Способ получения вирусного антигена для диагностики висны- мэди у овец в серологических реакциях
Использование, вирусология, диагностика Сущность изобретения в качестве производственного штамма использовали изолят 10 ВИЭВ вируса висны-мэди, а в качестве чувствительной к нему культуры клеток - первично-трипсинизированную культуру клеток сердца ягненка и ее субкультуры. Разработан метод концентрирования вирусного антигена из инфицированной культуральной жидкости 10-15% ПЭГом (М 6000) в присутствии 0,5 М хлористого натрия путем центрифугирования при 10000 об/мин 30-40 мин с последующим ресуспендированием осадка в трис-НС -буферном растворе (рН 7,2-7,4) до 30-60-кратной концентрации от исходного объема инфицированной купьтурэльной жидкости 1 табл. сл с
союз соВетских
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (я)5 А 61 К 39/21
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21} 4853662/13 (22) 20.07.90. (46) 15,07.92, Бюл, N 26 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.P. Коваленко (72) Б.Ф. Шуляк, Ю;Д. Караваев, Л.П. Дьяконов, Т.В. Гальнбек и Т.Гомбосурэнгийн (53) 616.07(088.8) (56) Cutlig R.Ñ., Jackson T.À., Laird G,А.
"Immunodiffusion test for ovine progressive
pneumonia", Amer, i. Vet. Res., 1977, v, 38, М
7, р. 1081-1084.
Шуляк Б.Ф. Виска-мэди у овец рома. HoBcKoA породы (этиология, распространение и диагностика). Автореф. канд. дисс. M., .1985, с, 1-22. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСНОГО
АНТИГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИСНЫИзобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к способам получения антигена вируса висны-мэди для серологической диагностики этой инфекции у овец, Цель изобретения — повышение активности и выхода целевого продукта с одновременным снижением продолжительности технологического процесса и себестоимости получаемого продукта.
Поставленная .цель достигнута тем, что для репродукции штамма 10 ВИЭВ вируса висны-мэди используют первично трипсинизированную культуру клеток сердца и ее субкультуры, собранную на стадии разрушения 70-80% монослоя инфицированную . культуральную жидкость подвергают замо. Ж 1747077 А1
МЭДИ У ОВЕЦ В СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ (57) Использование: вирусология, диагностика, Сущность. изобретения: в качестве производственного штамма использовали изолят 10 ВИЭВ вируса висны-мэди, а в качестве чувствительной к нему культуры клеток — первично-трипсинизированную культуру клеток сердца ягненка и ее субкультуры. Разработан метод концентрирования вирусного антигена из инфицированной культуральной жидкости 10-15%
ПЭГом (М 6000) в присутствии 0,5 M хлористого натрия путем центрифугирования при
10000 об/мин 30 — 40 мин с последующим ресуспендированием осадка в трис-HCI-бу- 2. ферном растворе (рН 7,2 — 7,4) до 30 — 60-кратной концентрации от исходного объема инфицированной кчльтуральной жидкости. С
1 табл. раживанию-оттаиванию с последующим Фь концентрированием вирусного антигена 4
ПЭГом в присутствии 0,5 M хлористого на- (.) трия. «4
Пример 1. В опыте использовали 10 матрасов объемом 100 мл с культурой клеток сердца ягненка (СЯ). Культуру заразили штаммом 10 ВИЭВ вируса висны-мэди в дозе 1 ТЦД 50/мл. Через 6 дн; вследствии цитопатического действия вируса разрушилось 80% клеток монослоя. Собранную в этот период инфицированную вирусом культуральную жидкость после 1 (5 матрасов) или 3 (5 матрасов) циклов замораживания оттаивания отце грифугировали для осаждения клеточного д.",бриса при 3000 o6/мин в течение 20 мин. В осветленную культу3
1717077 ральную жидкость добавили 0,5 M хлористого натрия и 15% ПЭГ (М6000), Посредством встряхивания довели хлористый натрий и
ПЭГ до полного растворения. Смесь оставили в холодильнике при 4 С на 15 ч. Затем ее подвергли центрифугированию при 10000 об/мин в течение 40 мин. Надосадочную жидкость из центрифужных стаканов слили, а осадок ресуспендировали в трис-HCI-буферном растворе (рН 7,3) до 1/60 первоначального объема инфицированной культуральной жидкости. Активность полученных антигенов исследовали в РДП титрованием с серийными разведениями позитивной контрольной антисыворотки к вирусу висны-мэди. Титр антигенов, приготовленных из подвергнутых 1 и 3 циклам замораживания-оттаивания инфицированных культуральных жидкостей, составил 1:3 и 1:5 соответственно, Оба антигена давали специфическую реакцию.
