную затравку, используемую для данного эксперимен 0 та, которая имеет следующую последовательность:

5 TCGGACTACTOGCACCTACTCCATGGCATC-3

Производное от шХТ113, содержащее указанную последовательйость

©5 вместо последовательности дикого типа, идентифицировано, охарактеризовано в примере 2 и обозначено как гаЕТ114. Идентификация желаемого изо- лята облегчается путей создания новой ограничительной точки Alu I, 10 мкг ДНК фага шХТ114 растворяют в 50 мкл раствора IX, содержащего

10 ед. каждого из ферментов Bam I u

Nbe I, инкубируют при 37 С 2 ч. Фрагмент 1, 1 т.п.о. вьделяют в акриламидном геле, смещают с расщепленной

Nbe I — Bam HI плазмидой. pCZR336, сшивают и трансформируют в Е.coli.

39

173

Трансформанты Е.со1 . К12 jМ109/рТТ513 идентифицируют путем анализа. Плаз" мида pIT513 приводит к выражению мутантного производного DACS/DAOCS, которое содержит группу серина, заменяющую группу цистеина в положении

100 в последовательности дикого типа, Е.coli K12 jM109/pIT513 и является предпочтительным источником данного мутантного белка, Пример 6. Построение плаэ"мид pPS56 и pPS55.

Плазмида pPS56 представляет собой вектор выражения СерЬа1osporium acremonium,. который придает устойчивость гидромицину В и содержит ген

С.acremonium DACS/DAOCS. Плазмида рРЯ56 построена с использованием плазмиды рМЬС12 (NRR В=18097), плазмиды pIT503 (пример 1) и плазмиды

pPS34.

Для построения промежуточной плаэмиды pPS55 5 мкг плаэмиды pMLC12 растворяют в 5 мкл раствора 1СХ

Hind III и 40 мкл воды. В раствор

ДНК вводят 5 мкл (50 ед.) фермента .

Hind III, инкубируют при 37оС 2 ч, экстрагируют фенолом и хлороформом.

НЫЙ III, гидролизованную ДНК плаэмиды pliLC12, осаждают путем доведения концентрации NaC1 до 0,25 M u двух объемов холодного зтанола, охлаждают при — 70 С в течение 10 мин, центрифугируют и повторно суспенэируют в. 5 мкл в оды.

Фрагмент 2,,3 т.п.о. Hind III плазмиды pPS34 содержит промотор синтетаэы изопенициллина N Cephalosporium

acremonium, связанный с кодирующей последовательностью гена гидромицина

В фосфотрансферазы, который придает устойчивость к гидромицину В.

10 мкг плазмиды рР$34 гидролизуют ограничительным ферментом Hind III„ разделяют в 0,87-иом агарозном геле и выделяют и 2,3 т.п.о, фрагмент который включает промотор гена СерЬа1osporium acremonium 1 pS, присоединенный и включенный в рамку устойчивости к гидромицину. 1 мкг фрагмента выделяют и суспензируют в 5 мкл воды.

1 мкл гидролизованной с Hind III ДНК плазмиды рМЬС12 лигируют с 4 мкл фрагмента 2,3 т.п.о. Hind III плазмиды pPS34 и получают плазмипч

pPS55.

Клетки выращивают до оптической плотности ОЛ. 59о 0,5, охлаждают на льду 1О мин, центрифугируют. Оса40/

9856

40. вие фрагмента ч 7 т.п.о., содержащего

5

25 док клеток суспенэируют в 25 мл холодного 100 MM CaCI, иккубируют на льду 25 мпн, центрифугируют, осадок повторно суспензируют в 2,5 мл холодного 100 мМ СаС1, и инкубируют на льду в течение ночи. 200 мкл этой клеточной суспенэии смешивают с ДНК, приготовленной как указано, и инкубируют на льду в течение 20 мин, при

42 С 2 мин и на льду 10 мин.. Клетки о центрифугируют, суспеизируют в i мл питательного Ь бульона и инкубируют при 37 С в течение 2 ч. о

Аликвоты этой клеточной смеси высевают на чашках с L-агаром, содержащим 25 мкг/мл хлорамфеникола, 40 мкг/

/мл Х- и 40 мкг/мл ТРТС. Чашки инкубируют йри 37 С в течение ночи. Колонии, содержащие плазмиду без вставки, такие как Е.coli К12 )М 109/рМЬС12, проявляют синий цвет. Колонии, которые содержат плазмиду с вставкой, такие как Е.coli К12 jM 109/pPS55, проявляют белый цвет, Из нескольких белых колоний посредством рестрикционного ю анализа их ДНК плазмиды отбирают клоны, содержащие фрагмент 2,3 т.п.о., включающий промотор Cephalosporium

acremonium IPS.

Для конечного построения плазмиды

pPS56 20 мкг плазмиды pIT503 гидролизуют ферментом Bam HI и выделяют фрагмент размером 7,0 т.п,о., включающий ген DACS/DAOCS, 15 мкг плазмиды рРБ55 гидролизуют ферментом Bam HI и выделяют фрагмент размером 5,0 т.п.о.

Фрагменты лигируют и используют для трансформации Е.coli, Идентифицируют несколько плазмид на присутстген Cephalosporium acremonium ВАСЬ/

/DA0CS, вставленный в подходящую точку

Ваш HI для образования плазмиды pPS56.

