Штамм бактерий bacillus suвfilis, осуществляющий деградацию 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения штамма бактерий, осуществляющего микробиологическое разрушение 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) и ее аминной соли, используемых в качестве гербицидов для борьбы с сорняками на посевах хлебных злаков. Штамм может быть использован для очистки сточных вод.от 2,4-Д. Целью изобретения является получение штамма бактерий Bacillus subtilis AKM В-1742Д (шт. 16); способного осуществлять эффективную биологическую деградацию гербицида 2,4-Д. Штамм способен почти Ясут культивирования на сточных водах производства гербицида разгружать до 90% хлорфенолов в среде при их исходной концентрации 30 мг/л; при этом продукты метаболизма, накапливаемые в среде, нетоксичны для проростков растений . 3 табл. СО с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК, (я)з С 02 F 3./34, С 12 N 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4769197/13 (22) 22,05.89 (46) 23.06.92. Бюл. М 23 (71) Институт биологии Башкирского научного центра Уральского отделения AH СССР (72) Т.В.Маркушева, В.С.Никитина, И.Н.Скворцова, Р. Н. Чураев, И, В. Кусова, Е. Ю. Журенко, Г. Г, Ягафарова, Р, Н. Хлесткин, А, P. Мавзютов и 3. Г. Габидуллин (531 663.15(088;8) (56) Tied)e J.Ì., Ouxbury J. М., Alexander М., Dawson J. Е. — J. Agr, Food Chem., 1969, ч.

17, N .5, р. 1021-1026.

Скрябин Г, К., Головлева Л. А, Использование микроорганизмов в органическом синтезе. — М.: Наука, 1976; с. 299-.315. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS

SUBTILlS, ОСУЩЕСТ8ЛЯЮЩИЙ ДЕГРАД А Ц И Ю 2, 4 -Д И.ХЛ О Р Ф Е Н О К С И У К СУ С.НОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения штамма бактерий, осуществляющего микробиологическое разрушение 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) и ее амин ной соли (2,4-Д/А), используемых в качестве гербицидов для борьбы с сорняками на посевах хлебных злаков, и может быть использован для очистки сточных вод от 2;4-Д.

Известен штамм бактерий Arthrobacter

sp;, участвующий в биологической деградации 2,4-D. Известен штамм гриба

AspergIllus niger, способный использовать

2,4-Д в качестве единственного источника углерода и энергии.

Недостатком известных штаммов является то, что для них не установлена эффективность деградации 2,4-Д, достигаемая в. Ж 1742226 А1 (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается получения штамма бактерий, осуществляющего микробиологическое разрушение 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2.4-Д) и ее аминной соли, используемых в качестве гербицидов для борьбы с сорняками на посевах хлебных злаков. Штамм может быть использован для очистки сточных вод.от 2,4-Д. Целью изобретения является получение штамма бактерий Bacittus

subtilis AKM B-1742Д (шт. 16); способного осуществлять эффективную биологическую деградацию гербицида 2,4-Д. Штамм способен почти 2,сут культивирования на сточных водах производства гербицида разгружать до 90 хлорфенолов в среде при их исходной концентрации 30 мг/л; при этом продукты метаболизма, накапливаемые в среде, нетоксичны для проростков растений, 3 табл. результате ее метаболизма в условиях культивирования штаммов в жидких средах.

Оцениваемый эффект касается скорости минерализации 2.4-Д и токсичности продуктов деградации.

Цель изобретения — получение штамма бактерий Bacillus subtilis ВКМ 8-1742Д (штамм 16), способного осуществлять эффективную биологическую деградацию гер-. бицида 2,4-Д.

Штамм выделен из активного ила БОС (биологических очистных сооружений) производства хлорфенолов .метрдом накопительных культур.

Штамм хранят в лиофилизированном состоянии. Проверка жизнеспособности штамма проводится высевом на мясо-пептонный агар один раэ в 12 мес.

1742226

10

25

Штамм имеет следующую характеристику..

Культурально-морфологические признаки. Клетки представляют собой грамположительные подвижные палочки диаметром 1 мкм. одиночные и в парах.

Споры овальные, расположенные в центре клетки. При росте на мясо-пептонном бульоне образует развитую матовую пленку, среда при этом остается прозрачной, При встряхивании биомассы в жидкой среде ее полного диспергирования не происходит.

На среде Эшби образует клейстеровидные, конусообразные гладкие колонки с ризоидным краем. На ломтиках картофеля рост обилен в виде колоний кремового цвета, гладких, сильно крупноскладчатых.

Физиолого-биохимические признаки.

