Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l. - продуцент моноклональных антител к холерному энтеротоксину биотипа эльтор

 

Использование: биотехнология, иммунология . Сущность изобретения: штамм получают гибридизацией сплено цитов белых мышей, иммунизированных очищенным препаратом холерного энтеротоксина с миеломой Р3-Х63/Ад8.653. Штамм под номером ВСКК(П) 433Д хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР и характеризуется следующими признаками: среда культивирования RPM1-1640 или ДМЕМ, содержащая 10 - 15% телячьей эмбриональной сыворотки. Посевная доза клеток 105 - 1,5105 кл/мл, коэффициент рассева 1:4 - 1:5. Модальное число хромосом 87. Титр моноклональных антител (МКА) в культуральной -жидкости 1:256 - 1:512 (ИФА), в асцитической жидкости 1:25600-1:51200 (ИФА), 1:16-1:32 (РП). Нейтрализация холерного энтеротоксина в пробе по Крейгу 1:2000, нейтрализация холерного энтеротоксина на клетках СНО 1:320 - 1:640. МКА относятся к классу Ig С2в. Они выявляют энтеротоксин в супернатантах штаммов холерных вибрионов биотипа эльтор, не дают перекрестных реакций с энтеротоксинами классического биотипа и E.coli, ЛПС, выделенными из холерных энтеротоксинов классического и эльтор биотипов , убитыми бактериальными клетками холерных вибрионов. МКА используют в диагностических целях для серологической идентификации холерных энтеротоксинов биотипа эльтор. С/1 С 2 чэ со hO ел

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4876007/13 (22) 22.10.90 (46) 23.06.92, Бюл.N 23 (71) Ростовский-на-Дону государственый научно-исследовательский противочумный институт (72) Т.А.Славянская, В.И.Мареев, Е.Ф.Кириллова и Т.М.Лесных (53) 578.085.23 (088.8) (56) Сидорович И.Г., Николаева И.А., Игнатьева Г.А. Моноклональные антитела к холерному токсину (получение и характеристика), — В сб. "Моноклональные антитела в микробиологии и вирусологии" — М„1985.

TamplIn МЛ . et ai,3. Gen.microbiol., 1989, ч.135, М 5, р.1195 — 1200, (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ХОЛЕРНОМУ ЗНТЕРОТОКСИНУ БИОТИПА ЭЛЬТОР (57) Использование: биотехнология, иммунология. Сущность изобретения; штамм получают гибридизацией спленоцитов белых мышей, иммунизированных очищенным препаратом холерного энтеротоксина с миеломой Р3--Õ63/Ag8.653. Штамм под ноИзобретение относится к биотехнологии, а именно к гибридомной технологии получения моноклональных антител (МКА), которые могут быть использованы для серо-. логической идентификации холерного энтеротоксина (ХТ) биотипа эльтор.

Известны способы получения МКА к хо. лерному токсину классического биотипа.

„>SU„„1742325 А1 (я)5 С 12 К 5/00, А 61 К 39/395 мерам ВСКК(П) 433Д хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии AH СССР и характеризуется следующими признаками: среда культивирования RPM1-1640 или ДМЕМ, содержащая 10—

15 телячьей эмбриональной сыворотки.

Посевная доза клеток 10 — 1,5 ° 10 кл/мл, коэффициент рассева 1;4 — 1:5. Модальное число хромосом 87. Титр моноклональных антител (МКА) в культуральной -жидкости

1:256 — 1:512 (И.ФА), в асцитической жидкости 1. 25600 — 1:51200 (ИФА), 1:16 — 1:32 (РП).

Нейтрализация холерного энтеротоксина в пробе по Крейгу 1:2000, нейтрализация холерного энтеротоксина на клетках СНО

1:320 — 1:640. MKA относятся к классу ig С2в.

Они выявляют энтеротоксин в супернатантах штаммов холерных вибрионов биотипа эльтор, не дают перекрестных реакций с энтеротоксинами классического биотипа и

Е.coll, ЛПС, выделенными из холерных энтеротоксинов классического и зльтор биотипов, убитыми бактериальными клетками холерных вибрионов. МКА используют в диагностических целях для серологической идентификации холерных энтеротоксинов биотипа эл ьтор.

Штаммы гибридных клеток, продуцирующих MKA к ХТ биотипа эльтор, в литературе не описаны.

Целью изобретения является получение гибридного штамма культивируемых клеток

Mus musculus, продуцирующего MKA к холерному энтеротоксину биотипв эльтор.

Штамм получают следующим образом.

1742325

Мышей линии Balb/c (массой 16 — 18 r) иммуниэируют гомогенным препаратом ХТ.