Пример 7. Построение плаэмиды

pPS51 °

15 мкг ДНК плазмиды рМЬС12 гидролизуют ферментом и выделяют фрагмент размером 2,7 т.п.о. Полученный фрагмент гидролизуют ферментом Есо RI u получают четыре фрагмента ДНК: один фрагмент — желаемая молекула е 2,7 т. п.о., другой — длиной 24 п.о.; тре- . тий - длиной 0 6 т. п.о., и четвертый — длиной 1,9 т.п.о.

Ацетамндазный ген Aspergillus nidulas выделяют в виде ограничительного фрагмента "5,0 т,п.о. EcoRI—

Sal I плазмиды p3SR2,, 42 .

1739856

Фрагмент размером 4 3 т.п.о. зак-. лючает ДНК плазмиды pBR322, а фрагмент размером 5,0 т.п.о. — ген ацетамидазы (amdS).

Фрагмент.EcoRI — Sal I плазмиды

: pMLC12 лигируют с фрагментом5,0 т. - . п.о. EcoRI — Sal I плазмиды рЗБН2 полученной смесью. Трансформируют E.co-.

1i.

Идентифицируют колонию на присутствие фрагмента, содержащего ген

Aspergillus nidulaus и имеющего точ-, ную структуру желаемой плазмиды.

Пример 8. Построение плазмиды pPS52.

5 мкг ДНК плаэмиды рР851 гидроли- зуют рестрикчазой Hind III, . Синтезируют одиночные нити сле дующих связующих молекул с использо-, ванием автоматического синтезатора

ДНК:

5 -GATCCCCGGG-3

lflg)3 3 =СОССССТССА-3

75 пмоль каждой нити данной связующей молекулы растворяют индивидуально в 22,5 мкл воды и 2 5 мкл раствора лигазы, добавляют 1 мкл (10 ед.) Т4 ДНК-киназы, инкубируют при 37 С в течение 30 мин. После реакции с киназой реакционные смеси о инкубируют при 70 С в течение 15 мин, затем обе реакционные смеси сливают, инкубируют при 65 С 10 мин, а затем при комнатной температуре 2 ч и при

4 С.в течение ночи. о

Hind ХХХ - Hind III фрагмент ДНК плазмиды pPS51, Bam HI — Hind ХХХ— плазмиды pIT503 (пример 6); связующие . молекулы сшивают Т4 ДНК-лигазой, трансформируют клетки Е.coli и получают плазмиду pPS52 путем анализа на присутствие ограничительного фрагмента 7,0 т .п.о. Bam HI, содержащего ген Cephalosporium acremonium

DACS/DA0CS, вставленный в точку

Hind .III расположенную между генами CAT u amdS плазмиды pPS51.

Н р и и е р 9ь Построение плаэмиды pPS53.

Нлазмиду pMLC12 (NRRL В-18097) гидролизуют ферментом Вага НХ. Промотор гена изопеницнллин Н синтетазы

Реп3.сЯХхпш chrysogenum вьделяют в виде Nco I - Nco Х фрагмента (1,0 т.п.о-.) плазмиды pLC1.

Синтезируют одиночные нити следующих связующих молекул.

5 -CATGAACAAG-3

r ril ey

:3 .-TTCTTCCTAG-5>

Каждую одиночную нить связующей

5 молекулы обрабатывают Т4 ДНК-киназой и затем аннелируют с.образованием неповрежденной связу ацей молекулы.

1 мкл гидролизованной Bam HI ДНК плазмиды рИЬС12 лигируют с 4 мкл

1О Nco Х вЂ” Nco Х фрагмента плазмиды

pLC1 и 10 мкл аннелированной связующей молекулы.

Лигазной смесью трансформируют

E.coli, Аликвоты трансформированной клеточной смеси высевают на чашках с L-агаром, содержащим 25 мкг/мл хлорамфеникола, 40 мкг/мл Х-gal. u

40хмкг/мл IPTG. Чашки инкубируют нри 37 С в течение ночи. Колонии, о которые содержат плазмиду беэ вставки, такие как E.coli К12 jM 109/

/pMLC12, проявляют синий цвет на этих чашках. Колонии, которые содержат плазмиду с вставкой, такие как

Е.coli К12 jM 109/pPS53, проявляют белый цвет на этих чашках. Колонии отбирают путем .анализа их ДНК на присутствие ограничительного фрагмен° та, содержащего промотор гена изопеЗО нициллин N синтетаэы Penicillium (chrysogenum (плазмида pPS53).

П р и м .e p 10. Построение плазмиды pPS54.

Ген.иэопенициллин Н синтетазы Ред nicillium chrysogenum вьделяют в виде Н nd III — Hind III фрагмента

,(ni3,3 т.п.о.) иэ плазмиды pLC2. 1 мкл гидролизованной Hind III ДНК плаэмиды

pPS51 пигируют с 4 мкл ограничитель40. ного фрагмента ("3,3 т.п.о.) Hind III плазмиды pLC2, получая плазмиду pPS54. т

Пример 11. Построение плаэмиды рРЫ7.

Плаэмиду рРЫ55 расщепляют ферментом Bam HI и вьщеляют фрагмент размером 4,3 т.п.о., включающий кодирующую последовательность гена HmR. . Bam HI — Bam HI — фрагмент плаз5О миды pPS53 (размером 1 т.п.о.), содержащий промотор гена изопеннциллин

N синтетазы Penicillium chiysogenum — . лигируют с Bam HI — Bam HI — фрагментом плазмиды pPS55, и трансформируют в Е.coli K12 С600 (АТСС 33524).