Сбраживает сахарозу, арабинозу, маннозу, маннит, сорбит, использует цитрат и малонат натрия, лизин. Не использует лактозу, рамнозу, галактоэу, фенилаланин, не активен в отношении мочевины, орнитина, эргинина, Активно гидролизует желатину, причем происходит разжижение всего столбика. Активно гидролизует казеин и крахмал. Молоко свертывает и пептонизирует без изменения реакции среды. . Проявляет - нитратредуктазную активность, Реакция Фогес-Проскауэрэ положительная. Клетки каталазоположительны. Не продуцирует свероводород и индол, Лецитиназная реакция отрицательна, Не требует присутствия в среде факторов роста: растет на среде с эммонийным и нитратным азотом и сахарозой, а также на среде без специального внесения источника азота. Растет в присутствии 7% NaC1 в мясо-.пептонном агаре.

Чувствителен к пенициллину, феноксиметилпенициллину, канамицину, ампициллину, карбенициллину, эритромицину, олеандомицину, линкомицину, ристомицину, тетрациклину, стрептомицину. мономицину, гентамицину, незамицину, рифампицину, физидиевой кислоте. Высокочувстиителен к хлорамфениколу. Устойчив к полимиксину.

Для штамма характерен аэробный рост за исключением роста в среде с нитратами (жидкая среда Гильтая). Температурный диапазон роста от 20 д 60 С при 10 С рост практически отсутствует, при 55 С рост умеренный; оптимальная температура роста

30-37 С. Рост возможен в области рН от 4 до 9, оптимальный диапазон 7-8. Штамм не патогенен для человека и животных.

Данные по росту штамма в условиях периодической культуры в среде с разными концентрациями 2,4-Д/А приведены в таблице 1.

Для определения числа клеток пробы, отобранные после 3, 7, 14, 21 и 30 сут культивирования в жидкой среде с добавлением

2,4-Д/А в качестве единственного источника углерода и энергии, разводят в зависимости от плотности клеточной суспензии и аликвоты этих разведенных проб высевают на агаризированную мясо-пептонную среду, разлитую в чашки Петри, Чашки Петри инкубируют в течение 16 — 18 ч при 30"С и затем подсчитывают количество выросших колоний. Подсчет количества клеток в 1 мл исследуемой суспензии проводят по формуле а.10" / где М вЂ” количество клеток в 1 мл; а — среднее число колоний при высеве данного разведения;

10 — коэффициент разведения; и — порядковый номер разведения, из которого сделан высев;

V — обьем высеваемой суспензии, взятый для посева, мл.

Штамм сохраняет жизнеспособность в диапазоне концентраций 2,4-Д/А до 10 г/л.

На 3-суточных проростках кукурузы проводили тестирование продуктов метаболизма 2,4-Д, накапливаемых в культуральной жидкости штамма.

Для этого делают отборы культуральной жидкости через определенные промежутки времени культивирования штамма В.

subtilis В-1742Д в следующих условиях, Посевной материал получают выращиванием штамма в пробирках в мясо-пептонном бульоне при 30 С. Полученный посевной материал засевают в количестве 0,01% от объема в жидкую среду следующего состава:

NH4Cl 1 г; К2НР04 5 г; MgClg 4Н20 0,3 мг, МдЯ047Н2050.мг: FeS04 7Н20 5 мг; CuS04

5Н20 1 мг; ZnS04 0,8 мг на 1 л; рН 6,8-7.0, В среду вносят 100 мг 2,4-Д, Культивирование проводят при 30 С.

Культуральную среду освобождают от клеток штамма центрифугированием аликвот среды при 5 тыс.об. в мин в течение

15 мин. После этого среда готова для тестирования. Проростки кукурузы линии ВИР-38 проращивают в течение 3 сут при 25-26 С.

Отбирают проростки, имеющие одинаковую длину центрального корешка. Длина корешка должна составлять 3,0+0,2 см, Проростки помещают в чашки Петри по 10 шт. в каждую, Предварительно на дно чашки Петри помещают фильтровальную бумагу и наливают в каждую чашку по 10 мл подготовлен1742226

1.0

25

35

45

55 ной для тестирования культуральной среды, разбавленной в 10 раз. Чашки с проростками инкубируют при 25-26 С в.течение 3 сут и после этого замеряют длину центрального корешка каждого проросткэ и определяют среднее значение для каждого варианта опыта. Контролем является среднее значение длины центрального корешка. кукурузы, инкубированной с водой.

Определяют среднее значение увеличения длины центрального корешка проростков кукурузы для каждого опыта и подсчитывают процентное отношение увеличения средней длины центрального корешка проростков в опытах с метаболитами к увеличению средней длины в контроле.

Эта величина обозначается как

Х вЂ” — 100%, » Io где Iï — средняя длина центрального корешка проростка кукурузы для каждого опыта с мета болитами: !

