Способ определения функциональной активности альвеолярных макрофагов у больных туберкулезом

 

Изобретение относится к медицине1, а именно к физиопульмонологии, и может быть использовано в легочно-терапевтических стационарах практических противотуберкулезных учреждениях для определения функциональной активности альвеолярных макрофагов у больных туберкулезом. Цель изобретения - упрощение способа. Берут кровь у здоровых и больных туберкулезом легких, выделяют мононуклеары и полинуклеары и по увеличению коэффициента стимуляции убитой культурой БЦЖ в тесте восстановления нитросинего тетразолия определяют высокую, а при снижении по сравнению со здоровыми низкую функциональную активность альвеолярных макрофагов . Предлагаемый способ имеет равную точность в сравнении с прототипом и позволяет исключить бронхоскопию с забором бронхоальвеолярного смыва. сл с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (s»s G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К .АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4804298/14 (22) 27.02.90 (46) 15.06.92. Бюл. ¹ 22 (71) Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза (72) Г.О. Каминская. Т.О. Омаров, О.В. Ловачева, В.И. Чуканов, Л.Н. Ефимова и Г,Ю.

Блонская (53) 615.374 (088,8) . I (56) Грачева М.П. Определение бактерицидной силы альвеолярных макрофагов с помощью MCT-теста, — Микробиол. зпидемио иммунол. 1984, ¹ 1, с. 87 — 88, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ АЛЬВЕОЛЯР. НЫХ МАКРОФАГОВ У БОЛЬНЫХ

ТУБЕРКУЛЕЗОМ (57) Изобретение относится к медицине. а именно к физиопульмонологии, и может

Изобретение относится к медицине, а именно к физиопульмонологии, и может быть использовано в легочно-терапевтических стационарах и поликлиниках практических противотуберкулезных учреждений для определения функциональной активности альвеолярных макрофагов. о

Цель изобретения — упрощение способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Мононуклеары и полинуклеары выделяют из 2 мл цельной крови, стабилизированной гепарином (50 ед/мл) и разведенной питательной средой ¹ 199 в отношении 1;1.

Полученные 4 мл наносят нп двойной градиент плотности растворов фикола с верографином: нижний слой (3 мл) с плотноЯ „„1741077 А1 быть использовано в легочно-терапевтических стационарах практических противотуберкулезных учреждениях для определения . функциональной активности альвеолярных макрофэгов у больных туберкулезом. Цель изобретения — упрощение способа. Берут кровь у здоровых и больных туберкулезом легких, выделяют мононуклеары и полинуклеары и по увеличению коэффициента стимуляции убитой культурой БЦЖ в тесте восстановления нитросинего тетразолия определяют высокую, а при снижении по сравнению со здоровыми низкую функциональную активность альвеолярных макрофагов, Предлагаемый способ имеет равную точность в сравнении с прототипом и позволяет исключить бронхоскопию с забором бронхоальвеолярного смыва. стью 1,119 г/см и верхний (3 мл) — 1,077 г/см и центрифугируют 45 мин при 30 при 4

3 комнатной температуре. После центрифуги- Ь рования на границах раздела растворов появляются два кольца: нижнее составляет О полиморфноядерные лейкоциты (99-100 ), верхние — мононуклеары, среди которых содержание моноцитов достигает 15 20, а число полинуклеаров не превышает 2 .

Каждый слое клеток отсасывают пастеровской пипеткой и 1 раз отмывают физиологическим раствором в соотношении 1:10.

К полученному клеточному осадку добавляют 1 мл от раствора и тщательно суспендируют.

Для оценки жизнеспособности клеток к

0,05 мл клеточной суспензии добавляют

0,05 мл 1%-ного раствора трипанового си1741077 него и инкубируют при комнатной температура не больше ", мин. Для подсчета клеток к 0,05 мл суспензии приливают 0,05 мл

0,1%-ного раствора метиленового синего и инкубируют 15 — 20 мин, Оценку жизнеспособности и подсчет количества клеток проводят в камере Горяева.

Постановку теста восстановления нитросинего тетразолия (HCT-теста) осуществляли в 2 этапа — для нативных клеток (спонтанный НСТ-тест)) и после стимуляции убитой культурой вакцины Кальметта и Герена (БЦЖ) .(стимулированный тест). Все этапы, начиная.с забора крови, проводят в силиконированной посуде.

Для каждого вида клеток в 2 параллельные пробирки помещают объем взвеси, содержащей около 0.5 10 клеток. Одна

6 пробирка служит для постановки спонтанного, другая — для стимулированного теста.

В и робу со стимулированным тестом добавляют взвесь 3-недельной убитой культуры

БЦЖ в питательной среде М 199, содержащей 108 микробных тел в 1 мл, Объем добавляемой взвеси определяется отношением 1 клетка: 10 микробных тел, Пробирку помещают в термостат при 37 С на 20 ч.