Идентифицируют колонии, которые содержат плазмиды со вставками. Эти: плазмиды отбирают путем. рестрикцнон- ного анализа на присутствие фрагкен43 44 та 0,1 т.п.о. Ваш HI, включающего - H Р и м е р 13. Построение плазпромотор гена Penicillium chrysoge- миды pPS58.

num IpS (плазмида pPS57) ° Плазмиду pPS60 гидролизуют ферПример 12. Построение плаэ- ментом ХЬа I, что приводит к образомиды pPS60. ванию трех фрагментов ДНК; одного

Плазмиду Р Т511 (пример 4) гидро- фрагмента .7,9 т.п.о. и двух меньших лиэуют ферментом Bgl II и лигируют с фРагментов ниже 300 п.о. ВыделЯют фрагментом 1,0 т.п.о. плаэмиды рРЯ53 Фрагмент 1 7,9 т.п.о. и примерно 3 мкг (пример 9), трансформируют E.coli 10 фрагмента извлекают н суспензируют

К12 0600 (АТСС 33524). Аликвоты этой в 5 мкл воды. 0,5 мкг этого фрагмента трансформированной клеточной смеси растворяют в 10 мкл буферного раствовысевают на чашках с L-агаром, со- ра лигазы, (4 мкл) Т4 ДНК-лигазы и держащим 15 мкг/мл тетрациклина. Чаш- 86 мкл воды, инкубируя при 15 С в теки инкубируют при 30 С в течение ноо

15 чение ночи. Эта сшитая ДНК составляет чи. Колонии, которые содержат плаз- . плазмиду РР$58, котоРой трансформи" миду без вставки, такие Е,со1 К12 - Руют E coli K12 C600 (ATCC 33524) °

0600/рГХ511 отделены от колоний, ко- Выявляют колонии Tck которые аналиторые содержат плазмиду с вставкой, зируют на отсутствие двух небольших таких как E.coli C600/pPS60, в основ- щ фрагментов ХЬа I, характеризующих

/ ном согласно способу Eckardt, Иден- плазмиду pPS60. тифицированы колонии на присутствие П р и .м е р 14. Построение плазмиограничительного фрагмента, содержа- ды pPS59. щего промотор гена Penicillium- chry- ДНК плазмиды pPS58 гидролизуют ферsogenum IPS в желаемой ориентации ментом ХЬа I и лигируют с .синтези(плазмида РРЫ60). рованной одиночной нитью следующей структуры:

5 -CTAGACACCATGACTTCCAAGGTCCCCGTCTTTCGC-3

3i - TGTGGTACTGAAGGTTCCAGGGGCAGAAAGTGGATC-5

Каждую одиночную нить индивидуаль" но обрабатывают Т4 ДНК-киназой и затем аннелируют с образованием неповрежденной связующей молекулы. Сшитая ДНК составляет желаемую плазмиду

РР559. Ее используют для трансформации E.coli К12 С600 {ATCC 33524). Колонии, которые содержат плазмиду со вставкой, такие E.coli K12 С600/

/pPS59, анализируют на присутствие связующей молекулы.

Пример 15. Построение плаэмиды pPS61

ДНК плазмиды pPS51 (пример 8) гидролизуют ферментом Hind III и обрабатывают фрагментом Кленова в присутствии четырех dNTPS (dATP, TTP, dGTP и dCTP), осаждают, извлекают путем центрифугирования и повторно суспензируют в 5 мкл воды.

ДНК плазмиды РРБ59 гидролизуют ферментом 8am HI и выделяют фрагмент размером 8,0 т.п.о.

Полученный фрагмент плаэмиды pPS59 обрабатывают фрагментом Кленова ДНК полимеразы в присутствии четырех

dNTpS (dATP, TTP, dGTP и dCTP) и гидролизуют ферментом Nru I, что приводит к образованию двух ограничительных фрагментов: фрагмента 2,1 т.п.о. и фрагмента 5,9 т.п.о. Фрагмент 2, 1 т.п.о. содержит кодирующую последовательность DACS/DAOCS под контролем промотора гена изопенициллин N синтетазы Penicillium chrysogenum и трансляционную активирующую последовательность. Этот фрагмент лигируют. с.фрагментом плазмиды pPS51 для получения плазмиды pPS61.

Пример 16. Построение плазмиды pPS62.

ДНК плазмиды pPS57 (пример 11) гидролизуют ферментом Hind III, что приводит к образованию одиночного линейного фрагмента 5,3 т.п.о., который обрабатывают фрагментом Кленова

ДНК полимеразы 1 в присутствии четырех dNTpS (dATP, ТТР, АСТР и с1СТР)„

1 мкл такого фрагмента плазмиды pPS57 вводят в 5,мкл фрагмента 2,1 т.п.о., выделенного из pPS59 как описано в примере 15.

ДНК используют для трансформации.

E.culi К12 С600 (АТСС 33524). Идентифицируют колонии, которые содержат плазмиды со вставками, с анализом на присутствие ограничительного фрагмен45 17 та, содержащего вставку 2, 1 т.п.о. (плазмида pPS62).

Пример 17. Генетическая трансформация Penicillium chrysogenum плазмидами p3SR2, рРБ52 и pPS54.