Для получения ХТ используют штамм — продуцент ХТ In vitro Vibrio eitor 1310 серовара

Огава. Лиофилизированный препарат ХТ растворяют в фосфатно-солевом буфере (рН

7,2), Схема включает 6 инъекций, Первые 2 инъекции проводят внутрибрюшинно(в/б) с интервалом в 1 мес в дозе 5 мкг по белку.

Перед первой иммунизацией раствор ХТ змульгируют с полным адъювантом Фрейнда (ПАВ), последующую иммунизацию проводят нативным раствором XT 1310. Затем через 2 недели 2 дня подряд внутривенно (в/в) вводят раствор XT в дозе 5 мкг по белку. 8аключительные инъекции раствором ХТ проводят через неделю два дня подряд в/б по 20 мкг по белку. Иммунизацию завершают за 3 дня до слияния.

Иммунные спленоциты мышей сливают с клетками плазмоцитамы мышей РЗ-Х

63/Ag8.653 в соотношении 2:1, Слияние клеток миеломы с клетками селезенки мышей проводят с помощью 507-ного раствора полиэтиленгликоля с мол.массой 4000g.

В стерильных условиях извлекают селезенку, измельчают ее с помощью гомогенизатора Даунса. Взвесь фильтруют через капроновое ситечко и обрабатывают 0,83 ным раствором NH4CI, забуференным трисбуфером, для лизирования эритроцитов.

Лимфоциты дважды отмывают средой ИглаМЕМ и смешивают с дважды отмытыми клетками миеломы. Смесь клеток отмывают один раз в 50-миллилитровой центрифужной пробирке, супернатант декантируют и к осадку добавляют 1 мл 50 -ного раствора полиэтиленгликоля в течение 1 мин по каплям при 42 С(на водяной бане). После этого в центрифужную пробирку медленно вносится бессывороточная среда RPM1-1640 в объеме до 10 мл. Взвесь клеток инкубируют при 37 С 10 мин, после чего один раз центрифугируют при 800 об/мин 7 мин. Супернатант декантируют и смесь клеток осторожно ресуспендируют в 40 мл ростовой среды (среда RPM1-1640 иди ДМЕМ с добавлением 207ь-ной сыворотки эмбриоНоВ коров, 5 мМ/мл 1=глютамина, 4 г/л глюкозы, 0,1 М пирувата натрия), содержащей компоненты ГАТ (0,0131 мг/мл гипоксантина, 0,000191 мг/мл аминоптерина, 0,00385 мг/ мл тимидина). Суспензию клеток в ГАТ-среде разливают по 0,1 мл в 96-луночные плоскодонные планшеты, в лунки которых за сутки внесены в качестве фидерного слоя— перитонеальные макрофаги белых мышей в дозе 1 10 кл наЪунку. Видимые клоны гибридных клеток появляются на 7 — 10-е сутки. Гибридому культивируют 14 дней на среде ГАТ. затем 7 — 10 дней на среде ГТ, после переводят на ростовую среду без селективных компонентов, Гибридому дважды клонируют методом предельных

5 разведений на фидере из мышиных перитонеальных макрофагов. В результате клонирования получают продуктивный штамм гибридных культивируемых клеток мыши, стабильно продуцирующих МКА заданной

15 специфичности, Штамм обозначают ВСКК (П) 433 Д, он хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки, Гибридные клетки ВСКК (П) 433 Д представляют собой крупные округлые клетки с узким ободком базофильной цитоплазмы

Ядра гиперхромные, неправильноовальной формы, крупные, с грубой структурой ядерного хроматина.

Культуральные признаки.

Культуральные свойства типичны для перевиваемых клеток мышиных плазмоцитом. Клетки ВСКК(П) 433 Д культивируются

25 в виде стационарной суспензии при 370С в пластиковой или стеклянной посуде при посевной дозе 1,0 — 1,5х10 кл,/мл в течение 3—

30 4 дней до плотности насыщения 8—

9х10 кл;/мл, Клетки пассируют один раз в

3 — 4 дня той же дозой. Коэффициент рассева

1:4 — 1:5, Культивирование ведут на питательной среде RPM1-1640 или ДМЕМ, содер35 жащей 10 — 15% эмбриональной сыворотки коров, 2 мМ1=глютамина, 8 — 10 MM буфера

НЕРЕЯ.

Культивирование штамма в организме экспериментальных животных.

40 Индукцию асцитных опухолей у интактных беспородных белых мышей и инбредных мышей линии Baib/с, внутрибрюшинно праймированных за 2 — 3 недели до введения гибридомы ПАФ в объеме 0,5 мл/мышь, 45 осуществляют путем инокулирования

5х10 — 10 гибридных клеток на одно живо7 тное в 2 мл среды, Иммунную асцитическую жидкость собирают по мере формирования асцитных опухолей через 10 — 14 дней в

50 объеме 2 — 6 мл, Кариологические признаки.