» — средняя длина центрального корешка проростка кукурузы в контроле;

I — средняя длина центрального корешка проростка кукурузы в начале опыта.

В табл, 2 приведены результаты опытов по оценке токсического эффекта íà проростки кукурузы метаболитов 2.4-Д, накапливаемых в процесе культивирования штамма. Средняя длина центрального ко-, решка проростка кукурузы после инкубации на воде без добавления культуральной жид-. кости принята за 100% и служит контролем.

Условия тестирования (разведение проб культуральной жидкости: фаза развития проростков) подобраны так, чтобы для проб культуральной среды, отобранных до начала культивирования штамма. рост корешков составлял 50% от контроля.

Из табл. 2 видно, что культуральная жидкость, отобранная после 3 сут культивирования штамма, оказывает тормозящее действие на рост корешков кукурузы и увеличение центрального корешка в данном опыте составляет 55,6% от контроля, Далее, с уменьшением количества 2,4-Д на 7-е сутки культивирования штамма тормозящее действие культуральной жидкости уменьшается и средняя длина центрального корешка составляет 71,8% от контроля, С уменьшением количества 2,4-Д на 11-е сутки культивирования эффект торможения роста корешков снижается и увеличение средней длины центрального корешка составляет 85,9% от контроля.

Таким образом, ингибирующий эффект действия 2,4-Д, оцениваемый в начале опыта в 50% снижается с уменьшением количества гербицида в процессе культивирования штамма, а накапливаемые продукты метаболизма не оказывают токсического действия на проростки кукурузы,"

Анализировали содержание 2,4-Д в культуральной жидкости в процессе роста штамма. Условия культивирования описаны, среда содержит 100 мг/л 2,4-Д. . Анализ содержания 2,4-Д проводят методом газо-жидкостной хроматографии, Для анализа отбирают по 1I3 мл. культуральной жидкости через определенные промежутки времени. Клетки удаляют из среды -центрифугированием при 5 тыс.об. в мин в течение

15 мин, жидкость подкисляют добавлением нескольких капель солянОй кислоты и проводят 3-кратную экстракцию 2,4-Д равными объемами хлороформа, После экстрэкции хлороформ удаляют отгонкой на вакуумном роторном испарителе, метилируют и фракционируют на хроматографе ЛХМ-8Д с ионизэционно-резонансным детектором.

Условия определения: стеклянные спиральные колонки 110х0,3 см с 3 оч-225 или

5% он-.1 на инертоне супер (0,16 — 0,20 мм), температура испарителя 210 С, детектора

190 С, колонки160 С, расходгелия 60мл/мин. .В результате анализов установлено, что на 7-9-е сутки культивирования штамма остаточное количество 2,4-Д составляет около

50%, на 10 — 14-е сутки культивирования— около 20%.

R р и м е р. Используют сточную воду производства гербицида 2,4-Д после обесфеноливания со стадии хлорирования фенолсодержащих вод из сборника; В такой воде, которая направляется непосредственно на БОС, содержание хлорфенолов составляет в среднем 30 мг/л..:

В одну из колб объемом 250 мм вносят

100 мл сточный воды, в другую — 100 мп сточной воды и следующие соли, г/л:

КМОз 20

КН2РО4 0,3 .

ЙагНРО4. 0,3 йаНгРО4 12НгО 0,7

Mg SO4.7НгО 0,4 р Н доводят до 7,0-7,2 добавлением 5%-ного раствора. Колбу засевают 3% по объему посевным материалом 107 кл/мл, выращивание проводят нэ качалке(220 об./мин) при 30 С

Количество хлорфенолов определяют. в процессе культивирования на спектрофтометре при длине волны 273 — 279 нм после их экстракции из проб в CCI4 (табл, 3).,Как видно из приведенных данных, штамм активен в реальных стоках производствэ гербицида. Степень биологической очистки после 2 сут культивирования со1742226 накапливаемые в среде, нетоксичны для проростков растений.

Таблица 1 ток проводили чашечным методом Коха, Таблица 2

Таблица 3

Составитель А. Минеева

Техред M,Моргентал Корректор Т. Палий

Редактор Н. Яцола

Заказ 2256 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r, Ужгород, ул.Гагарина, 101 ставляет: в сточной воде более 337ь, в сточной вода с добавлением питательных солей

90, Полученные данные свидетельствуют о том, что штамм В, subtills BKM В-1742Д способен активно метаболиэировать гербицид 2,4-Д, при этом продукты метаболизма, Формула изобретения

5 Штамм бактерий Bacillus subtilis BKM

В-1742Д, осуществляющий деградацию 2,4дихлорфеноксиуксусной кислоты.