Способ получения сыворотки для иммунодиагностики ящура животных
Использование: иммунодиагностика ящура животных Сущность изобретения кроликов иммунизируют внутримышечно 2 раза (интервал между инъекциями 21-24 дн) коммерческой инактивированной вакциной с содержанием 146 S антигена 32-120 мкг/мл. а забор крови осуществляют через 7-8 дн после второй иммунизации. Активность полученной сыворотки в реакции связывания комплемента с гомологичным антигеном составляет 1:256. 4 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (51)s А 61 К 39/42
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4854443/13 (22) 25.07.90 (46) 23,06.92. Бюл. N 23 (71) Всесоюзный государственный научноконтрольный институт ветеринарных препаратов (72) Б.А.Кругликов. T.ß.Òàðàñåíêî, Е.Л.Салажов и В.И.Шепилов (53) 615.373.34 (088.8) (56) Ветеринария. N. 8, с. 69-72, 1962.
Изобретение относится к. биотехнологии,в частности к ветеринарной иммунологии и,может быть использовано в производстве диагностических сывороток для определения типовой и штаммоспецифической принадлежности вируса ящура в иммунологической реакции, Известны способы получения диагностических сывороток с использованием разных схем гипериммуниэации морских свинок ящурным антигеном и применением различных адЪювантов.
Известен способ получения штаммоспецифических ящурных сывороток для серологических реакций, . Способ включает следующие этапы.
Вначале заражают морских свинок массой
450 — 500 г введением в кожу подушечек задних конечностей 0,2 мл 10 %-ной суспензии афтозного вируса ящура. Затем отбирают в качестве продуцентов сыворотки морских свинок, заболевших генерализованной формой ящура. Через 30 — 45 дней отобранным морским свинкам 2 — 3 раза внутримышечно
„„5U„„1741802 А1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ
ДЛЯ ИММУНОДИАГНОСТИКИ ЯЩУРА ЖИВОТНЫХ (57) Использование; иммунодиагностика ящура животных, Сущность изобретения: кроликов иммуниэируют внутримышечно 2 раза (интервал между инъекциями 21 — 24 дн) коммерческой инактивированной вакциной с содержанием 146 S -антигена 32 — 120 мкг/мл. а забор крови осуществляют через
7-8 дн. после второй иммунизации. Активность полученной сыворотки в реакции связывания комплемента с гомологичным антигеном составляет 1:256. 4 табл. в области бедра вводят 20 -ную суспензию афтозного вируса на 1/15 М фосфатном буферном растворе сапонина.
Через 10 дней после последней иммунизации животных обескровливают и получают иммунную сыворотку, Кроме того, известен способ получения сывороток для иммунодиагностики ящура животных, включающий иммунизация кроликов введением 10 -ной сусаензии вируса ящура на физиологическом растворе (вирус для гипериммунизации получают из мышечной ткани крольчат, прошедших не менее 12 пассажей).
Суспензию вируса вводят кроликампродуцентам одновременно внутримышечно и внутривенно в области бедра и ушную вену I(0 2 мл. Всего делают шесть инъекций вируса с интервалом между введениями 8 дней, Забор крови осуществляют на 10-й день после последней инъекции. Полученные сыворотки проверяют в реакции связывания комплемента (РСК) на активность и
1741802 специфичность, Результаты титрования сывороток: типа С вЂ” 1:16,:типа Π— 1:10.
Таким образом, известный способ, как и другие подобные, не позволяет получить сыворотку высокой активности и специфич- 5 ности, Цель изобретения — повышение активности и специфичности сыворотки, а также сокращение процесса иммунизации.
Способ осуществляют следующим об- 10 разом. Кроликов массой 2;5-3,0 кг иммунизируют коммерческой инактивираванной эмульсионной вакциной против ящура животных с содержанием 32 — 120 мкг/мл 146 S антигена. Вакцину вводят дважды в дозе 15
2 + 0,2 мл внутримышечно с интервалам
21 — 24 дня, а через 7 — 8 дней после второй инъекции антигена осуществляют забор крови.
Тотальное обескровливание кроликов 20 проводят путем взятия крови из сердца.
Полученную кровь выдерживают в течение
1,5 — 2 ч в термостате при 37 + 2 С, затем обводят. сгусток пастеровской пипеткой и оставляют кровь в холодильнике (4 С} на 25
16 — 18 ч, после чего центрифугируют при
2000 об/мин (или просто сливают), Полученную сыворотку разводят физиологическим раствором 1:2 и инактивируют в водяной бане при 60 ++ 2 С. Затем проверяют в реак- 30 ции связывания комплемента (PCK) с гомологичными и гетерологичными антигенами.
Гомологичный антиген — это антиген,на который получена сыворотка.
