Рекомбинантная плазмидная днк рuавс, кодирующая активатор плазминогена урокиназного типа, способ ее конструирования и штамм бактерий escherichia coli - продуцент активатора плазминогена урокиназного типа

 

Изобретение относится к генной инженерии, а именно к технологии получения рекомбинантных белков, используемых в медицине в качестве тромболитических агентов. Целью изобретения является получение модифицированного активатора плазминогена урокиназного типа человека (мАПУТ) в проферментной форме, лишенного домена, гомалогичного ростовому фактору мАПУТ кодируемый плазмидой рUABC отличается от природной урокиназы заменяет первых аминокислот N-концевого домена, гамологичного эпидермальному растовому фактору, на 15 чужеродных аминокислот. Плазмида pUABC сконструирована путем генно-инженерных манипуляций на основе фрагментов гена урокиназы, полученных в результате скрининга библиотек кДНК. Экспрессия рекомбинантного белка осуществлятся под контролем регуляторных элементов lac оперона вектора pUC 19. Штамм ВКПМ В-4534 продуцент модифицированного АПУТ получен трансформацией клеток E. coli jM 109 плазмидой р АВС. Штамм ВКПМ В-4534 дает 2,2 г клеточное биомассы на 1 л культурной среды и производит модифицированный АПУТ преимущественно в проферментной форме (мол.м. 43 кДа) в количестве 60000 ед. на 1 г биомассы (1 1,5 мг на 1 л культуры). Продукция штамма ВКПМ В-4534 не зависит от присутствия в среде индуктора экспрессии lac-оперона - изопропилтиогалактопиранозида, что значительно облегчает и удешевляет процедуру выращивания бактерий. Применение 2-меркаптоэтанола повышает эффективность ренатурации в 5 раз.

Изобретение относится к генной инженерии, а именно к технологии получения рекомбинантных белков, используемых в медицине в качестве тромболитических агентов. Урокиназа, выделяемая из мочи, представлена тремя формами: низкомолекулярной (33 кДа), высокомолекулярной двухцепочечной (50 55 кДа) и высокомолекулярной одноцепочечной (проурокиназа), со значительным преобладанием низкомолекулярной формы. В медицине используют, главным образом, высокомолекулярные формы, причем предпочтение отдается проурокиназе вследствие ее низкой активности до момента активации на тромбе и высокого сродства к фибрину. Получение проурокиназы из культуральной среды эукариотических клеток-продуцентов сравнительно несложно, но дорого из-за высокой стоимости культивирования клеток. Указанные недостатки послужили причиной развития геннно-инженерного подхода к решению задачи производства активатора плазминогена урокиназного типа в промышленном масштабе. Известны рекомбинантная плазмида, кодирующая урокиназу человека, штамм Escherichia coli продуцент урокиназы, а также условия выращивания бактерий и выделения активного генно-инженерного продукта. Скрининг библиотеки кДНК из культуры клеток карциномы глотки человека Detroit 562 выявил 3 фрагмента кДНК урокиназы. В сумме эти фрагменты содержат всю транслируемую область кДНК. Разделив полученные фрагменты на непересекающиеся субфрагменты с помощью рестриктаз Taq I, Bcl I, Sal I, Bgl II, Pst I и EcoR I, добавив синтетический участок, кодирующий первые 8 аминокислот урокиназы и стартовый триплит ATG и встроив их в описанный ранее вектор pHGH207-I на основе плазмиды pBR322 между сайтами EcoR I и Sal I, получили плазмиду pUK54trp207-I. Плазмида pUK54trp207-I состоит из следующих элементов: ЕcoR I EcoR I фрагмент (4,3 тпо), представляющий собой последовательность нуклеотидов плазмиды pBR322; EcoR I Xba I фрагмент (0,6 тпо), содержащий промоторно-операторную область и участок инициации трансляции триптофанового оперона E.coli; Xba I Taq I фрагмент (0,05 тпо), содержащий синтетический участок ДНК, кодирующий первые 8 аминокислот урокиназы; Tag I EcoR I фрагмент кДНК урокиназы (1,3 тпо). Экспрессия рекомбинантной урокиназы в плазмиде pUK54tpr207-I осуществляется с триптофанового промотора после индукции индолакриловой или индолуксусной кислотой. Трансформированные плазмидой pUK54trp207-I бактерии выращивали на синтетической среде с глюкозой, содержащей 20%-ный дрожжевой экстракт, в 10-литровом ферментере до оптической плотности 20 о.