Пробирку для спонтанного НСТ-теста центрифугируют в течение 5 мин при 140 д, надосадочную жидкость сливают. а к осадку клеток добавляют 0.2 мл приготовленного одновременно 0,2 g-ного раствора нитросинего тетразолия в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,4. Пробу помещают в термостат при 37 С íà 1 ч, после чего центрифугируют

5 мин при 330, супернатант сливают, к осадку клеток добавляют 0,2 мл диметилсульфоксида. После растворения осадка доводят объем до 3 мл фосфатным буфером

0,05 М рН 7,4, Полученную смесь вновь центрифугируют 10 мин при 330 и в надосадочной жидкости определяют оптическую плотность на СФ-26 при длине волны 492 нм против контроля на реактивы (2,8 мл фосфатного буфера и 0,2 мл диметилсульфоксида). Результаты выражают в единицах оптической плотности, умноженных на

1000, в пересчете на 10б клеток.

Индукцированный тест после 20-часовой инкубации проводят аналогичным образом.

Помимо цифровых значений спонтанного и стимулированного НСТ-теста рассчигывали коэффициент стимуляции (КС) как отношение второго показателя к первому, У здоровых спонтанный НСТ-тест с мононуклеарами составлял 33,0 4 4,9, стимулированный 200,1 ": 25.3, КС 6,9 . 1,1, с полинуклеарами 56,6 +. 4,0, 132,6 + 11,8 и

2,4 0,3 соответственно.

П ри м е р 1, Больной X.,32 лет,диагноз: очаговый туберкулез верхней доли правого легкого в фазе инфильтрации, Туберкулез выявлен впервые. Бронхологическое исследование с одновременным исследованием периферической крови произведено на 10-й день со времени поступления в клинику. У данного больного показатель спонтанного

HCT- еста альвеолярных макрофагов (AM) составил 44,7, мононуклеаров 56,2, нейтрофилов 35,7, величина стимулированного

НСТ-теста была равной 210, 498,7 и. 185,7, соответственно, При этом коэффициент стимуляции АМ оказался равным 4,6, мононуклеаров 8,8 и нейтрофилов 5,2, Приведенный пример свидетельствует о том, что при ограниченных формах туберкулеза легких с относительно благоприятным его течением показатели функционального состояния АМ; мононуклеаров и нейтрофилов изменяются однонаправленно и характеризуются незначительным повышением спонтанного НСТ-теста при высоких значениях коэффициента стимуляции, Таким образом, у данного больного повышенные значения КС мононуклеаров и нейтрофилов периферической крови по

5

30 сравнению со здоровыми указывали на высокую функциональную активность АМ, подтвержденную проведением у данного больного бронхоскопии и определением

HCT-теста с AM бронхоальвеолярного смыва.

Пример 2. Больная 35 лет, диагноз: инфильтративный туберкулез верхней доли правого легкого в фазе распада (деструктивный туберкулез) МТ+ туберкулез легких выявлен впервые. Бронхологическое исследование с одновременным исследованием крови произведены на 15-й день госпитализации. У больной показатель спонтанного НС1-теста AM составил 92,1, мононуклеаров 48,6 и нейтрофилов 86,4, величины стимулированного ИСТ-теста были равны 285,5; 208,9 и 181,4 соответственно.

При этом коэффициент стимуляции был снижен и оказался равным для АМ 3,1, мононуклеаров 4,3 и нейтрофилов 2,1.

Данный пример свидетельствует о том; что при деструктивных формах туберкулеза легких с относительно неблагоприятным ceo течением: показатели функционального состояния АМ, мононуклеаров и нейтрофилов также носили однонаправленный характер и отличались высоким уровнем спонтанного

НСТ-теста при ограничении резервов сти1741077

8 качестве прототипа выбран способ непосредственного определения спонтанного и стимулированного НСТ-теста в альвеолярных макрофагах, полученных из бронхоальвеолярного смыва.

flo сравнению с прототипом предлагаемый способ проще,-т.е.. позволяет отказаться от проведения бронхоскопии и бронхоальвеолярного лаважа.

Точность обоих способов была одинако- вой (см, таблицу).

Составитель ВЛитовченко

Техред М.Моргентал Корректор А.Ротман

Редактор М.Циткина

Заказ 2083 Тираж. Подписное .

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям. при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 муляции. У данной больной низкие значения коэффициента стимуляции мононуклеаров и нейтрофилов периферической крови сами по себе указывали на низкую функциональную активность АМ, подверженных проведением у больной бронхоскопии определением НСТ-теста с АМ бронхоальвео лярного смыва.

Формула изобретения

Способ определения функциональной активности альвеолярных макрофагов у больных туберкулезом легких, включающий

5 инкубацию клеток в присутствии туберкулезного микроба штамм БЦЖ с последующей инкубацией с нитросиним тетразолием и вычислением коэффициента стимуляции его восстановления, отличающийся

10 тем, что, с целью упрощения способа. в. качестве клеток используют мононуклеары и полинуклеары, выделенные из крови больных, и при увеличении коэффициента стимуляции восстановления тетразолия

15 нитросинего у больных по сравнению со здоровыми определяют высокую функциональную активность альвеомерных макрофагов, при коэффициенте стимуляции у больных меньшем, чем у здоровых, определяют низ20 кую функциональную активность альвеомер. ных макрофагов у больных туберкулезом.