Способ получения биомассы micrococcus luтеns вкпм в-2836 продуцента рестриктазы mlu 1
Использование: биотехнология. Сущность изобретения; проводят предварительное пассирование посевного материала на агаризованной среде, содержащей ДНК из тимуса теленка в концентрации 0,1 мг/мл, и селективный отбор наиболее продуктивных клонов бактерий путем анализа их на содержание целевого фермента. Способ озволяет в 12-15 раз повысить содержание целевого фермента в биомассе. 1 табл. If, С
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 9/14, 1/20
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4732948/13 (22) 28.08.89 (46) 07.06.92. Бюл. М 21 (71) Научно-исследовательский конструкторско-.технологический институт биологически активных веществ (72) Л, Л. Корсун и Л, Р. Лебедев (53) 577.15(088,8) (56) Баткис Э. В., Кадулене Э. Ю., Янулайтис
А. А, Влияние гидролизатов дрожжей на биосинтез бактериальных рестриктаз. — До. стижения микробиологической практики.—
Тезисы докл. 7-ro Съезда Всесоюзню микро.биологич. общества, Алма-Ата, 1985, т. 4, 12.
Sugisakl Н., Kanasawa S. New restriction
endonucleases from FIavobacterlum
o! Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению биомассы для производства эндонуклеазы рестрикции. При получении рестриктаз важным этапом являются стадии оптимизации селекции и- культивирования штаммов-продуцентов с целью достижения более высокого выхода изучаемых ферментов. Выход .рестриктаз и неспецифическое нуклеаэное загрязнение в значительной мере обусловлены составом питательной среды и . условиями выращивания штамма-продуцента. Эти данные свидетельствуют об отсутствии обобщенной теории биосинтеза ре: стриктаз, что обуславливает эмпиричность в подборе условий культивирования штаммов-лродуцентов. Наиболее близким к предлагаемому является способ получения биомассы. Ж 1738853 А1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ MICR0C0CCUS LUTEUS ВКПМ В-2836— ПРОДУЦЕНТА РЕСТРИКТАЗЫ MLU (57) Использование: биотехнология. Сущность изобретения; проводят предварительное пассирование посевного материала на: агаризованной среде, содержащей ДНК из тимуса теленка в концентрации 0,1 мг/мл, и селективный отбор наиболее продуктивных клонов бактерий путем анализа их на содержание целевого фермента. Способ позволяет в 12 — 15 раз повысить содержание целевого фермента в биомассе. 1 табл., Micrococcus luteus, вклнцнающий выращивание культуры при 37 с цнтенсивной аэрацией в среде, содержащей, г/л воды: бактопептон 10; дрожжевой экстракт 5; NaCI 5; глюкоза 1, до оптической плотности Apso= 1. Выход биомассы .с 1 л среды.4 г.. (А„ Выход фермента из 1 r клеток после двух. (g хроматографических стадий (фосфоцеллюлоза P — 11 и ДЕАЕ-целлюлоза ДЕ-52) 800 ед, у акт. Недостатком известного способа явля-. ется низкое содержание рестриктазы Mlu I в биомассе. Цель изобретения.— повышение содер- 4 жания рестриктаэы МЬ I. Поставленная цель достигается тем, что способ получения биомассы Mlcrococcus Iuteus ВКПМ В-2836- продуцента рестриктазы Mlu (предусматривает приготовление посевной культуры на агаризованной среде, содержащей в качестве добавки ДНК из ти- 1738853 муса теленка в концентрации 0,1 мг/мл, последующий селективный отбор клонов с наибольшим содержанием рестриктазы Mlu I и минимальным загрязнением неспецифическими нуклеазами, засев отобранным клоном жидкой питательной среды и выращивание в оптимальных условиях. При реализации этого способа достигается уровень содержания фермента Mlu 1 в грубом экстракте клеток 12000-15000 ед. акт./г влажных клеток. После проведения двух стадий очистки (фосфоцеллюлоза Р-11 и ДЕАЕ-целлюлоза ДŠ— 52) из 1 r клеток получают 10000 — 12000 ед. акт. очищенного фермента Mlu I, В качестве контроля проводят пассирование и селекцию посевного материала на средах без ДНК и с добавлением ДНК в различных концентрациях. Результаты опытов представлены в таблице. Проведены следующие исследования: анализ клонов на содержание рестриктазы Mtu l ïðè пассиравании на средесДНК (первая дорожка — 5 мин инкубации, вторая — 30 мин инкубации одинакового количества клеточного лизата с 0,5 мкг ДНК фага лямбда); анализ клонов на содер>кание рестриктазы Mlu I при пассировании на среде без ДНК (контроль, первая дорожка — 5 мин инкубации, вторая — 60 мин инкубации одинакового количества клеточного лизата с 0,5 мкг ДНК фага ламбда); анализ биомасс М. Iuteus на содержание рестриктазы Mlu 1, полученных с пассираванием на среде без ДНК, с пассированием на среде с ДНК. В пробы добавляли соответственно клеточного лизата 0,5(а); 1,0(б); 2,0(в); 3,0(г); 5,0(д); 10,0(е); 0,025(ж); 0,05(з); 0,1(и); 0,15(к); 0,25(л) и 0,75(м) мкл, инкубировали с 0,5 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при 37 С. Из полученных данных установлена, что картина полного специфического гидролиза ДНК рестриктазой наблюдается в первой биомассе на дорожке в, что соответствует содержанию фермента 1000 ед. экт./г клеток, во второй — на дорожке к, что соответствует содержания фермента 13500 ед, акт./r клеток (т. е. выше, чем в первой в 2,0/0,15=13,4 раза); Причем ва втором случае при пятикратном избытке (дорожка м) сохраняется картина рестрикции, тогда как в первом при том же избытке (дорожка е) наблюдается размывание фрагментов ДНК, Il р и и е р 1. Пассировэние и селекция посевного материала. Штамм M. 1меоз(коллекционный номер в ВКПМ В-2836) рассевают на агаризованФормула изобретения Способ получения биомассы 45 Mlcrococcus luteus ВКПМ В-2836 — проду50 40 ную среду (рыбный питательный агар), содержащую ДНК тимуса теленка в концентрации 0,1 мг/мл. Выращивают в течение 18 ч при 37 С. Затем из нескольких отдельных колоний (из 8-12) отбирают петлей половину материала и переносят в отдельные пробирки, содержащие по 200 мкл буфера для разрушения следующего состава: 100 мМ трис-НС1/ рН 8,0; 50 мМ NaCI; 0,1%-ный Тритон Х вЂ” 100; 0,01 -ный лизоцим, Полученные лизаты (после инкубации при 4 С в течение 30 мин) используют для определения количества рестриктазы и неспецифического нуклеазного загрязнения (по реакции расщепления ДНК фага лямбда}, Для этого по 5 мкл лизатэ каждого клона инкубируют с 0,5 мкг ДНК в инкубационной смеси в течение 5 и 30 (60) мин. Затем продукты расщепления разделяют электрофорезом B геле агарозы, Колонии, содержащие максимальный уровень рестриктазы при минимальном загрязнении неспецифическими нуклеазами, используют для культивирования (контральный опыт со средой без ДНК при необходимости выполняют идентично). Пример 2. Получение биомассы. Отобранный клон клеток засевают в 50 мл питательной среды для получения инокулята. После инкубации на качалке при 200— 220 об/мин в течение 18 ч при 37 С полученным инокулятом засевают объем среды (качалочные колбы с 250 мл среды}, предназначенный для культивирования, из расчета 1 мл инакулята на 100 мл среды. Инкубируют в тех же условиях в течение 18 ч, Затем после охлаждения клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин. Выход биомассы: 4,1-4,3 г с 1 л среды. Содержание фермента 12000 — 15000 ед. акт./r влажных клеток, цента рестриктазы Mlu 1, предусматривающий приготовление посевной культуры на твердой питательной среде, содержащей добавку, засев ею жидкой питательной среды, выращивание в оптимальных условиях, отделение клеток, отличающийся тем, что, с целью повышения содержания рестриктазы, посевную культуру готовят на агаризованной среде, содержащей в качестве добавки.ДНК изтимуса теленка в концентрации 0,1 мг/мл среды, и перед засевом проводят селективный отбор клонов с наибольшим содержанием рестриктазы Mlu 1 и минимальным загрязнением неспецифическими нуклеазами; 1738853 Выход биомассы, г/л среды Примечание Содержание фермента МЬ I, е .акт./г кл. Условия выращивания биомассы После двух стадий очистки В грубом экстрате 4,0 800 800-1000 3,8 1000-1200 1000-2000 12000-15000 10000-12000 4,1 4.3 4,0 10000-12000 После двух последовательных пассажей на с е ес НК,0,1 мг/мл 4,1 10000-12000 Редактор В, Петраш Заказ 1978 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина. 101 По известному способу После пассирования: на среде без ДНК на среде с ДНК: 0,05 мг/мл 0,1 мг/мл 0,2 мг/мл Повышается содержание неспецифических нуклеаз Составитель Л. Юшкова Техред М,Моргентал Корректор О. Кравцова