е, после чего добавляли индолакриловую кислоту и продолжали культивирование еще 6 ч. Бактерии осаждали, вскрывали и нерастворимую фракцию белков (тела включения), содержащую рекомбинантную урокиназу, отделяли центрифугированием. Далее следовало растворение осадка в 6 М гуанидинхлориде и реассоциация S-S-связей в разбавленном водном растворе в присутствии 1 М гуанидинхлорида, 0,2 М аргинин-хлорида, 1,25 мМ восстановленного глютатиона и 0,25 мМ окисленного глютатиона при рН 9,0 с последующим диализом. По последним данным, удалось достичь выхода 42 800 ед. активной урокиназы на 1 л биомассы. По-видимому, описанные плазмиды и штамм-продуцент рекомбинантной урокиназы, не позволяют получить более высокого выхода активности. Недостатками этого технического решения являются низкая эффективность ренатурации рекомбинантного белка (10%) и использование индуктора, которое приводит к удорожанию продукции. С точки зрения использования в медицине природные продукты не всегда оказываются оптимальными, и некоторые направленные модификации могут приводит к заметному улучшению их качеств. Природная урокиназа содержит на N-конце домен, гомологичный эпидермальному ростовому фактору, который отвечает за связанные со специфическим рецептором на поверхности определенных типов клеток, в том числе злокачественного происхождения. Адсорбция урокиназы придает клеткам дополнительную подвижность, что в некоторых случаях может оказаться причиной возникновения метастазов. Урокиназа с утраченным или видоизмененным N-концевым доменом (мАПУТ) не должна вызывать такого рода нежелательных эффектов. Целью изобретения является получение модифицированного активатора плазминогена урокиназного типа в проферментной форме, лишенного домена, гомологичного ростовому фактору. Заявленное техническое решение позволяет также упростить процедуру выращивания бактерий продуцентов и повысить эффективность ренатурации генно-инженерного продукта. Указанная цель достигается с помощью плазмиды pUABC. Плазмида pUABC имеет размер 4,11 тпо, кодирует модифицированный АПУТ и состоит из следующих элементов: Xba I Bql I фрагмент (1,39 тпо), содержащий район инициации репликации и промоторной-операторную область lac-оперона вектора pUC19; Bql I Pst I фрагмент (1,28 тпо), содержащий ген лактамазы вектора pUC18; Pst I Xba I фрагмент кДНК урокиназы человека (1,44 тпо). Рекомбинантный АПУТ, кодируемый данной плазмидой, отличается от природной урокиназы заменой первых 24 аминокислот N-концевого домена, гомологичного эпидермальному ростовому фактору, на 15 чужеродных аминокислот. Для конструирования плазмиды pUABC используют штамм Escherichia coli K-12 JM109, векторы pUC18, pUC19 и фрагменты кДНК урокиназы человека Sca I EcoR I (0,42 тпо), EcoR I EcoR I (0,42 тпо) и EcoR I Pst I (0,60 тпо), полученные в результате иммуно- и олигонуклеотидного скрининга библиотеки кДНК HL1011b на основе gt11 (фирма "CLONTECH") из легочных фибропластов человека. Конструирование плазмиды pUABC, обеспечивающий синтез модифицированного АПУТ, осуществляют следующим образом, EcoR I Pst I фрагмент (0,60 тпо) кДНК урокиназы соединяют с расщепленным рестриктазами EcoR I и Pst I вектором pUC18 с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Полученной смесью трансформируют клетки E. coli JM109 и из трансформантов, устойчивых к ампициллину и образующих колонии белого цвета на LB-агаре с X-gal и изопропилтиогалактопиранозидом, выделяют плазмиду, обозначенную как pUC18 uro1039-1642. Точно так же соединением Sca I EcoR I фрагмента (0,42 тпо) кДНК с векторной ДНК pUC19, обработанной