Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l. - продуцент моноклональных антител к мyсовастеriuм воvis

 

Использование: биотехнология, медицина , ветеринария. Сущность изобретения: штамм получают гибридизацией мышей линии Balb/c, иммунизированных суспензией инактивированных гамма-облучением штаммов M.bovis, выделенных от больных коров, с клетками миеломы РзО1. Секреция моноклональных антител на 3 - 4-й день культивирования составляет 40 - 50 мкг/мл и 5 - 7 мг/мл через 20 - 25 дней в асцитической жидкости. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) № 506Д. Моноклональные антитела могут быть использованы для идентификации микробактерий. 1 табл. со С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4879126/13 (22) 01.11.90 (46) 23.06.92. Бюл.N. 23 (71) Московский научно-исследовательский . институт туберкулеза, Институт экспериментальной кардиологии Всесоюзного кардиалогического Научного центра АМН

СССР и Всесоюзный научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных (72) M.Â.Aíäðoñoâa, И.Н.Трахт, M.A.8ëàäNмирский, Л;К.Шипинв, Jl.M.Ходун, Л.А.Ильиных и Л.В.Погуляева (53) 678.085.23 (088,8) (56) Lancet, 1981, 25,7, р.167 - 169, Асса . Path. Microbiol.lmmunol.Scan ., 1985, 93, р.265 — 272.

J.Gener. М)сrobiol., 1985, 131, р.1825—

1831.

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения моноклональных антител (МкАТ) к микобактериям туберкулеза бычьего вида (М.bovis) и может быть использовано в медициwe, в частности фтизиатрии. а также в ветеринарии.

Целью изобретения является получение . штамма гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculusl, продуцирующих

МкАТ к интактным M.Ьоч! з. Штамм получен гибридизацией клеток селезенки мышей ли-нии BA в/с, иммунизированных инактивированными гамма-облучением полевыми штаммами M,bovis; с клетками миеломй

Рз01 в соотношении 3:1 с помощью 50/,-ного полиэтиленгликоля (мол.м. 3550). Клеточную смесь разливают в 96-луночные

„„. Ж„„1742326 А1 (я)з С 12 N 5/00А61 К 39/395 (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS 1 — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К MYC0BACTERUIM

ВОЧ1$ (57) Использование: биотехнология, медицина, ветеринария. Сущность изобретения: штамм получают гибридизацией мышей линии Baib/с, иммунизированных суспензией инактивированных гамма-облучением штаммов M.bovis, выделенных от больных коров, с клетками миеломы РЗО1. Секреция моноклональных антител на 3 — 4-й день культивирования составляет 40 — 50 мкг/мл и 5 — 7 мг/мл через 20- 25 дней в асцитической жидкости. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) М 506Д. Моноклональные антитела могут быть использованы для идентификации микробактерий. 1 табл. пластины по 2 10 спленоцитов на лунку.

Для культивирования и селекции гибридов используют среду RPM1-1640, содержащую

20 )(, телячьей эмбриональной сыворотки, 104 M гипоксантина, 4.10 M аминоптерина и 1,6. IO М тимидина. Культуральную жидкость гибридных клеток проверяют на содержание антител, специфически связывающихся с интактными M.bovis в твердофазном иммунофе рментном анализе (И ФА).

В результате из .1000-клеточных популяций . отбирают гибридому 2А1, продуцирующую антитела, высокоспецифичные к M.bovts.

Гибридомные клетки дважды клонируют методом предельных разведений по 1 кл. в лунку, содержащую в качестве "подложки"

4 10 кл. селезенки. После второго клонирования обнаружено 99;4 позитивных клонов.

1742326

Продукция антител сохраняется в течение 8 пассажей в культуре клеток.

Часть гибридомных клеток 2А1 замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 107; ДМСО в жидком азоте для хранения. Другую часть используют для получения. опухоли в асцитной форме у мышей ВА В/с введением внутрибрюшинно 4.10 кл. животным, подготовлен6 ным внутрибрюшинной инъекцией 0,5 мл вазелинового масла за 3- 30 дней до инъекции клеток. Асцит образуется через 20 — 25 дней, Из асцитической жидкости выделяют иммуноглобулины с помощью сульфата натрия (2,53 М раствора) . . Штамм 2А1 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером 506 Д и характеризуется следующими признаками.

Условия культивирования.