Для иммунизации кроликов-продуцен- 35 тов используют эмульсионную противоящурную вакцину.
Пример 1. Группу из 6 кроликов вакцинируют эмульсионной противоящурной мановакциной из штамма вируса ящура 40 типа О М 194. Препарат, содержащий 120 мкг/мл 146 S антигена, вводят в объеме 2 мл внутримышечно, Спустя 7, 14 и 21 день проводят повторную вакцинацию кроликов.
Вакцину с такой же концентрацией 146.S 45 антигена вводят в объеме 2,0 мл внутримышечно, Через 8 дней после второй вакцинации берут кровь, получают сыворотку и провереат ее активность в РСК на наличие типаспецифических антител к вирусу ящура 50 типа О, Результаты реакции учитывают визуально па степени задержки гемолиза зритроцитов и выражают в крестах, Предельным титром сыворотки считают 55 ее наивысшее разведение, дающее с гомологичным антигеном, взятым в удвоенном рабочем титре (Р,Т.), задержку гемолиза 90100 $ эритрацитав.
Результаты опыта, приведенные в табл.
1, показали, что сыворотки, полученные при введении вакцины с интервалом 21 день, обладают более высокой активностью.
Пример 2, Двум группам кроликов массой 2,5 — 3,0 кг вводят эмульсионную противоящурную моновакцину из штамма вируса ящура А22 с содержанием 120 мкг/мл 146 S антигена в дозе 2,0 мл.
Одну группу повторно вакцинируют введением такой же дозы преперата через
21 день, а вторую четырехкратно: на 7, 14, 21 v 28 день, Обескровливание кроликов пра —,одят через 8 дней после последней иммунизации. Результаты исследования приведены в табл. 2.
Проведенные исследования свидетельствуют о том, что увеличение кратности введения специфического антигена не дает увеличения титра антител в сыворотках крови гипериммунизированных кроликов, П р и м. е р 3. Группу из 8 кроликов массой 2,5 — 3,0 кг иммунизируют введением моновалентной эмульсионной противоящурной вакцины на основе вируса ящура типа А 2 N- 550 серии 85.
Препарат, содержащий 32 мкгlмл 146 S антигена, вводятживотным внутримышечно в объеме 2,0 мл, Через 24 дня после первого введения вакцину инокулируют кроликам повторно в том >кеобъеме. На 7-й день после второго введения. вакцины кроликов абескровливают.
Полученную после оттаивания и центрифугирования крови сыворотку разводят физиологическим раствором 1:2, инактивируют прогреванием при 60 + 2 С s течение
40 мин и проверяют в РСК на активность и штаммоспецифич ность, Исследования показали, чта полученная па предложенному способу сыворотка активна в разведении 1;256 с гомологичным антигеном и дает отрицательные результаты с гетерологичными антигенами вируса ящура типов О и С, Пример 4, Группе кроликов вводят вакцину из штамма вируса ящура типа О М
194 с содержанием 80 мкг/мл 146 S антигена, Повторную гипериммунизацию проводят через 21 день и обескровливают кроликов через 7 дней после повторного введения, Полученную после отстаивания и центрифугирования сыворотку после инактивации проверяют в РСК на типо- и штаммоспецифичность с гомологичными и гетеролагичными at тигенами.
Сыворотка, полученная на введение средних доз (80 мкгlмл) 146 S антигена типа
0 М 194, активна в разведении 1:256.
1741802
Пример 5, Группе кроликов вводят 2 мл вакцины с содержанием 50 мкг/мл 146 $ антигена А22. Повторную гипериммуниза-цию проводят через 24 дня и животных обескровливают через 8 дней после повторного 5 введения. После отстаивания и центрифугирования сыворотку проверяют в РСК с гомологичными и гетерологичными антигенами типов 0 и С. Сыворотка активна в разведении 1:256, кроме того, она типо- и штаммос- 10 пецифична.
Таким образом, оптимальный интервал между введением вакцины для гипериммунизации составляет 21-24 дня.
Пример 6. В реакции связывания 15 комплемента (РСК) проводят сравнительное титрование сыворотки, полученных по предлагаемому способу и производственных.
Результаты сравнительног0 титрования 20 приведены в табл. 3. Из табл. 3 видно, что сыворотки. полученные по предлагаемому
:способу, по.активности значительно превосходят производственные, когда в качестве продуцентов используют морских 25 свинок.
В табл, 3 в первых трех строчках показан контроль главного опыта, в котором использованы биофабричные сыворотки и антигены. 30
В табл. 4 показана активность полученных сывороток от кроликов (две строки), которая составляет 1:256 с -гомологичным антигеном А2г и 0 М 194.