рестриктазой Xba I и фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I в присутствии dATP, dCTP, dGTP и ТТР и расщепленной затем рестриктазой EcoR I, получают плазмиду, обозначенную как pUC19 uro204-623. Далее плазмиду pUC18 uro1039-1642 расщепляют рестриктазами EcoR I и Bfl I и после электрофоретического разделения образовавшихся продуктов извлекают из агарозного геля фрагменты размером 0,77 тпо и 1,1 тпо, которые соединяют с приготовленным аналогичным образом EcoR I Bgl I фрагментом (1,8 тпо) плазмиды pUC19 uro204-623 для получения плазмиды, обозначенной как pUC19 uro204-623/1039-1642. Эти плазмиду, в свою очередь, расщепляют рестриктазой EcoR I, дефосфорилируют, соединяют с EcoR I EcoR I фрагментом (0,42 тпо) кДНК урокиназы и из полученных после трансформации E. coli плазмид отбирают такую, в которой направление трансляции встроенного фрагмента совпадает с направлением трансляции остальной части рекомбинантной ДНК, о чем судят по наличию полосы 0,65 тпо на электрофореграмме после расщепления плазмиды рестриктазами BamH I и Ban II. Полученную плазмиду обозначают pUABC. Штамм продуцент характеризуется следующими признаками. Штамм ВКПМ В-4534 продуцент модифицированного АПУТ получен трансформацией клеток E.coli JM109 плазмидой pUABC. Штамм ВКПМ В-4534 устойчив к ампициллину, образует круглые, ровные колонии с голубой опалесценцией, при выращивании на LB-среде дает 2,2 г клеточной биомассы на 1 л культуральной среды и производит модифицированный АПУТ преимущественно в проферментной форме (мол.м. 43 кДа) в количестве 60000 ед. на 1 г биомассы. Как показывают исследования, продукция штамма ВКПМ В-4534 не зависит от присутствия или отсутствия в культуральной среде индуктора экспрессии lac-оперона изопропилтиогалактопиранозида (ИПТГ). Можно предположить, что в плазмиде pUABC в районе стыка ее векторной части с фрагментом, кодирующим мАПУТ, образовался новый регулярный элемент, устраняющий зависимость экспрессии от индуктора. Для получения активного рекомбинантного мАПУТ штамм продуцент выращивают на LB-среде, клетки осаждают центрифугированием, вскрывают обработкой лизоцином и ультразвуком, осадочную фракцию белков растворяют в гуанидинхлориде или мочевине с 2-меркаптоэтанолом, разбавляют и проводят ренатурацию в присутствии денатурирующего агента (гуанидинхлорид или мочевина) и окисленной и восстановленной форм глютатиона, после чего препарат диализуют. Активность продукта измеряют в месте на фибринолизис. Для этого 40 мл бычьего фибриногена растворяют в 10 мл буфера (100 мМ NaCl, 20 мМ фосфат натрия, рН 7,5, 5% -ный глицерин) при 37^оС, добавляют 0,8 ед. тромбина, смешивают с равным объемом охлажденного до 37^оС 1,2%-ного расплава агарозы и выливают на полистироловую плашку площадью 10 см². Через 2 ч на образовавшийся фибрин-агарозный гель наносят 2 мкл тестируемого образца в капле, а на другие места геля наносят 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2 и 5 ед. урокиназы фирмы "Calbiochem" (3200 ед. в упаковке) также в каплях по 2 мкл. После 20-часовой инкубации при 20^оС измеряют диаметры прозрачных зон, строят калибровочную кривую зависимости диаметра зоны от логарифма количества урокиназы в капле и с ее помощью определяют активность активатора плазминогена в тестируемом образце. Как правило, активность мАПУТ в образце составляет не менее 300 ед/мл, что соответствует 55 000 ед. на 1 г биомассы. П р и м е р 1. Конструирование плазмиды pUABC, кодирующей модифицированный АПУТ. Плазмидную ДНК векторов pUC18 и pUC19 выделяют щелочным методом, 0,5 мкг ДНК вектора pUC19 расщепляют рестриктазой Xba I в 20 мкл буфера, добавляют dAТP, dGTP, dCTP и ТТР до концентрации 100 мкМ каждого. 