Штаммы Penici1.1ium chrysogenum или любые промышленные штаммы, полученные из штамма АТСС 9480 путем мутации, селекции или генетического размножения с целью улучшенного продуцирования пенициллина G или пени-.

:циллины Ч, пригодны для использования при получении трансформантов с векторами и плазмидами, отвечающими предлагаемому изобретению.

Приготовление однородного инокулума для клеточной культуры ведут следующим образом.

Р

Для эффективной трансформации кле.— ток Penicillium chrysogenum необходимо удалять стенки клеток с целью образования устойчивых протопластов.

При получении таких протопластов желательно начинать с однородного ино1 кулюма. В противном случае, получение клеток в культуре будет невоспроизводимым, и будет происходить потеря времени при попытке получить протопласты P.chrysogenum из неподходя-. щих или недостаточных количеств клеток.

Ампулу вегетативных клеток ("109 о. к. ед. в 1,0 мл предохраняющей среды: лактоза 5 ., глицерин 10, и

Твин-80 О, 1 ) либо лиофилизированных, либо взятых из системы хранения в жидком азоте и оттаявших при комнатной температуре, разбавляют в 1,0 мл стерильного солевого раствора. 0 1 мл этой суспензии используют для инокуляции каждого из 10 скошенных агаров среди споруляции,.г/л: лактоза 15,0; кукурузный экстракт 2,5; пептон 5,0;

NaC1 4,0; MgSO@7Н О 0,5, KHzPOq.0,6;.

РыС1д 6Н О 0,005; Си$0а 5Нр0 0i002; агар 30,() (рН 7,0) и выдерживают в автоклаве в течение 20 мин при давлении 120 psi (8,4 кг/см ).

Каждый скошенный агар (15к2,5 см) содержит 25 мл отвержденной среды..

Инокулюм, равномерно распределенный по поверхности скошенного агара, выращивают при 250С до тех пор, пока не образуются и не спорулируются слившаяся сетка мицелия (для большинства штаммов 1 нед). Продукт выращивают из скошенного arapa 1 сус- пендируют в 10 мл стерильной водной

Вводят достаточное количество

4п буферного раствора до конечной концентрации клеток 1 г клеточной массы на 50 мл буферного раствора. Эту клеточную суспензию помещают an встряхиваемую роторную водяную баню в 250миллилитровой встряхиваемой колбе и инкубируют при 29 — 30оС в течение

10 мин при 140 об/мин. Обработанные дитиотрейталом клетки центрифугируют, . повторно суспензируют в 50 мл ферментного раствора (10 мг/мл Novozym

Novoinduscri А/В Bagsvaerd, Дания):

0,1 M трис(оксиметил)аминометанхлоргидрат; 0,01 M MgSOy, 0,01 M дитиотрентол; 1,00 И КС1 и рН 5,8, во встряхиваемой колбе на 250 мл. Эту кислотную суспензию высевают в роторном встряхивателе.с водяной баней и инкубируют при 29 — 30 С в течение о

15 мин .при 140 об./мин с вертикальным

39856 46

-среды культивирования, и суспеййию

; переносят в 106 мл водной среды культивирования. Колбу, содержащую сус5 пендированные клетки, помещают в роторный встряхивающий аппарат, и осуществляют инкубацию при 250С в течение 18 ч при 285 об../мин при вер. тикальном ходе 25,4 мм.

Водную среду культивирования готовят следующим образом: 100 мл раствора А, г/л: сахароза 36; L-аспарагин 7,5; КН РО 15; К НРОа 21; NazSO4

0,75; MgSOq.7HzO 0,18; CaClz 0,06> !

5 солевой раствор 1 мл/л (рН естествен. ной среды) вводят во встряхиваемую колбу объемом 500 мл. Колбу закрывают и выдерживают в автоклаве при о

121 С в течение 20 мин. Затем 2 мл раствора В (глюкоза 108 г/л) и 4 мл раствора С (сахароза 25 г/л; кукурузный экстракт — 4 мас.%/об.азота)

12 ° 5 мл; ацетат аммония 5,5 г/л;

СаСО 5 г/л, рН доводят до 6,5 посредством КОН; выдерживают в автокла ве при 121 С в течение 20 мин) вводят о в раствор А для получения водной среды культивирования..

Для приготовления протопластов

30 penici11ium клетки от 24-часовой культуры собирают посредством фильтI рации с всасыванием (бумага Ватмана

1 с использованием воронки Бюхнера) и суспензируют в буферном растворе (0,01 M Ipañ-(оксиметил)аминометан35 хлоргидрат; 0,01 И MgSO, 0,01 М дитиотреитол; 1,00 М КС1 и рН 7,0 с

НС1).

47

17 ходом 25,4 мм, Обработанные ферментные клетки центрифугируют при 1240 Xg в течение 6 мин, осадок повторно суспенэируют в растворе (0,01 N трис-оксиметил, 0,01 И Ия$04., i 00 M КС1, pll 7,0). Суспенэию центрифугируют при

950 Х8 в течение 6 мин, осадок суспензируют в том же буферном растворе, центрифугируют при 700 Xg в течение

6 мин, осадок снова суспендируют в

5 мл того же буферного раствора. Суспензия содержит большие протопласты и разрушающиеся при осмосе клетки, которые сохраняют некоторую структуру клеточной стенки. По сравнению с

* небольшими протопластами, удаленными согласно описанной процедуре, процент протопластов, способных к регенерации клеточных стенок, и процент жизнеспособных осмотически стойких клеток выше для крупных протопластов и сомотически разрушаемых клеток в клеточной суспензии. Суспенэию клеток разбавляют раствором до концентрации 2õ10 кл./мл.

