Штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент термолабильного энтеротоксина

 

Использование: медицинская микробиология , получение термолабильного энтеротоксина, иммунологическая диагностика колиинфекций. Сущность изобретения: получен новый штамм Escherichla еоН, стабильно синтезирующий термолабмльмый энтеротоксин. Штамм E.coli выделен от больного с диареей , сератипироаан как 0 114 К 90, депонирован под № 193 в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских , биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича. При использовании.штамма № 193 получают термолабильный энтеротоксин, используемый в качестве антигена в диагностических препаратах. 4 табл.,4 пр.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4764902/13 (22} 12.12.89 (46) 23;06.92. Бюл.Ь23 (71) Ростовский научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологиии, паразитологии и гигиены (72) Л.Д.Мартыненко, Ю.В.Езепчук, А.В.Алешукина и С.Е.Воронов (53) 576.8.097 (088.8) (56) Вартаньян lO.H. с соавт. Бюлл. экс". перт.биол. и мед., 1978, 2, с.150 — 152. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA

COLt-ПРОДУЦЕ НТ ТЕ РМОЛАБИЛ Ь НОГО

ЭНТЕ РОТОКСИНА

Изобретение относится к микробиологии, а именно к биотехнологии, и может быть применено в технологическом процессе получения термолабильного энтеротоксина как антигена, необходимого для иммунологической диагностики колиинфекций с использованием реакции двойной диффузии в геле по Ouchtertony или других методов

Известен штамм Vibrio choterae, Туре

tnaba 569 В, наиболее часто используемый в лабораторных условиях для получейия термолабильного знтеротоксина и выбран- ный эа прототип, Для получения целевого продукта штамм культивируют на жидких питательных средах, биомассу осаждают центрифугированием. а иэ надосадочной жидкости извлекают энтеротоксин.

Недостатком известного штамма является высокая вирулентность, требующая вы полнения особого противоэпидемиче. БЫ 1742322 А1 (я)л С 12 и 1/20, А 61 К 39/108 (57) Использование: медицинская микробиология, получение термолабильного знтеротоксина, иммунологическая диагностика колиинфекций. Сущность изобретения: получен новый штамм Езслег1с@а сОН, стабильно синтезирующий термолабильный знтеротоксин, Штамм Е.сой выделен от больного с диареей, серетипирован как 0 114 К 90, депонирован под bL 193 в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских, биологических препаратов им.

Л.А.Тарасевича. При использовании.штамма М 193 получаюттермолабильный энтеротоксин, используемый в качестве антигена в диагностических препаратах. 4 табл.,4 пр. ского режима, что препятствует широкому использованию его в технологическом процессе производства термолабильного знтеротоксина.

Цел be изобретения . является новый штамм E.coll, обладающий стабильным свойством интенсивно синтезировать термолабильный энтеротоксин, для использо-. вания его в технологическом процессе производства термолабильнога энтеротоксина как антигена.

Штамм Е.соИ выделен из клинического материала больного диареей, депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им, Л.A.Tàðàñeâè÷a, код йя 193.

Свойства штамма E.colt 193, Морфологические признаки. Грамотрицательные палочки спор не образуют, сла1742322 боподвижные. При электронной микроскопии представляют собой палочки с закругленными концами длиной 1,53+0,21 мкм при tp 95%; 1,53+0,3 мкм при tp 99%; ширина 0,9й0,08 мкм при tp 95%; 0,9й0,12 мкм при tp 99%.

Культуральные признаки. На мясо-пептонном бульоне вызывают равномерное помутнение среды. На слабошелочном агэое— полупрозрачные гладкие светло-серые колонии диаметром 1,0 — 1,5 мм. На среде Эндо образуют розовые с металлическим Эндо образуют розовые с металлическим блеском колонии диаметром 1,5 — 2 мм, без признаков диссоциации.

Физиологические признаки. Штамм расщепляет глюкозу, лактозу, маннит, сахарозу, мальтоэу и ксилозу до кислоты и газа; арабинозу и дульцит расщепляет до кислоты со слабым образованием газа. Признаки уреазной активности и продукции сероводорода отсутствуют. Индолообразование замедленное на 3 — 5 сут. Не утилизирует цитрат, малонат, не имеет фенилаланин-дезаминазы; дает положительную реакцию с метиловым красным и отрицательную Фогеса-Проскауэра; обладает лизиндекарбоксилазной активностью, орнитиндекарбоксилаза отсутствует.

Чувствительность к антибиотикам. Определена по результатам исследования методом стандартных дисков, Штамм чувствителен K мономицину, стрептомицину, левомицетину, канамицину и гентамицину, Штамм устойчив к неомицину; эритромицину, метициллину, тетрациклину, ристомицину, полимиксину, пенициллину, оксациллину, карбенициллину, олеандомицину, ампициллину, линкомицину, фузидину, доксациклину.

Антигенная структура. Серотипирование штамма проведено с помощью поливалентных агглютинирующих эшерихиоэных сывороток (ОКА, ОКВ, ОКС, ОКД, ОКЕ), диагностических агглютинирующих эшерихиозных адсорбированных О-сывороток и агглютинирующих ОК-сывороток. Результаты представлены в табл.1 и 2.

Развернутая агглютинация проведена с сывороткой 0114К90 (с диагностическим титром 1:1600) культура живая. При этом агглютинация оценена на ф. в титре 1:1600.

Проведена агглютинация прогретой культуры с сывороткой 0114, Реакция агглютинации выражена в титре 1:1600 на ф и- +-, Культура Е.coll 193 серотипирована как

Е.coll 0114К90.

Вирулентные свойства, Lgjw составляет

4,0 млрд. микробных тел.