0,5 ед. фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I и инкубируют еще 15 мин при 22^оС. Реакцию останавливают добавлением ЭДТА до 10 мМ, проводят фенольную депротеинизацию, ДНК осаждают добавлением равного объема 5 М ацетата калия и пяти объемов этанола с последующим центрифугированием 10 мин в микроцентрифуге при 14000 об/мин. Осадок растворяют в 25 мкл буфера, проводят обработку рестриктазой EcoR I, повторную депротеинизацию и осаждение этанолом. Приготовленный таким образом вектор смешивают с 0,5 мкг Sca I EcoR I фрагмента (0,42 тпо) кДНК урокиназы в 50 мкл лигазного буфера, содержащего 25 мМ трис-HCl, рН 7,7 10 мМ MgCl₂, 200 мМ АТР, 50 мкг/мл BSA, 0,01 мМ ЭДТА, 5 мМ 2-меркаптоэтанол, добавляют ДНК-лигазу фага Т4 (1000 ед/мл) из расчета 0,5 мкл фермента на 1 мкг ДНК и инкубируют 15 ч при 5^оС. По окончании инкубации реакционной смесью трансформируют клетки штамма E.coli JM109 по следующей методике: хранящиеся замороженными (-70^оС) компетентные клетки размораживают во льду, 200 мкл суспензии клеток смешивают с раствором лигированной ДНК и инкубируют 30 мин при 0^оС. Затем пробу инкубируют 90^оС при 42^оС и 2 мин при 0^оС. После пятикратного разбавления средой LB с 0,2%-ной глюкозой клетки подращивают 1 ч при 37^оС, высевают на чашки с LB-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина, 40 мкг/мл X-gal и 1 мМ ИПТГ, и выращивают колонии трансформантов в течение 18 ч. Далее клетки шести колоний белого цвета переносят в отдельные пробирки с 1 мл LB-среды, выращивают до насыщения и выделяют плазмидную ДНК щелочным методом. Образцы ДНК анализируют на наличие вставки EcoR I Xba I, о чем судят по наличию полосы 0,42 тпо на электрофореграмме после расщепления ДНК этими рестриктазами и разделения продуктов с 1%-ном агарозном геле. Плазмиду, содержащую указанную вставку, обозначают pUC19 uro204-623. Аналогичным образом, соединением EcoR I Pst I фрагмента (0,60 тпо) кДНК урокиназы с расщепленным теми же рестриктазами вектором pUC18, получают плазмиду pUC18 uro1039-1642. На следующей стадии 2 мкг ДНК плазмиды pUC18 urо1039-1642 и отдельно 2 мкг ДНК плазмиды pUC19 uro204-623, каждая в объеме 20 мкл буфера, расщепляют рестриктазами EcoR I и Bgl I. Продукты реакций разделяют электрофорезом в 1% -ном агарозном геле в присутствии 0,5 мкг/мл бромистого этидия, полосы ДНК, соответствующие размерам в первом случае 0,77 тпо и 1,1 тпо, во втором 1,8 тпо, вырезают под ультрафиолетовой лампой и элюируют из геля. Элюированные фрагменты ДНК объединяют, обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 и реакционной смесью трансформируют клетки штамма E.coli JM109, получая плазмиду pUC19 uro204-623/1039-1642. На последней стадии 1 мкг ДНК pUC19 uro204-623/1039-1642 расщепляют рестриктазой ЕcoR I, обрабатывают бактериальной щелочной фосфатазой и соединяют с 0,1 мкг EcoR I EcoR I фрагмента (0,42 тпо) кДНК урокиназы с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Реакционной смесью трансформируют клетки E.coli JM109, из получившихся клонов выделяют ДНК и анализируют на наличие и правильное расположение EcoR I EcoR I вставки, для чего ДНК расщепляют одновременно рестриктазами BamH I и Ban II и разделяют электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. В случае правильной ориентации наблюдается полоса ДНК 0,65 тпо. В противном случае вместо нее присутствует полоса 0,35 тпо. Полученную плазмиду обозначают pUABC. П р и м е р 2. Получение биологически активного рекомбинантного модифицированного активатора плазминогена урокиназного типа. Бактерии штамма E.coli ВКПМ В-4534, содержащие плазмиду pUABC, выращивают до плотности OD 3,0 в течение 16 ч в 50 мл LB-среды с ампициллином (100 мкг/мл) при 37^оС и интенсивной аэрации. По окончании выращивания клетки собирают центрифугированием 30 мин при 4000 об/мин, суспендируют в 2,5 мкл 20 мМ Трис-HCl, рН 6,7, 30 мМ NaCl, добавляют 2,5 мг лизоцима, инкубируют 10 мин при 4^оС, добавляют Трис-HCl, рН 8,3 до 50 мМ, ЭДТА до 20 мМ, инкубируют 30 мин при 4^оС, после чего обрабатывают