Пример 2. В опыте использовали 8 матрасов объемом 1,5 л с культурой клеток
СЯ. зараженной штаммом IO ВИЭВ вируса висны-мэди в дозе 0,8 ТЦД 50/мл, Инфицированную культуральную жидкость собрали на 7-й день. после заражения, когда в результате цитоматического действия возбудителя разрушилось около 80% монослоя.
Ее подвергли 3 циклам замораживания-оттаивания, центрифугированию при 3000
o6/мин в течение 20 мин, смешали осветленную надосадочную жидкость с 0,5 М хлористого натрия и 10% ПЭГ (M 6000), после чего выдержали при 4 С в течение 15 ч и отцентрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин, Осадок ресуспендировали в трис-НС)-буферном растворе (pH 7,2) до
1/40 первоначального объема инфицированной культуральной жидкости. Титр полученного антигена в РДП был равен 1:2.
Диагностикум не давал неспецифические реакции.
Пример 3. Культуру клеток СЯ в роллерных флаконах объемом 0,2 л заразили 0,9 ТЦД 50/мл штаммом 10 ВИЭВ вируса висны-мэди. Через 6 дн. после заражения вследствии цитопатического действия вируса разрушилось 70% монослоя роллерных культур. Собранную в этот период инфицированную культуральную жидкость подверли 3 циклам замораживания-оттаивания, центрифугированию при 3000 об/мин в течение 20 мин. В осветленной культуральной жидкости растворили 0,5 М хлористого натрия и 12% полиэтиленгликоля, Смесь выдержали при 4 С 18 ч и отцентрифугировали при 1000 об/мин в течение 30 мин. Осадок после удаления из центрифужных стаканов надосадочной жидкости, ресуспендировали товление первично трипсинизированной культуры клеток и ее субкультур, зараже50 ние их штаммом 10 ВИЭВ вируса висны-мэди, сбор инфицированной культуральной жидкости на стадии разрушения 70-80% монослоя с последующим замораживанием-оттаиванием, концентрированием из надосадочной жидкости вирусного антигена ПЭГом, инкубирование при 4 С в течение
10-12 ч, осаждением и ресуспендированием в трис-HCi-буферном растворе до 30-60 кратной концентрации от исходного объема, отличающийся тем.чтосцелью
45 в трис-HCI-буферном растворе (рН 7,4) до
1/50 исходного объема инфицированной культуральной жидкости, Титр полученного антигена в РДП составил 1/5.
Пример 4. Обобщенные результаты 2 серий экспериментов по изготовлению преципитирующего антигена из штамма 10 ВИЭВ вируса висны-мэди на культурах клеток
СЯ и тестикулог, эь:брионов овцы (ТЭО) представлены в таблице.
Средняя концентрация преципитиногена вируса определялась как среднее арифметическое частных от деления преципитирующей активности всех серий антигена, определенной в РДП, на кратность их концентрирования ПЭГом по сравнению с исходным объемом инфицированной культуральной жидкости. Выражена в преципитирующих единицах-ПЕ. 1ПЕ соответствует наибольшему разведению антигена, дающего в РДГ : с днтисывороткой видимую линию преципитации.
Вирусный антиген полученный предложенным способом является высокоактивным. Предложенный способ позволяет значительно сократить продолжительность технологического процесса, поскольку культура клеток СЯ быстро формирует монослой и разрушение его штаммом 10 ВИЭВ вируса висны-мэди происходит приблизительно на
1 нед. быстрее, чем других клеточных систем, Полученный антиген имеет более низкую себестоимость за счет доступности и низкой стоимости сырья для изготовления культуры клеток СЯ, а также возможности проведения многократного (в наших опытах до 25 — 30 пассажей) субкультивирования этой культуры клеток.
Предложенный способ найдет применение в лабораториях и на биопредприятиях при олучении вирусного антигена для диагностики висны-мэди у овец в серологических реакциях.
Формула изобретения
Способ получения вирусного антигена для диагностики висны-мэди у овец в серологических реакциях включающий приго1
1747077
Составитель В.Свиридова
Техред М,Моргентал Корректор. Н.Король
Редактор А.Долинич
Заказ 2453, Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж.-35, Раушская наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 повышения активности и выхода целевого продукта с одновременным снижением продолжительности технологического процесса и себестоимости получаемого продукта, в каче5 стае первично трипсинизирован ной культуры клеток используют культуру клеток сердца ягненка, а концентрирование ПЭГом проводят в присутствии 0,5М <лористого натрия.
