Питательная среда для реакции фогес-проскауэра

 

Использование: медицинская микробиология , питательные среды для идентификации энтеробактерий. Сущность изобретения: питательная среда используется с целью повышения чувствительности среды, точности реакции Фогес-Проскауэра, упрощения способа постановки и учета реакции путем замены питательной основы и введения в состав среды индикатора рН Питательная среда для реакции Фогес-Проскауэра содержит следующие компоненты, г/л: аминопептид 9,0-11,0; глюкоза 11,0- 13,0; калий фосфорно-кислый однозамещенный 9,0-11 0 бромкрезоловый пурпурный 0,192-0,196; поливиниловый спирт 4,0-6,0; дистиллированная вода остальное Новым является введение в состав среды в качестве питательной основы аминопептида, а в качестве индикатора рН - бромкрезоловогс пурпурного. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5I)5 С 12 N 1 /20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ (21) 4873831/13 (22) 29.08.90 (46) 15.06.92. Бюл. N. 22 (71) Научно-производственное объединение

"Аллерген" (72) В.В,Ерещенко, С,А.Угримов и

А,В.Омельченко (53) 576.8.093(088.8) (56) Энтеробактерии/Под ред, Покровского

В.И. M.: Медицина, 1985, с. 280-281. (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ РЕАКЦИИ

ФОГЕС-ПPOCКАУЭPA (57) Использование: медицинская микробиология, питательные среды для идентификации энтеробактерий. Сущность изобретения: питательная среда используИзобретение относится к медицинской микробиологии. а именно к питательным средам для идентификации энтеробакте. рий.

Известна питательная среда для реакции Фогес-Проскауэра, включающая в качестве источника азота пептон. в качестве субстрата — глюкозу и буферную соль — ка-. лий фосфорнокислый однозамещенный при следующем соотношении ингредиентов. г/л:

Пептон 5

Глюкоза

Калий фосфорнокислый однозамещенный (КН2РО4) 5

Устанавливают рН 6,9-7,0.

Указанная среда недостаточно точно дает возможность дифференцировать энтеробактерии. Это обусловлено тем. что реакция Фогес-Проскауэра основана н» выявлении различий в конечных продуктах!

Ж„„1740414 А1 ется с целью повышения чувствительности среды, точности реакции Фогес-Проскауэра, упрощения способа постановки и учета реакции путем замены питательной основы и введения в состав среды индикатора рН.

Питательная среда для реакции Фогес-Проскауэра содержит следующие компоненты, г/n: аминопептид 9,0-11,0; глюкоза 11,013,0; калий фосфорно-кислый однозамещенный 9,0-11.0: бромкрезоловый пурпурный 0,192-0,196; поливиниловый спирт 4,0-6,0; дистиллированная вода остальное, Новым является введение s состав среды в качестве питательной основы аминопептида, а в качестве индикатора рН— бромкрезолового пурпурного. 2 табл. метаболизма глюкозы микроорганизмами: смешанно-кислотной и бутиленгликольной ферментации, промежуточным продуктом которой является ацетоин, Для выявления этого продукта к среде необходимо доба- 4 вить реактивы: щелочь, которая окисляет Ф . ацетоин до диацетила, и а-нафтол, который ( в присутствии диацетила дает комплекс фь. красного цвета различной интенсивности.,а

Учет реакции после добавления реактивов и

° еремешивания ведут через 15-20 мин в течение Зб мин. 3а зто время интенсивностч окраски меняется от слабо-розового до ма- — з линового и очень трудно по цвету отдифференцировать слабоп ложительные реакции (розовый цвет) ог отрицательных (бледнорозовый).

Кроме того, при постановке реакции

Фогес-Проскауэра и пользуют реактивы: концентрированную щелочь (40 KOH) vo(нафтол. которые аыз» вают ожоги. раздра1740414 жают кожу, слизистые оболочки глаз, дыхательных путей.

Целью изобретения является повышение чувствительности среды для реакции

Фогес-Проскауэра и упрощение проведение реакции, Указанная цель достигается тем, что в среду дополнительно вводят поливиниловый спирт, s качестве индикатора рН— бромкрезоловый пурпурный, а в качестве источника азота — аминопептид при следующем соотношении компонентов, г/л:

Аминопептид 9,0-1 1,0

Глюкоза 11,0-13,0

Калий фосфорнокислый однозамещенный (КН2Р04) 9,0-11,0

Бромкрезоловый пурпурный О. 192-0. 196

Поливиниловый спирт 4,0-6,0

Дистиллированная вода Остальное

Изобретение исключает возможность неправильной оценки за счет повышения чувствительности среды путем введения в качестве индикатора рН бромкрезолового пурпурного, а в качестве источника азота— аминопептид.

При этом положительная реакция приобретает фиолетовый цвет, а отрицательная — желтый.

Кроме того, среда дает возможность учета реакции одномоментно по всем 12 параметрам анализа в то время, как прототип требует дополнительного внесения двух реактивов и времени 30 мин для образования цветности реакции.