Среда RPM1-1640 с 20 (телячьей эмбриональной сыворотки, 4 мМ -глутимина, 10 мМ пирувата натрия, аминокислотами для базальной среды Игла, витаминами для среды Игла, 0,05 мМ меркаптоэтанола и в атмосфере 5 углекислоты.

Для выращивания штамма использу-. ют пластиковую посуду. Посевная доза

100 тыс,кл./мл. Клетки пассируют 1 раз в

3 — 4 дня, «ратность рассева 1:10, Культура суспензионная.

Культивирование в организме животных.

Для выращивания опухоли пригодны мыши BALB/с. Свежим мышам за 3 — 30 дней до инъекции штамма вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана или вазелина.

Штамм инъецируют внутрибрюшинно по

4-5 10 кл. в среде Игла, Асцит образуется через 20 — 25 дней. Штамм не перевивают.

Продуктивность штамма: секреция моноклональных антител на 3 — 4-й день культивирования 40 — 50 мкг в 1 мл культуральной среды и 5-7 мг в1 мл асцитической жидкости при определении методом торможения радиоиммуноадсорбции.

Характеристика полезного продукта: моноклональные антитела обладают избирательной специфичностью к поверхностным антигенам микобактерий туберкулеза бычьего вида. Стабильная секреция продук. та сохраняется как минимум до 10 пассажей ин витро и при культивировании клеток в мышах в виде асцитной опухоли..

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмой не обнаружена.

Криоконсервирование: 3,5 — 4,0 106 кл. штамма консервируют в 1,0 мл телячьей эмбриональной сыворотки с добавлением

10% диметилсульфоксида в пластиковых ампулах, Замораживание проводят в программном замораживателе по следующей

5 программе. температуру снижают до 4 С в

1 мин до 4 С и по 1ОC в 1 мин до -40 К, Клетки хранят в жидком азоте. Разморажи- вание: быстро при 37 С. Жизнеспособность после размораживания по включению три10 панового синего 80 — 85 .

Пример. Гибридомные клетки, храняющиеся в жидком азоте, размораживают быстро при 37 С, отмывают средой 199 и высевают в среду для культивирования, ко15 торая состоит из RPM1-1640 с добавлением

20 телячьей эмбриональной сыворотки, 4 мМ 1=глютамина, 10 мМ пирувата натрия, 0,05 мМ меркаптоэтанола и выращивают при 37 С в атмосфере 5 углекислоты, По20 севная доза 10 кл. в 1 мл. Через 3 — 4 дня концентрация антител в культуральной жидкости достигает 40 — 50 мкг/мл.

Специфичность взаимодействия антител с микобактериями туберкулеза бычьего

25 вида выявляют твердофазным иммуноферментным методом. Для этого на полистироловую 96-луночную панель для микротитрования сорбируют убитые гаммаоблучением или хлороформом микобакте30 рии: 0,1 мг культуры на ячейку в 100 мкл карбонат — бикарбонатного буфера {0,2 М; .рН 9;6) при 37 С в течение ночи. После насыщения панели 10 -ным раствором яичного белка в фосфатно-солевом буфере

35 (0,02 М; рН 7,2) для уменьшения неспецифического связывания антител пластиком в ячейки панели вносят по 100 мкл культуральной среды штамма 506Д на 1 ч, после чего панель трижды отмывают водопровод40 ной водой, а потом водой с 0,05 Твина 20 и, наконец, вносят растворенный в фосфатно-солевом буфере с 10 яичного белка и

0,05о Твина 20 конъюгат антител кролика против иммуноглобулинов мыши, ковалент45 но-связанных с пероксидазой (на 1 ч при

37 С).

После окончания инкубации несвязав- . шиеся продукты реакции отмывают указанным способом, а связавшуюся пероксидазу, 50 а значит антитела против микобактерий туберкулеза, определяют по расщеплению субстрата (Н О ) в присутствии хромогена — . ортофенилендиами..

Результаты иммуноферментного анали55 за специфичности МкАТ 506Д с микобактериями представлены в таблице.

Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что полученные МкАТ специфически реагируют с микобактериями туберкулеза бычьего вида, 1742326

Составитель M. Андросова

Техред М.Моргентал Корректор . Н. Ревская

Редактор И. Дербак

Заказ 2261 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Формула изобретения N. 506 Д-продуцент моноклональных антиШтамм гибридных культивируемых тел к Mucobacterlumbovls, клеток животных Mus musculus L ВСКК(П)