0,55 мг 2%-ного водного раствора HzS04, 20

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, Пример 1, Для продукции термолабильного энтеротоксина применяют питательную среду следующего состава, мл:

Мясо-пептонный бульон 1000 мл

Глюкоза 40%-ный водный раствор 6,25 мл

Линкомицин 30%-ный водный раствор 0,33 — 0,26 мл

Комплекс микроэлементов 1,0м — 0,5 мл

Способ приготовления среды: к стерильному мясо-пептонному бульону асептично добавляют раствор глюкозы, простерилизованный на водяной бане в течение 30 мин, линкомицин (для усиления токсинопродукции) и смесь микроэлеменводы растворяют навеску следующих реактивов: 0,5 г MnCI2, 0,5 г FeCla, 5,0 г MgSO4 и после полного растворения реактивов обьем доводят до 100 мл дистиллированной водой).

Биомассу культивируют 18 — 24 ч в термостате (37 С),.по окончании культивирования культуру инактивируют азидом натрия (1:1000) и после 30-минутной экспозиции при комнатной температуре осаждают центрифугированием при 5 тыс,об/мин в течение 25 — 30 мин при 4 С. Осадок ресуспендируют в 0,01 M трис-HCl буфере и дезинтегрируют на ультразвуковом дезинтеграторе при ампитуде 20 кГц в течение 7 — 10 мин, Обломки бактериальных клеток осаждают центрифугированием при

12 тыс. об/мин втечение 10мин. Супернатант содержит термолабильный энтеротоксин, Хроматографически чистый энтеротоксин получают методом аффинной хроматографии и гель-фильтрации на колонке с сефакрил S 200.

Характеристика термолабильного энтеротоксина: препарат очищенного термолабильного энтеротоксина изучен методом дискэлектрофореза в полиакриламидном геле в сравнительных опытах с холерогеном (Cholera toxin, Vibrio cholerae, Туре Inaba

569В, Calblochem), При этом установлено, что по электрофоретической подвижности термолабильный энтеротоксин Е.coll 193 не отличается от холерогена, имевшего мол.м.

84000.

Пример 2. Термолабильный энтеротоксин штамма Е,coll 193 использован в качестве антигена в реакции двойной диффузии в геле по Ouchterlony для обнаружения специфических антител в сыворотке

1742322.

Таблица 1.

Результаты реакции агглютинации на стекле штамма Е.coll 193 при различных условиях хранения крови, копрофильтратах или другой биологической жидкости.

В центральные лунки штампов пластин вносят 25 мкл антигена (термолабильный энтеротоксин), в периферические — растит- 5 рованный исследуемый материал (сыворотка, копрофильтрат и др.) Исследуемый материал титруют в физиологическом растворе с кратностью 2, т.е. цельный 1;2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32. Пластину помещают во влаж- 10 ную камеру на 18 — 24 ч. По истечении указанного срока проводят учет. 3а титр реакции принимают то разведение сыворотки или другого исследуемого материала, при котором отчетливо видна линия преци- 15 питации.

Серологическая актвность с антитоксической сывороткой хроматографически чистого термолабильного энтеротоксина в РДДГ составляет 1:32„биологическая активность. в 20 тесте отека лапки белой мыши — 89 мг.

Пример 3. Изучение интенсивности токсинопродукции штаммом Е.соН 193 проведено в сравнении с эталонным штаммом

Е.соН О/148: Н28 7а. 25

В колбы объемом 3 л, содержащие по

300 мл питательной среды, вносят по 30 мл инокулянта, предоставляющего собой смыв суточной агаровой культуры, содержащей

5- 6 млрд м.т. на 1 мл. Колбы устанавливают 30 . на электромагнитные мешалки в термостате и перемешивают при скорости вращения электромагнита 50 об/мин, Через 18 ч культивирования культуру инактивируют азидом натрия (1:10000) и через 30 мин 35 биомассу осаждают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 25 —. 30 мин при

4 С. Осадок ресуспендируют в 30 мл 0,01 M трис-HCI и дезинтегрируют на ультразвуковом дезинтеграторе при амплитуде 20 кГц в 40 течение 7 — 10 мин.

Обломки бактериальных клеток осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант, представляющий собой лизат бактериальных клеток (ЛБК), содержащий термолабильный энтеротоксин подвергают исследованию.

Результаты сравнительного изучения интенсивности токсинопродукции штаммов

Е.coll 0148 и Е.соН 193 представлены в табл.3.

Таким образом, как следует из данных табл.З, штамм Е.соН 193 обладает более выраженной токсинопродукцией по сравнению с эталонным штаммом Е.coll 0148.

Пример 4. Изучают способность штамма Е.coll 193 стабильно продуцировать термолабильный энтеротоксин, С этой целью штамм подвергают исследованйю в динамике в течение 17 мес.

Результаты исследований представлены в табл.4, Как видно из табл.4 по определению биологической активности в тесте отека лапки белой мыши и серологической активности в РДДГ с антитоксической сывороткой штамм сохраняет способность к токсинопродукции в течение 17 мес, Таким образом, штамм Е.соН 193 является стабильным продуцентом термолабильного энтеротоксина (антигена). что может быть использовано в промышленном производстве термолабильного энтеротоксина как антигена, необходимого для иммунологической диагностики колиин-, фекции.

Формула изобретения

Штамм бактерий Escherichia coil TUCK

М 193-продуцент термолабильного энтеротоксина.

1742322

Таблица 2

Результаты развернутой реакции агглютинации Е.соИ 193 при различных условиях хранения

Таблица 3

Показатели биологической и серологической активности ЛБК*

* Число опытов для каждого штамма составляет 6;

** Среднеарифметические титры.

Таблица 4

Стабильность токсинопродукции штаммом Е.соИ 193

Составитель Л. Мартыненко

Редактор Т. Иванова Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор H Ревская

Заказ 2261 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101