Среду готовят следующим образом, Взвешивают все компоненты среды, затем приготавливают рабочий раствор, Для этого все ингредиенты при перемешивании доводят до кипения, После этого устанавливают рН раствора 6,95-7,05 с помощью 10%— ного раствора едкого натра под контролем иономера универсального 3В-74. Среду разливают в пробирки по 5 мл и автоклавируют и ри 110 С в течение 30 мин.

Среду используют следующим образом.

В и розрач н ые 96-луночн ые полистироловые планшеты наряду с другими субстратно-индикаторными средами в один из вертикальных рядов вносят по 0,05 мл полученной среды с помощью дозатора пипеточного. Затем планшет со средами для подсушивания помещают втермостатирующее устройство при 39-40 С на 3-4 ч. Одновременно и роиз водят облучение ул ьтрафиолетовы ми лампами с целью стерилизации, После сушки планшеты герметизируют в полиэтиленовые пакеты иони готовы к применению. Получен10 ные планшеты в дальнейшем именуют системами мультимикротестов (MMT-E-2).

Пример 1, Готовят среду следующего состава, г/л:

5 Аминопептид 9,0

Глюкоза 11,0

Калий фосфорнокислый однозамещенный (KH2P04) 9,0

Бромкрезоловый пурпурный 0,192

Поливиниловый спирт 4,0

Дистиллированная вода Остальное

Испытание работы среды в реакции Фогес-Проскауэра проводят с помощью следу15 ющих штаммов: Klebsiella pneumonia К-9 и

Entегоbacter cloacae А-186. Для исключения ложноположительных результатов в контроле используют штаммы Escherichia coli 846 и Proteus vulgaris Нх 19, Цвет среды в лун20 ках с положительно реагирующими штаммами остается фиолетовым, а отрицательно реагирующие штаммы изменяю1 цвет среды на желтый.

Пример 2. Состав среды, г/л;

25 Аминопептид 10,0

Глюкоза 12.0

КН2Р04 10,0

Бромкрезоловый пурпурный 0,192

Поливиниловый спирт 4,0

30 Дистиллированная вода Остальное

Результаты испытания с примером 1 одинаковы.

Пример 3. C.ocòàâ среды, г/л:

Аминопептид 11,0

35 Глюкоза 13,0

KH2PO4 11,0

Бромкрезоловый пурпурный 0,194

Поливиниловый спирт 5,0

Дистиллированная вода Остальное

40 Результаты испblтаний одинаковы с примерами 1 и 2, Пример 4, Состав среды, г/л:

Аминопептид 8,0

Глюкоза 10,0

45 КН2РО4 8,0

Бромкрезоловый пурпурный 0.190

Поливиниловый спирт 6,0

Дистиллированная вода Остальное

Результаты испытаний показывают

50 (табл.1), что при посеве 100 млн.мик.клеток/мл штамм Proteus vulgaris 19 дал.ло>кноположительный результат. Увеличение посевной дозы до 500 млн.мик,клеток/мл позволило избежать ложных реакций.

55 Пример 5. Состав, среды, г/л:

Аминопептид 12,0

Глюкоза 14,0

КН2РОа 12,0

Броглкрезоловый пурпурный 0.196

Поливиниловый спирт 7.0

1740414

9,0-11.0

1 1,0-13,0

9,0-1 1,0

0,192 — 0,196

4.0-6,0

Остальное

55

Дистиллированная вода Остальное

Результаты испытаний неодинаковы с примерами 1-3, Штамм Entегоbacter cloacae

А-186 при посеве 100 млн.мик,клеток/мл дал ложноотрицательный результат(табл.1). 5

Пример 6. Способ использования системы микротестов.

Для постановки реакции Фогес-Проскауэра предварительно готовят суспензии испытуемых микроорганизмов в 10 дистиллированной воде (1-2 колонии на 2 мл воды) и в лунки каждого горизонтального ряда полистиролового планшета вносят одну из приготовленных суспензий по 0,1 мл в каждую лунку. Затем осуществляют инкуба- 15 цию посевов при 37. 1 С, Учет результатов производят через 18-24 ч. При этом полученный фиолетовый цвет среды в лунке расценивают как положительный, желтый — как отрицательный, 20

Данные по чувствительности среды и точности дифференцирования в реакции

Фогес-П роскауэра и ри веден ы в табл,1.

Из табл.1 видно, что чувствительность предлагаемой среды в 4 раза выше. чем у 25 прототипа (примеры 1-3), Уменьшение количества глюкозы и аминопептида (пример 4) в составе среды нецелесообразно, так как ведет к искажению результатов (ложноположительные реак- 5 ции, Увеличение количества глюкозы и аминопептида (пример 5) ведет к ложноотрицательным результатам.

