Способ получения водорастворимых антигенов из опухолевых тканей

 

Изобретение относится к медицине точнее к клинической иммунологии. Цель изобретения - увеличение выхода активности целевого продукта и сокращение времени его получения. Для этого опухолевую ткань гомогенизируют и одновременно подкисляют , фильтруют, охлаждают, добавляют хлористый калий, хроматографируют на G-75 с элюцией целевого продукта дистиллированной водой.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si>s А 61 К 39/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР. 1 1 0 "

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ЗВ1И1ИК ;:;,,,Ч ь "» Д

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4716774/14 (22) 10.07.89 (46) 15.07.92. Бюл, N 26 (71) Научно-исследовательский институт физико-химической медицины (72) И.б. Каргина (53) 612.015(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N. 1079246 А 61 К 39/00, 1984.

Изобретение относится к медицине, точнее к клинической иммунологии, и касается оценки состояния клеточно-опосредованного иммунитета у человека, может найти применение в онкологии для диагностики активности опухолевого процесса, а также для прогнозирования и определения эффективности противоопухолевой терапии, для изучения физико-химических и биологических свойств антигенов опухолей.

Цель изобретения — увеличение выхода, активности целевого продукта и сокращение времени его получения.

Способ осуществля ют следующим образом.

Биопсийный материал опухоли получают на операции, опухолевую ткань замораживают и хранят при -20 С. Все препаративные работы, связанные с получением активного целевого продукта проводят при+4 С.

Образец ткани размораживают, взвешивают и гомогенизируют на льду в физиологическом растворе хлористого натрия. рН Ж 1747О76 А1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ АНТИГЕНОВ ИЗ ОПУХОЛЕВОЙ

ТКАНИ (57) Изобретение относится к медицине точнее к клинической иммунологии. Цель изобретения — увеличение выхода активности целевого продукта и сокращение времени его получения. Для этого опухолевую ткань гомогенизируют и одновременно подкисляют, фильтруют, охлаждают, добавляют хлористый калий, хроматографируют íà G-75 с элюцией целевого продукта дистиллированной водой.

4,5 — 5,0. Гомогенат фильтруют через капроновую сетку. Фильтрат охлаждают до 2-3 С и при рН 4,5-5,0 постепенно по мере растворения с помощью мешалки добавляют сухую навеску хлористого калия до конечной концентрации его в фильграте 3 M.Çêñòðàкцию проводят при 3-5 С при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 15-17 ч. Материал подвергают ультрацентрифугированию. Проводят очистку полученного супернатанта от хлористого калия и балластных веществ MM ниже 50 кд на колонке с сефадексом G-75, элюцию осуществляют дистиллированной водой. В качестве целевого продукта берут фракции свободного объема с ММ свыше 50 кд. Лиофилизируют их.

Пример 1. 0.4 г опухолевой тканИ ретинобластомы, полученной после. энуклеации пораженного глаза, гомогениэируют в

0,9$, физиологическом растворе хлористого натрия с рН 4.5 в соотношении вес: объем

1:9 (r на мл), Полученный гомогенат фильтруют через капроновую сетку, в фильтрат

1747076 доноры 105 +.4,5% с другими опухолями

106 + 6,8%, с неонкологическими заболеваниями 109,8+ 10,2%.

Пример 4, Все процедуры выполняют аналогично за исключением того, что препарат выделяют их опухолевой ткани аденокарциномы яичника. Основное содержание препарата составляет фракция 50 — 100 кд около 75%. Препарат проявляет специфическую иммунологическую активность в тесте

10 миграции лейкоцитов при испытании в группе больных с аденокарциномой яичника.

Оптимальная концентрация препарата по белку 200 — 400 мкг/мл опухолевой ткани позволяет увеличить выход препарата по белку в 30 раз, повысить биологическую активность в t0 раз в отличие от прототипа, получать иммунологически активн Iе нетоксичные препараты с ММ в области 50-100 кд., обладающие диагностической ценностью в клеточных тестах, а также уменьшить затрачиваемой рабочее время в 3 раза (с 6 — 7 сут по прототипу до 2 — 3 сут при использовании. предлагаемого способа) за счет ликвидации стадии обессоливания и последующего концентрирования, что предотвращает частичную потерю активного материала до 20-30%.

Формула изобретения

Способ получения водорастворимых антигенов из опухопевой ткани путем ее гомогениэации, подкисления до рН 4,5-5,0, фильтрации, охлаждения, добавления хлористого калия до 3 м, центрифугирования, гель-хроматографии и элюции целевого продукта,отличающийся тем,что,сцелью увеличения выхода, активности целевого продукта и интенсификации способа, гомогенизацию ткани проводят одновременно с подкиспением, а гель-хроматографию — на сефадексе G 75 с элюцией целевого продукта дистиллированной водой.

Составитель В,Литовченко

Техред М.Моргентал Корректор H.Êîðîëü

Редактор А.Долийич

3 .а 2453

Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и откры1иям при ГКНТ СССР

113035, Москва, К-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, уп.Гагарина. 101 обьемом 4 мл с рН 4,9 по мере растворения при постоянном перемешивании вносят сухой KCI до конечной его концентрации 3 М (0,89 г КО), оставляют при постоянном перемешивании на 16 ч при 40С. Затем фильтрат центрифугируют при 30000 об/мин 1 ч при 4 С. Супернатант подвергают очистке на колонке с сефадексом 6-75 (4х15 см), удаляют хлористый калий и растворимый материал с MM ниже 50 кд, элюцию проводят дистиллированной водой, Материал, проявляющий диагностическую активность в тесте торможения миграции лейкоцитов, собирают во фракциях внешнего объема колонки s области MM выше 50 кд. До 95% материала в препарате имеет MM 60 — 70 кд, Пример 2, Все процедуры выполняют, как в примерах i за исключением того, что источником препарата служит смесь биопсийного материала ткани ретинобластомы, полученной от нескольких больных, Экстракцию проводят при рН 4,5, Выделяют целевой продукт на колонке с сефадексом 6-75. Проводят анализ материала методом высокоэффективной хроматографии на колонке с СК 3000 ЯИ. Доля оптической плотности материала с MM 60-70 кд составляет 68% от общего спектра оптической плотности материала, выделенного предлагаемым методом.

П р и.м е р 3. Все процедуры выполняют, как в примере 1 за исключением того, что препарат получают из ткани меланомы кожи. Выделяют фракцию с MfVI более 50 кд после хроматографии на колонке с сефадексом G-75. Проводят анализ MM препарата.

Основное содержание препарата составляет фракция с MM около 70 кд до 85%.

Активность препарата определяют в тесте миграции лейкоцитов у больных с мепаномой кожи до лечения: индекс м игра ции. 85 +5%. Оптимальная концентрация препарата по белку 200 — 400 мкгlмл. В группах контрольных доноров

ИЫ был выше ипи равен 100%: здоровые

15 Предлагаемый способ получения водорастворимых антигенных препаратов из