Для сравнения приведены данные по 35 активности диагностических. (биофабричных) сывороток, полученных путем гипериммунизации морских свинок (две нижние строки), которые активны с гомологичными антигенами А22 и 0 hL 194 в разведении 1:32.40
По существующим требованиям специфичность сыворотки не должна превышать
5% по отношению к ее активности. Из табл.
4 видно, что сыворотки, полученные по предлагаемому способу, более специфичны 45 (начиная с разведения 1:4) при активности
1:256.
Пример 7. Таким образом проведенные исследования свидетельствуют о том, 50 что предложенная в качестве специфического антигена коммерческая вакцина с содержанием 146 S антигена 32 — 120 .мкг/мл и схема двукратной иммунизации таких доноров, как кролики, позволяют получить высокоактивные типо- и штаммоспецифические ящурные сыворотки для диагностических целей, Предлагаемыи способ предназначен для получения сыворотки с целью иммунодиагностики ящура. Исследованию может быть подвергнут любой афтозный материал, полученный от всех видов восприимчивых животных (все виды парнокопытных), а также лабораторных (вируссодержащая ткань от крольчат, морских свинок и вирус,полученный в первичных культурах почки крольчонка и свиньи).
В табл. 4 йриведены данные проверки активности культурального антигена, полученного в первичных культурах почек крольчонка и почки свиньи. Из табл, 4 видно, что обычной (биофабричной) сывороткой такой антиген уловить. невозможно, в то время как, используя высокоактивную сыворотку, полученную по предлагаемому способу, активность проверяемых антигенов равна
1:4 и 1:8.
Формула изобретения
Способ получения сыворотки для иммунодиагностики ящура. животных, предусматривающий иммунизацию кроликов— доноров сыворотки. — ящурным антигенсодержащим материалом, последующий забор крови и отделение целевого продукта, о т.л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения активности и специфичности целевого продукта, кроликов иммунизируют внутримышечно дважды с интервалом между иньекциями 21-24 дня, в качестве антигенсодержащего материала используют коммерческую инактивированную змульсионную вакцину против ящура животных с концентрацией 146 S антигена, равной 32—
120 мкг/мл. а забор крови осуществляют через 7-8 дней после повторной инъекции антигена.
Тaánица 1
1741802
Таблица 2
Таблица 3
АНтигЕн А22
¹ 550 серия
27 Т1:32
Антиген 0
¹ 194 серия
18Т1:8
Антиген С. Без антигена
¹ 546 серия
57 Т1:8
Разведение
Антиген
Сыворотки
P.Т.
P.T.
Сыв, А22 с, 73
Т 1:40
: Сыв. 0 ¹ 194
: с. 74Т1:50 ,Сыв. С № 564 с,13Т 1:40 ,,Смесь сыво:роток от кроликов, после гипериммуни.заций змульсионной вакциной А22
Р.Т.
P.Т, 1/2
1/4
1/8
1/16.
1/32
1/64
1/128
1/256
1/512
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/128
1/256
1/512
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
++++
++++
++++
+++9
++++
++++.
++++
++++
:Смесь сыво,роток от,кроликов, после ,гипериммунизации эмульсионной вакциной из штам:ма 0 №194
Сыворотка
M/ñâ ВНИЯИ
22 ¹ 550 серия 73 Т 1:40
++++
++++
++++
++++
++++
Сыворотка
/св ВНИЯИ
¹ 194 серия
74 T 1;40
++++
++++
++++
++++
++ Без сыво отки
П р и м е ч а н и е. Т вЂ” титр сыворотки, т.е. ее наивысшее разведение, способное вступать в реакцию, P.Т, — рабочий титр, это удвоенный титр, применяемый в реакции.
1741802
10 1вблица 4
Био аб ичные сыво отки
П е лагаемые сыво отки
Разведение
П р и- Сыворотмер ки
Без сыворотки
Сыв. 0
N 194
Экспер. серия от кроликов
Т 1:256
Сыв. А22
Эксп. серия от кролик.
Т 1:256
Сыв. 0 . Без. сыво1Ф 194 се- ротки рия 74
Т 1:50
Сыв,. А22 с. 73
Т 1:40
Антигень1
P.Т.
P.Т, P.Т.
P.Т.
Ант. А22
М 550 с 27.
Т 1, 32
Ант, 0
М 194 с 18
Т 1:18
Анти ген культуральный почки крольчонка (ПК) А г
Антиген культуральный почки свиньи 0
%194(ПС)
Без антигена
Р.Т.
++++
Р.Т, U, 1/2
1/4
1/8
++++
++++
++++
+++
1/2
1/4
1/8
1/16
++++
++++
++++
++++
Составитель Б.Кругликов
Редактор С.Патрушева Техред М.Моргентал Корректор М.Пожо
Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина, 101
Заказ 2235 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская нэб.. 4/5