Таким образом, оптимальный вариант 10 рабочей среды находится в пределах, г/л:

Аминопептид 9,0-1 1,0

Глюкоза 11,0-13,0

Калий фосфорнокислый однозамещенный

Бромкрезоловый пурпурный 0,192-0,196 . Поливиниловый спирт 4,0-6,0

Дистиллированная вода Остальное

В подтверждение точности дифферен- 45 циации предлагаемой среды были исследованы 50 выделенных штаммов энтеробактерий, Результаты исследований сведены в табл.2.

Данные табл,2 свидетельствуют, что точность дифференциации энтеробактерий по реакции Фогес-Проскауэра на предлагаемой среде составляет 96;4, тогда как на среде по прототипу 76, Предлагаемая среда по сравнению с известной обеспечивает следующие преимущества: повышает чувствительность реакции Фогес-Проскауэра в 4 раза, а точность дифференциации энтеробактерий— на 22/, упрощает проведение реакции (исключает добавление реактивов для выявления реакции), облегчает учет результатов вследствие большой контрастности цветов (фиол ето вы и — желтый}.

Кроме того. среда удобна в употреблении, что дает возможность использовать во всех бактериологических лабораториях здравоохранения, ветеринарии и других отраслях народного хозяйства.

Формула изобретения

Питательная среда для реакции ФогесПроскауэра, содержащая источник азота, глюкозу, калий фосфорнокислый однозамещенный, индикатор и дистиллированную воду, о т л и ч а ю,ц а я с я тем, что, с целью повышения чувствительности среды и упрощения проведения реакции, она дополнительно содержит поливиниловый спирт, B качестве индикатора — бромкрезоловый пурпурный, а в качестве источника азота— аминопептид при следующем соотношении компонентов, г/л:

Аминопептид

Глюкоза

Калий фосфорно-кислый однозамещенный

Бромкрезоловый пурпурный

Поливиниловый спирт

Дистиллированная вода

1740414

cd с

Э

С1 о

К

tU

Э

Щ

Г0 с с

Э

CL

1::

1 1 + + I 1 I I 1

+ + 1 1 + + 1 1!

l

l

l !

CD

С)

С

Ю

1

cg l

Z !

LA

1 Г

CL

L, X

<

С:)

CD

М1

С

IО

IО

CL

С:

1 — — «1

С

CD

С3

С

Ш

Ch O с CCc CO х

Ж «4

Э О cd

° rl «t Л Э

CO

cd О О

cG л 1= cd

4 л 0

О Э

) О Й О а

Рч Ы М Ы

Ch !

CO P а чр

° л

S W CO (!! д

v ceo л

О л л!

О

О W О

Э 1*

° л

И

О Э

Я cd

О

Э лч а О

Э и

° л

Э

О

El o

«! (Ь

Э О л !

0 О

Рч

Э

° л Э

cd

О О

Я

О

Q1 rl

Рч 4 (6 М:> cd

° л л

Н 00

cd О

00 л 5

О Q)

О а

Ф М

N Ю

° л б

Э

led Л ч

0 ,> О л! б

Н 00

cd

00 ° л л л

О

) u

О

Ct.

Ф

С4

«4 fcl

Рл Ы

С4 й

CL

X

1

Sl

1 1

1 !

О l

1 !

l

I — l

1

1 !

1

l

l

1

1

1

1

1

1 !

1

l

1

l !

l

l

l

1

1

1

1

Ц

Х

О

1Э

Ц

X

Z

L0

О

CL

Б

lX:

CQ

Г

IZ

Э

:Г

О л

X

Щ

I2

Э

1, !

l

l

l .l

l

l

l

1

l

1 !

l ! !

l

1

l !

l

l

l

1 !

I 1 + + I I + + 1 1 + + 1 1 I I !

+ + 1 1 + + I 1 + + 1 1 + + I 1 1 I I 1

+ + I ) 1 + 1. I + + I 1 + + + + I + I 1

I l + + I I + + I I + + I I + + I 1

+ + 1 1 + + 1 1 + + I I + + 1 + + I 1

I 1 I I 1 1 I 1 1 1 I I I 1 I I 1 1 I

1 1 I I I 1 1 I I I I I I I 1 I 1 I 1

1740414 та о ли ц а 2

Результаты реакции Фогес-Проскауэра

Выделенные штаммы

Прототип (Предлагаемая среда

Данные по

Берджи

KlebsielLa pneumonia

ВоЕлЕа aivei

If

ll

f!

II

Entегоbacter cloacae

11

II

11

Entегоbacter aегоgenes

Proteus vulgaris

II

If

II

11

Гroteus mirabilis

ll

11

I!

Salmonella

11

ll

If

Ба1!папе1 и

ShiEella!

1

11

II

Citrobacter freffndi

11

Citzobacter diversus

II

E.coli

II

ll

II

If

ll

Il Р - различные реакции у разных штаммов вида Enlегоbacteriaclac.

Составитель Л.Чичкина

Редактор ТЛазоренко . Текред М.Моргентал Корректор О, Ципле

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород,,л.Гагарина, 101

Заказ 2050 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5