Модальное число хромосом 87, С-маркеры родительской миеломной линии Р3X63Ag8.653.

55 Характеристика моноклональных антител.

MKA относится к Ig62. Они выявляют энтеротоксин биотипа эльтор, не вступая во взаимодействие с энтеротоксинами классического биотипа и E=coll 026; ЛПС, выделен1742325 ными из холерных вибрионов классическог и эльтор биотипов; убитыми бактериальными клетками холерных вибрионов. Антитела тестируют в твердофазнам иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции преципитации (РП) по Оухтерлонии с XT 1310, по нейтрализации специфического действия

XT 1310 в тесте кожной проницаемости по

Крейгу и нейтрализации цитотоксического действия ХТ на овариальные клетки китайского хомячка (СНО). Класс иммуноглобулинов определяют в РП по Оухтерлони или в

ИФА с "Hibvidoma subisotyping kit, mouse, Calbiochem" (CLUA).

Титр МКА в культуральной жидкости

1/265-1/512 (ИФА); в асцитической жидкости 1/51200.(ИФА), 1/16 — 1/32 (РП); нейт-. рализации ХТ 1310 в пробе по Крейгу

1/2000; нейтрализации XT 1310 на клетках

СН О 1/320 — 1/640.

Стабил ьность п родукции антител сохраняется на протяжении пассажей в культуре и пассажей на животных в течение 18 мес (срок наблюдения).

Контаминация.

Бактерии и грибы в культуре клеток не обнаруживаются. Заражение микоплазмами и вирусами не исследовали., Криоконсервирование.

Клетки штамма ресуспендируют в среде

RPM1-1640, содержащей 50 эмбриональной сыворотки коров и 107, глицерина или диметилсульфоксида, Замораживание проводят ступенчато: после запаивания ампул — эквилибрация в течение 2 ч при 4 С, затем

24 ч в парах азота, затем клетки помещают в жидкий азот. Размораживание проводят быстро на водяной бане при 37 С. Жизнеспособность клеток по включению 0,25 ного трипанового синего составляет 80—

90;

Иссследование специфичности MKA.

В качестве антигенных препаратов втестах in vitro u in vivo используют убитые нагреванием бактериальные клетки холерных вибрионов, ЛПС и энтеротоксины, выделенные из холерных вибрионов классического и эльтор биотипов и Е.coli.

При постановке ИФА в качестве твердой фазы используют плоскодонные 96-луночные ИФА-пластины, позволяющие проводить фотометрический учет реакции.

Для определения специфичности МКА ИФА проводят на планшетах, сенсибилиэированных гомогенным препаратом ХТ 1310, ХТ 5698 или энтеротоксином E.coli 0,26 (10 — 20 мкг/мл по белку), либо суспензией убитых нагреванием бактерий (V,cholerae

569В, Кeltor 1310 1х10 кл/мл), либо ЛПС (5 — 10 мкг/мл по массе) в объеме 100 мкл в

0,05 M карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ) рН 9,6. Сенсибилизацию проводят в течение 18 ч при 4 С. В качестве вторых антител используют кроличьи антитела про5 тив иммуноглобулина мыши, меченные пероксидазой хрена. Субстратом служит ортофенилендиамин в цитратно-фосфатном буфере (рН 4,7). В качестве позитивного контроля используют иммунную поликло10 нальную антитаксическую мышиную сыворотку, в качестве негативного контроля— миеломный супернатант или асцитическую жидкость, индуцированную клетками миеломы.

15 РП по Оухтерлони проводят в микромодификации с использованием 0,8 — 1)(,-ного агара ("Difco") или сахарозы ("Serva"), приготовленных на фосфатном буферном растворе (рН 7,4). В слое геля вырезают лунки

20 на расстоянии 5 мм друг от друга, в цент, ральную лунку вносят MKA, а в периферические — гомо- и гетероантигены в объеме 0,03 мл (нагрузка энтеротоксинов составляет

25 — 30 мкг по белку на 1 лунку; цельных

25 убитых клеток 2 — Зх10 м.к, на. 1 лунку). о

Контролями служат: позитивным — антитоксическая холерная сыворотка; негативными — миеломная асцитическая жидкость, разво-. дящая жидкость.

30 Биологическую активность и специфичность МКА исследуют также в тесте проницаемости сосудов по Крейгу и на культуре клеток СНО, В предварительных опытах определяют

35 сосудистую проницаемость XT путем внутрикожного (в/к) введения кроликам последовательных разведений ХТ в объеме 0,1мл.