Процедура трансформации следующая.

0,1 мл суспензии осмотически разрушенных клеток penicillium chrysogenum (примерно 2к10 кл.) дополняют

10 мкл 50 мИ СаС1, 25 мкг ДНК плаэ-. миды в 5, - 15 мкл буферного раствора

ТЕ и 0,9 мл. раствора свежерастворенного полиэтиленгликоля 4000. Смесь перемешивают, выдерживают в течение

10 мин при комнатнои температуре, центрифугируют при 700 Xg в течение

2 мин и снова перемешивают. По 0,5 мл суспензии наносят на поверхность осмотически стойкой стабилизированной ацетамидной среды -(1,7 г/л дрожжевого азотистого основания без аминокислот и сульфата аммония; 125 г/л сахарозы, 0,738 г/л ацетамида;

1,27 г/л СаС1 и 22 г/л агара Noble).

Для измерения суммарного количества жизнеспособных клеток, присутствующих в смеси трансформации, аликвоты от этой смеси трансформации высевают в чашки со средой, в которой ацетамид заменен равномолярным количеством сульфата аммония. Спустя 7 10 дн после трансформации в ацетамидной среде присутствуют колонии трансфор мантов для пересева. Абортивные трансформанты легко отделяются от стойких трансформантов, поскольку абортивные трансформанты не растут при пересеве в свежеприготовленную

39856

48 ацетамидную среду. Клетки трансформи= руют плазмидой, содержащей ацетами= дазный ген от видимых колоний, через

4 = 5 дн после трансформации, Анализ трансформант Penicillium

chrysogenum/p3SR2, P.chrysogenum/

/pPS52 и P.chxysogenum/рРБ54.

Трансформанты Р.chxysogenim/РЗБК2, P,chrysogenum/pPS52 и P.chrysogenum/

/pPS54 проявляют активность ацета= мидазы, не обнаруженную в экстрактах нетрансформированного штамма = реци= пиента P.chrysogenum (например, АТСС

9480). Эта активность является результатом способности трансформиро= ванных штаммов расти с использованием аммиака, выцеляемого при ацетамиднои гидролизе, когда не имеется никако=

ro другого источника азота. Стойкость трансформантов расти на ацетамиде как единственном источнике азота по-. казывает функциональность ацетами-. дазного .гена Aspergillus nidulans в

5 l0 г5

chrysogenum

Трансформирующий фенотип (способ.— ность расти на ацетамиде как единст венном источнике азота) сохраняется трансформантами после пропускания через неселективную среду.

Hp и м е р 18. Генетическая трансформация Penicillium chrysogenum плазмидами pPS55 и pPS57, Получение протопластов Penicillium

chrysogenum осуществляется аналогич=

35 но примеру 17.

Процедуру трансформации осуществ= ляют по примеру l7 с использованием

ДНК плазмид РРБ55 и РР$57. Клетки, трансформированные плазмидой, содер-. ц) жащей гибридный ген HmR, образовы вают видимые колонии через 7 10 дн после трансформации. Присутствие трифторперизина в хлориде кадмия в основной среде приводит к увеличению чувствительности клеток Р,chrysogenum к гидромицину В.

Анализ трансформантов P.chrysogenum/ðÐÁ55 и P.«hrysogenum/рРБ57, P.chrysogenum/pPS55 и P.«hrysogenum/

/PS57 проявляет активность гидроми цин В фосфотрансферазы, не обнаРУ-. живаемую в экстрактах нетрансфарми= рованногî P.chrysogenum (нацример, АТСС 9480). Эта активность приводит в результате к способности трансфор мированных штаммов расти в присутствии токсичных концентраций гидромицина В (с вводом гидромицина В в грибковые

Плазмнды рР$62 и pPS61 содержат гибридный ген DACS/DAOCS, построен ный путем сращивания промотора гена

P.chrysogenum ХР$ с кодирующей после-. довательностью гена СерЬа1оэрогЫш

acremonium РАС$/DAOCS. Естественный и гибридный гены кодируют синтез как деацетоксицефалоспорин С синтетазы (экснандаза), так и деацетилцефалос " порин С синтетазы (гидроксилаза).

49 .1 клетки, ускоряемым при экспонирова= нии кадмиевым ионом и трифторпераэи-. ном (TFP). Способность трансформант расти в присутствии токсичных кон= центраций гидромицина В (усиленная кадмиевым и TFP) показывает, что гиб= ридный ген HmR функционирует в Р.

chrysogenum. Более высокие частоты трансформации, получаемые с плазми;цой рР857, по сравнению с плаэмидой рР$55, показывают, что промотор и

5 регуляторные последовательности

Р. chrysogenum lPS функционируют лучше в Р. chrysogenum, чем промотор и 5> -регуляторные последовательности гена

Cephalosporium acremonium ХР8, при= сутствующего в гибридных генах, ко= торые несет плазмида pPS55.

Производные плазмид pPS55 и рР857, содержащие ген P.chrysogenum, могут использоваться для образования.штам мов с титрами пенициллина V, пре вышающими титр их нетрансформирован= ных родителей, благодаря более высо" кому продуцированию ХР8 в трансфор= . мантах.

Пример 19. Генетическая трансформация Penicillium chrysoge- .

num c плазмидами pPS62 и рР$61.