ультразвуком 1 мин. Осадочную фракцию клеточного экстракта отделяют центрифугированием в течение 90 мин при 5000 об/мин, суспендируют в 1 мл 2%-ного Тритона Х-100, центрифугируют 5 мин при 14000 об/мин, суспендируют в 100 мкл 200 мМ ЭДТА, 500 мМ Трис-HCl, рН 8,0, добавляют 800 мкл денатурирующего раствора (6 М гуанидинхлорид, 100 мМ 2-меркаптоэтанол), инкубируют 20 мин при 65^оС, нерастворимый осадок убирают центрифугированием. Операцию восстановления ферментативной активности проводят следующим образом. Раствор разбавляют в 20 раз буфером, содержащим 100 мМ Трис-НСl, рН 9,0, 200 мМ аргинин-хлорид, 5 мМ восстановленный глютатион, 1 мМ окисленный глютатион, денатурирующий агент (1 М гуанидинхлорид), инкубируют 40 ч при 4^оС, после чего диализуют против двух семен по 1 л 100 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, в течение 6 ч, выпавший осадок удаляют центрифугированием и измеряют активность в тесте на фибринолизис как описано выше. Активность мАПУТ в образце составляет 320 ед./мл. Ренатурированный рекомбинантный модифицированный активатор плазминогена представлен, главным образом, проферментной формой с молекулярной массой 43 кДа, что демонстрируют данные электрофоретического и зимографического анализов. Выход активного АПУТ, составляющий в пересчете на единицу веса биомассы 60000 ед. на 1 г биомассы, превосходит в 1,4 раза выход рекомбинантной урокиназы, указанный в известных работах. Таким образом, сконструированная новым способом плазмидная ДНК и штамм E. coli, трансформированный ею, дали возможность получить модифицированную форму рекомбинантного активатора плазминогена урокиназного типа с высоким выходом. Выращивание бактерий продуцентов без индуктора удешевляет и упрощает процедуру культивирования. Проведение ренатурации с использованием 2-меркаптоэтанола позволило повысить эффективность этой операции в 5 раз.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рUАВС, кодирующая активатор плазминогена урокиназного типа размером 4,11 тпо, содержащая: Xba I Bgl I фрагмент ДНК вектора рUС19 размером 1,39 тпо; Bgl I Pst I фрагмент ДНК вектора рUС18 размером 1,28 тпо; Pst I Xba I фрагмент кДНК урокиназы человека размером 1,44 тпо; по три сайта рестрикции Асе I, Pst I; по два сайта рестрикции Bgl I, Hind III, EcoR I; по одному сайту рестрикции BamH I, Xba I; участок инициации репликации и промоторно-операторную область lac-оперона; генетические маркеры; Amp ген устойчивости к ампициллину. 2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК рUАВС, заключающийся в том, что ЕсоR I Pst I фрагмент кДНК урокиназы человека размером 0,60 тпо, полученный в результате скрининга библиотеки кДНК, соединяют с расщепленной рестриктазами ЕсоR I и Pst I ДНК вектора рUС18, Sca I EcoR I фрагмент размером 0,42 тпо кДНК урокиназы соединяют с ДНК-вектора рUС19, обработанной рестриктазой Xba I и фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I в присутствии dATP, dCTP, dGTP и ТТР по сайту EcoR I, получая соответственно плазмиды рUС18 uro 1039-1642 и рUС19 uro 204 623, EcoR I Bgl I фрагменты размером 0,77 тпо и 1,1 тпо плазмиды рUС18 uro 1039 1642 соединяют с EcoR I Bgl I фрагментом размером 1,8 тпо плазмиды рUС19 uro 204 623, получают плазмиду, которую расщепляют рестриктазой EcoR I, дефосфорилируют, соединяют с EcoR I EcoR I фрагментом размером 0,42 тпо ДНК урокиназы, трансформируют полученной смесью клетки Е.coli JM109 и, отбирают клон, содержащий плазмидную ДНК, дающую при расщеплении рестриктазами BamH I и Ban II фрагмент размером 0,65 тпо. 3. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-4534 продуцент активатора плазминогена урокиназного типа.

MM4A Досрочное прекращение действия патента из-за неуплаты в установленный срок пошлины заподдержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 03.03.2009

Дата публикации: 27.08.2011

---