Для смеси ХТ вЂ” МКА используют наименьшую дозу ХТ, дающую четкую зону посине40 ния диаметром.7 — 8 мм. Для нейтрализации используют МКА из асцитической жидкости и лиофилизированные МКА. 0,1 мл ХТ в пороговой дозе объединяют с 0.1 мл MKA в последовательных разведениях (в фосфат45 но-солевом буфере, рН 7,2), инкубируют 1 ч при 37 С, после чего 0,1 мл полученного материала вводят в/к кроликам . Через 24 ч в/в вводят синьку Эванса и черед 1 ч измеряют диаметр окрасившейся зоны. Реакцию

50 нейтрализ-.öèè считают положительной,,если зона посинения будет диаметром не более 4 мм. Каждый опыт сопровождают положительным (нейтрализация ХТ гомалогичной экспериментальной кроличьей

55 энтитоксической сывороткой (АТС) и отрицательным (сосудистая проницаемость пороговой дозы ХТ1 контролями.

Для определения специфической антитоксической активности MKA в цитотоксическом тесте на клетках СН0 используют

1742325 антигена с антителом выявляют антимышиными глобулинами, меченными пероксидазой хрена. Оптическую плотность измеряют на многоканальном спектрофотометре

Multiskan МК 11 (Flow, UK) при длине волны

492 нм или визуально. Ярко-желтое или оранжевое окрашивание лунок пластины при бесцветных отрицательных контролях расценивают как специфическое. При наличии специфического окрашивания позитивного контроля, основанного на использовании антитоксической холерной сыворотки к XT биотипа эльтор, делают заключение о том, что асцитическая жидкость содержит М КА к энтеротоксину биотипа эльтор.

Пример 2. Цельные супернатанты культур холерных вибрионов, выращенных по известному методу, вносят в объеме 0,1 мл в лунки 96-луночных планшет, сенсиби20 лизированных MKA u XT биотипа эльтор

Составитель Т. Славянская

Редактор И. Дербак Техред M,Ìîðãåíòàë Корректор Н. Ренская

Заказ 2261 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

ПроиЗводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 препараты ХТ в минимальной дозе, оказывающей четкое цитотоксическое действие.

0,1 мл ХТ соединяют с 0,1 мл MKA в последовательных разведениях (в среде Игла с

1 инактивированной эмбриональной сыворотки коров), инкубируют 2 ч при 37 С, затем по 0,1 мл смеси вносят в плоскодонные лунки 96-луночной панели для культуры клеток. В каждую лунку добавляют по 0,1 мл суспензии клеток СНО в дозе Зх10 кл. Для з контроля специфического действия XT используют экспериментальную кроличью

АТС. В качестве отрицательного контроля используют контроль культуры клеток СНО.

Пластины- помещают в эксикатор во влажную атмосферу с 57 СОъ выдерживают 18 ч при 37 С. Учет проводят по 4-крестной системе.

В РП по Оухтерлонии МКА ВСКК (П) 433 Д на 7 с формируют в агаре одну четкую линию преципитации с ХТ биотипа Эльтор и не вЗаимодействует с другимй использованными антигенами и микроорганизмами, В ИФА MKA ВСКК(П) 433 Д. взаимодействуют только с гомологичным энтеротоксином. Показатели экстинкции реакции с ХТ

569В, ХТ 569 (Calblochem), ЛПС, а также с .цельными клетками штаммов; V.cholerae

5698, V.eltor 1310, имеют значение фонового сигнала.

Пример 1. 96-луночные ИФА-планшеты сенсибилизируют гомогенным препаратом XT биотипа эльтор (10 — 20 мкг/мл по белку) в КББ (рН 9,6), полученным по известному методу. Для получения ХТ используют штамм- продуцент ХТ In vitro. Планшеты выдерживают 1 ч при 37 С или 18 ч при 4 С, Промывают пластины фосфатно-солевым буфером (ФСБ) рН 7,4, содержащим 0,05ф, Твина-20 и раститровывают по 0,1 мл асцитическую жидкость, содержащую МКА, в

ФСБ с 1 -ным бычьим сывороточным альбумином(БСА) и 0,05 6 Твина-20. Инкубируют 2 ч при 37 С. Связавшиеся комплексы (10 — 20 мкг мл) в КББ (рН 9,6), Инкубируют

1 ч при 37 С, Пластины трижды промывают

ФСБ, содержащим 0,05 j Трина-20. В лунки добавляют конъюгированные с пероксидазой хрена МКА к XT биотипа эльтор в рабочем разведении и оставляют для контакта на

1 ч при 37 С. Приготовленный ех tempore субстрат по 0,1 мл добавляют в лунки и помещают пластины в темный шкаф на 15—

20 мин при комнатной температуре для цветового проявления реакции. Положительным контролем является реакция между

МКА и очищенным препаратом ХТ к биотипу эльтор. Для отрицательного контроля используют гетерологичные энтеротоксины и разводящую жидкость.

Результаты учитывают аналогично примеру 1.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L ВСКК(П)433

Д-продуцент моноклональных антител к холерному энтеротоксину биотипа эльтор.