Приготовление инокулюма для кле точной культуры, приготовление протопластов Penicillium chrysogenum u процедуры трансформации для исполь-.. зования плазмиды pPS62 или рР$61 для трансформации P.chrysogenum ана-. логичны, описанным в примерах 17 и

18. Плазмнда рР$62 содержит ген HmR как селективный маркер, плазмида рР$61, = ген amdS как селективный мар кер.

Анализ трансформантов P::,chrósogenum/рР$62 и P.chrysogenum/pPS61.

Стойкие трансформанты P.chrysogenum/pPS62 и P.chrysogenum pPS61 не-. сут трансформирующую высокомолекуляр ную ДНК. Данный трансформирующий фенотип сохраняется после прохождения через неселективную среду.

7. 39856

Активности фермента определяют соот ветственно путем катализа пеницилли на N до деацетоксицефалоспорина С (экспандазы) и деацетоксицефалоспори на С до деацетилцефалоспорина С (гидроксилазы). Экстракты трансформантов

Р.chrysogenum рР$61 и. P.chrysogenum рР$62 проявляют активности экспанда эы и гидроксилазы. Эти активности не обнаружены в экстрактах нетрансфор" мированных штаммов Р.chrysogenum..

Промотор и трансляционная активирую щая последовательность от гена P.

chrysogenum IPS, присутствующие в гибридном гене DACS/DAOCS плазмиды

pPS61 и pPS62, функцибнируют в Р.

chrysogenum, что позволяет выявить активности экспандазы и гидроксилаз

20 мы о

Пример 20. Генетическая г трансформация Cephalosporium acremonium плазмидой рР$56.

Штаммы Cephalosporium или любые

Z5 коммерческие штаммы, полученные из

АТСС 11550 путем мутации, селекции нли генетического размножения с целью улучшенного продуцирования

iцефалоспорина С пригодны для получе ния трансформантов векторами и плаз мидами, отвечающими предлагаемому изобретению.

Получение инокулюма для клеточной культуры ведут следующим образом.

Для эффективной трансформации кле

З5 ток СерЬа1озрогЫш асгешопдиш:необ ходимо удалять клеточные стенки для образования стойких протопластов.

При приготовлении таких протопластов желательно начинать с однородного

4О инокулюма. В других случаях приготов ление клеток в культуре будет невос производимым и будет потеряно время при попытке получения протопластов

С.acremonium из неподходящих или не

45 достаточных количеств клеток.

Для получения однородного инокулю ма для клеточной культуры ампулу со спорами разбавляют 5 мл стерильного солевого раствора. О, 1 мл данной сусЯ1 пензии используют. для инокуляции

50 скошенных агаров содержащих 20 мп среды соевого агара триптиказы (BBL).

Перед инокулированием среду подвергают высушиванию досуха. Инокулированные скошенные агары инкубируют в течение 4 дн при 25+C. 10 ил предохранительной среды вводят в среду ,.роста мицелия,.которая покрывает поверхность среды в каждом скошенном

1739856.52 агаре, Скошенные агары перемешивают с целью суспензировання конидий. Суспензии конидий от каждого скошенного, агара объединяют и 10-миллилнтровые аликвоты замораживают при -ЯЬ С. 3a- мороженная суспензия конидий медленно теряет жизнеспособность и ее нельзя использовать после 3 мес хранения при -80 С.

Рост клеток:для приготовления протопластов ведут следующим образом.

106 мп водной среды в 500-миллилитровой встряхиваемой колбе инокулируют клетками от 10 мл замороженной суспензии конидий. Клетки получают путем центрифугирования (10 мин р я2600 об,/мин) и суспензирования в вод- ной среде культивации. До суспензиро-, вания необходима декантация поверхностного слоя, посколькулактоза и глицерин отрицательно влияют на рост клеток. Колбу, содержащую суспензированные клетки, помещают в роторный встряхиватель с водяной баней и инкуби- руют при 29 — 30 С в течение 24 ч при

285 об./мин с вертикальным ходом

25,4 мм при 29 — 30 С. Необходимо от метить, .что температура 29 ЗО C отлична от температуры (25 C) предпочтительной для культивации Cephalosporrium acremonium для целей про: дуцирования антибиотика, Для получения протопластов клетки от 24часовой культуры собирают пу тем фильтрации с всасыванием (Бума га Ватмана ф1 в воронке Бюхнера) и суспендируют в осмотически стабили" зированном буферном растворе (0,8 M

NaCl 0,1 И Мя$0 и 10 мМ.Na+POy, рН 7„0), в который вводят восстанав" ливающнй реагент дитиотрентол до концентрации 0,05 М при конечной концентрации клеток 1 r (после фильтра ции с всасыванием) клеточной массы на 20 мл буферного раствора. Суспензию помещают в роторный встряхиватель с водяной баней и инкубируют при

29 " 30 С в течение 10 мин. 2мер: каптоэтанол при конечной концентрации

40 мМ может быть использован в ка честве восстанавливающего реагента.

Обработанные дитиотреитолом клетки собирают путем центрифугирования и повторно суспензируют в растворе (10 мг/мп Novorvm. 234 из Novo Biolabs, Bagsvaerd, Дания; 0,8 М ИаС1, б,1 И Mg$0 10 M NaH

ЗООС на 15 " 30 мин. Суспензию протопластов подвергают вихревому пере= мешиванию в течение 2 - 3 с для освобоидения протопластов, пока еще свя занных с фрагментами мнцелия. Эта процедура приводит к образованию ге терогенной в отношении их размеров популяции протопластов, Для процедуры трансформации для каждой плазмиды используют О, 1 мл

15 суспензии, содержащей (1 5) Х 10 протопластов Cephalosporium в 0,8 М

NaC1 и 80 М СаС1 . 20 мкг плазмиды и полиэтиленгликоля 4000 вводят по примеру 17 в суспензию протопластов для получения смеси трансформации объемом 1, 1 мл. Эту смесь инкубируют в течение lU мин при комнатной тем= пературе и центрифугируют. Затем про топласты подвергают вихревому переме шиванию в той же.жидкости. Аликвоты (0 1 мл) наносят на поверхность трип" сиказо соевой агаровой среды (BBL), обогащенной 10,87-. ной сахарозой для осмотической стабилизации протоплас-.

3О тов. После инкубации чашек Петри при

15 С в течение 24 ч в каждую чашку

Петри добавляют 4 мл сжиженного агара (0,41 мас.%/об. при 42 С), содержащего 0,8 М МаС1, н гидромицин В до

35 конечной концентрации 100 мкг/мл.

Ытаммы С.acremonium, проявляющие низ" кую скорость роста в результате черезмерного мутагенеза, подвергают воз= действию пониженного количества гид

40 ромицина в ходе операции отбора (например, конечной концентрации

10 мкл/мл). После удаления верхнего слоя чашки Петри инкубируют при 25 C в увлажненной камере.

45 Анализ трансформант Cephalosporium acremonium pPS56 проводят сле

-дующим образом.

Плазмида рР$56 особенно эффектив= на в отношении вставки множественных

Я копий гена РАС$/DAOCS в высокомоле кулярную ДНК Cephalosperium acremonium„ поскольку она содержит гибридный ген HmR, который функционирует как преобладающий маркер в С .acre55 monium

Плазмида pPS56 может быть исполь= зована для создания штаммов Cepha1osporium acremonium с цефалоспори ном С с титрами более высокими, чем .

9856 - . 54 и антибиотического продуцирования, так что имеет место лишь влияние по вышенных активностей DAOCS и::DACS на синтез цефалоспорина С.

С °

Транс@орманты С.асгешопйлап рРБ56 с повышенным продуцированием цефалоспорина С являются ценными продуктами для изготовления клинически важных цефалоспориновых антибиотиков, таких как цефалотиннатрий, цефамандолнафат и цефазолиннатрий.

Формула изобретения

Способ констрщпювания рекомби-" нантной плазмидной ДНК,.кодирующей

15 фермент деацетоксицефалоспорин С

"синтетазу/деацетилцефалоспорин С синтетазу со следующей аминокислот, ной последовательностью:

Ц2Й"ИЕТ. TJIR SER LYS VAL PRO VAL P)fE ARG LEU

"ASP ASP LEU LYS SER GLY LYS VAL IEV TlIR GLU LEU ALA GLU АЬЛ.ЧАЬ

ТИК ТНК LYS CI.Y 11Е РНЕ TYR LEU ТНВ GLU SER GIY IEU VAL ASP ASP

A$P HIS TllR SER hI.A hRG CLU THR CYS VhL ASP РНЕ PHE 1,1 3 hSN СЬТ

SER CI.U GLU С1Я .LYS ARG ALA ЧАЬ THR LEU ALA ASP hRC ASN ALA ARG

ARG GLY PHE SER ALA LEU GLU TRP GLU SER ТНК ALA VAL VAL THR GLU

THR GLY LYS TYR SER ASP -TYR SER ТЛЯ CYS TYR SER ИЕТ GLY ELE GLY.

GLY hSN LEU РНЕ PRO ASN ARG GLY РИЕ GLU ASP ЧАЬ TRP GLN ASP TYR

РНЕ ASP ARG MET TYR GLY ALA ALA LYS ASP VAL АЬА ARG ALA ЧЛЬ LEU

ASN БЕЙ ЧАЬ GLY АЬ. hLA PRO LEU АIЛ GLY СIЯ ASP ILK ASP ASP PXE VAL

ОУЗ CYS ЛБР PRO I.EU ЬЕО ARG LEU ARG TYR PIK PRO GLU VAL.PRO CLU

ASP ARG UhL hLA GLU CLU GLU PRO LEU ARG ИЕТ GLY PRO HIS TYR ASP, LEU SER ТНЯ ILE TlfR LEU. UAL HIS GI.N THR ALA CYS ALA ASN GLY Р1Е

ЧЛЬ БЕЙ ЬЕ0 С1.0 СУБ СЬО ЧАЬ АБР СЬУ С10 РНЕ ЧАЬ АБР ЬЕ0 РВО ТИК

;LEU PRO GLY А LA MET VAL VAL PHE CYS СЬУ ALA ЧЛЬ GLY THR LEU ALA

ТИК С Y GLY LYS VAL LYS.ALA PRO LYS )fIS" ARC VAL LYS SER PRO GLY

ARG ASP GLN-hRG VhL GLY SER SER ARG ТНВ SER SER VAL PHE РНЕ LEU

hRC PRO LYS PRO ASP РНЕ SER РНЕ ASN VAL CLN GLN SER ARG GLU TRP

° °

GD Ь1Е ANN VAL ARG ILE PRO SER GLU ARC TIIR THR PHE ARG GLU TRP

ЮО GLY С}Л ASN TYR V. YR VhL ASN MET ARC hRG hSP LYS PRO ALA АЬА ЛЬА

GLU ht.A ЛЬЛ VAI. PRO. PRO ЛЬЛ ALA ALA PRO ЧИ SER ТНЯ"ALA ALA PRO ИЕ

hLh ТИВ-СООН, заключающийся в том, что осуществляют лигирование фрагмента ДНК кодирующег 5:»регуляторные последовательности промотора или гена иэопенициллинN-синтетазы Cvphalusporium acremu53 I73 у нетрансформированных штаммов, за счет копий внехромосомного гена

DACS/DAOCS. Копии внехромосомного гена вызывают более высокие активности

DAOCS/DACS, которые способствуют по-. вышенному синтезу цефалоспорина, С.

Итаммы С. acremvnium, продуцируыЦие большие количества цефалоспорина C и значительные количества пенициллина

N, являются ценными родительскими штаммами для. трансформаций с иснольэованием плазмиды pPS56 с целью по лучения трансформантов, которые более эффективно превращают пенициллин N в цефалоспорин С. Желаемые. трансформанты С.acremonium/рР$56 несут транс= формирующие ДНК в качестве вставок в нейтральных зонах в отношении роста

nium или Penicillium с фрагментом

ДНК, кодирующим DAOCS/DACS со сле» дующей нуклеотидной последовательно стью:

1739856 56

Ы =ATG- ACT ТСС ЛЛС- (.ТС ССС (ТС ТТТ G(T СТС(QAC GhC СТС ЛЛ(Л(С G(С ЛЛС- GTC CTG АСС (ЛС СТС GGG 6АС- (СС GTC

AGG AGG АЛ(ССТ АТС ТТС ТЛС TTG. ЛСС (A(ABC GGC СТО GTC GAC (AC

И(САС АСС ТС(- ССС- G(T GAG ЛСС- TGC tTT (AC TTT TTC ЛЛЫ ААС GOA ЛСС ЯЛС (A((АИ ЛЛ(- АСС GCG (Т(AC(СТС GCG ГАС ССТ AAC KC ССС

CQC GGC TTC ТСТ (CU СТС.(AG Ta 9Л(АСС ACC OCC GTC GTC АСС 0Л9

ЛСС- ОСС АЛЯ. ТАС ТСС- GAG ТЛС ТСО ЛСС ТСС ТАС TCG ЛТС Я6С ЛТС GGC

QGC ЛЛС СТС .TTC CCQ AAC CGG CCC ТТС QA(ЬЛС G_#_ TG(СЛ& &АС ТЛС

ТТС GAG С(С АТС- TAC CGC CGA KC AAQ ОАТ 9ТС GC8 CGC GCC GTT CTC

AAG ТСТ QT(G4C GCG CUO GTG, GGG Ж(GAG GAG ЛТТ 8ЛТ GAG TTC GTC

QA(ТСС CAT CCC GTG СТС C(C СТЛ СС(ТЛС ТТС ССС ОЛЛ GTO ССО йИ. (AG ССС И. С ("СС QAA ЬЛ((ЛЛ ССС (.ТС С(С AT(Ий ССС СЛС ТЛС SAC

Ф

СТА. TG| ЛСС ЛТС AG(СТС GT(СЛС СЛ9 ЛСЛ UGG ТОС 8CG ААС BOG TTC

QTG ЛЫС CTG- СЛС GG ЫО- ОТО GAC 93A 8ЛЛ ТТС 6ТС ЬЛС СТС CG9 ACQСТС GGG QGC GCC ЛТС- СТС СТС ТТС TGG M G 6С(8ТС С6С ЛСС СТ8 8СС

ЛСЫ-ССС (. ("С AA(UTG AAG- (СО ССС AA(СЛС СИ ОТС ЛЛВ ТСТ ССС 866.

GQC QAC СЛ(3.CGС GTG (GC Л(С AGC С(С ЛСО TC(ABC GTC ТТС.ТТС СТ9

С(. С. СС(," AAQ ССС QAC TTC AGC ТТС АЛС QTQ..CAB-.GAS TC9 AGH. &A& T66("QT TTC АЛС GTC С(С ЛТС CCU- ТСО GAG CGC AC& ACG- TTC А68- &AS. Т88СТТ.QGC ИЖ- ЛЛС ТЛТ UTC АЛС ATQ COG- AGO (ЛТ ААЯ ССО BCG GCA GCGQAU- ССС ССТ GTC ГСС QCO GCT .QCC

CCT (ТС ТСТ ACC GCA OCT ССТ АТЛ

Составитель Т.Забойкина

Техред И.Дидык . Корректор Л.Патай

Редактор И.Дербак

r, Заказ 2013 Тираж Подписное

РчИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101 (ЬЙ АсТ-3, с фрагментом ДНК, кодирующим 3 -«p минальные последовательности гена изоненициллин И-синтетазы Cephalosporium acremonium или Penicillium и фрагментом с генетическим марке- ром Тс", или amds, или Ншг, трансформацию полученными рекомбинантными

ДНК штаммов Escherichia coli или

Penicill ium chrysogenum или Cephalosporium acremonium с по.следующим

4$ отбором клонов, содержащих плазмиды. рТТ507 или pLT511, или pPS58, или рР8359, или pPS60, или pPS61, или

pPS62, или pIL502, нли pPS52 ° или рР 856.