Штамм коронавируса lp (ленинград)2/77 для диагностики коронавирусной инфекции

 

Штамм коронавируса Lp (Ленин .град/2) 77 (хранится в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.ИвановСКОРО под номером ГКВ-1770) для диагностики коронавирусной инфекции.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„924953

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ .КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 2925752/28-13 (22) 19.05.80 (46) 07. 12.88. Бюл. Р 45 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт гриппа. (72) Т.И.Юрлова, Д.A.Гвозднлова, Е.П.Зверева, Р.П.Попова и В.П.Сухинин (53) 576.077.37 (088.8) (51)4 А 61 К 39/215//С 12 N 7/00 (54) ШТАИИ КОРОНАВИРУСА Lp (ЛЕНИНГРАД/2) 77 ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ (57) Штамм коронавируса Lp (Ленин.град/2) 77 (хранится в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского под номером ГКВ-1770) для диагностики коронавирусной инфекции.

924951

Изобретение относится к области медицинской вирусологии и может быть использовано для приготовления коронавирусного диагностикума.

Предложенный штамм новый в патентной и научно-технической литературе не описан, Целью изобретения является получение высокопродуктивного штамма для диагностики коронавирус:ной инфекции.

Предлагаемый штамм получен из эталонного путем длительной его адаптации к условиям культивирования в органной культуре из трахеальной ткани плоца человека и в диплоидной культуре клеток из легочной ткани эмбриона человека. Продолжительность адаптации штамма к клеткам различного происхождения составила 209 дней. 20

Штамм коронавируса Lp (Ленинград/

/2)77 для диагностики коронавирусной инфекции хранится в Государственной коллекций вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского йод номером

ГКВ-1770.

Штамм характеризуется следующими .признаками.

Морфология. По данным электронномикроскопических исследований варио- 30 ны имеют диаметр от 80 до 160 нм.

Структура вариона достаточно полиморфна. Варионы имеют шаровидную, округлую, эллиптическую, иногда слегка изогнутую форму и покрыты отростками длиной 15 нм, образующими ореол вокруг вирусных частиц.

Репродукционная активность. Штамм характеризуется высокими показателями репродукционной активности в куль. 4 туре клеток легочной ткани плода человека. Инфекционный титр равняется 6,0 1g ИД /м. Pi условиях адаптации к размножению B органной культуре из трахеи плода человека штамм обладает способностью подавлять мерцательную активность клеток реснитчатого эпителия на 757.

Сравнительный анализ инфекционной активности эталонного и диагностического штаммов коронавируса показал, что предлагаемый штамм относится к категории высокоурожайных вирусов.

Это подтверждается результатами определения титров вирусов на культу55 рах различного происхождения..Так, диагно гический штамм имеет следующие пок:;;. тели инфекционной активности: в клетках органного эпителия че2 ловека 5,5 1g Н71« /ìë в диплоидных клетках легочной ткани плода человека—

6,0 1g 1Щ /мл и в первичной культуре клеток из легкого плода челове= ка — 3,5 1я РЩ, /мл. Эталонный штамм либо не размножается на укаэанных тканевых культурах, либо репродуцируется, но в крайне низких титрах.

Из-за крайне низкой репродукционной активности эталонный штамм вообще . йельзя использовать для серодиагнсстики коронавирусной инфекции.

Предлагаемый штамм отличается достаточной активностью по отношению к антителам человеческих сывороток.

Средние геометрические титры при использовании штамма в реакции нейтрализации (PH) на тканевых культурах колебались в пределах от 4,3 до 13 9 а в реакции связывания комплемента— от 4,0 до 6, 1. Среди обследованных доноров процент серопозитивных лиц к указанному вирусу составляет соответственно 70,5-81,1 в зависимости от методов серологического обследования.

Резистентность к ингибиторам. Промежуточный зариант коронавируса шт.

Lp (Ленинград/1)77 является достаточно чувствительным к широкому спектру ингибиторов сывороток человека и жиBoTHblx. Максимальные показатели индексов ингибиции сывороток варьируют в значительных пределах от 30 до 316?.

Полученный ингибиторорезистентный вариант из популяции ингибиторочувствительного штамма становится реэистентным к неспецифическим ингибитором сывороток человека, морской свинки, лошади, телят и хомяков.

Специфичность диагностического штамма. Специфичность диагностического штамма показана в реакции нейтрализации на тканевых культурах с помощью использования типоспецифических сывороток. Известная сыворотка B pa3 ведении 1:128 ингибирует 100 доз вируса.

Использование ингибиторорезистентного штамма Lp (Ленинград/2)77 коронавируса иллюстрируется следующим примером.

Пример.

Маточный материал вируса Lp (Ленинград/2)77, прошедший контроль на стерильность, специфичность, биологическую активность (инфекционную, цитоксическую) резистентность к неспецифическим ингибиторам сывороток

3

92495 человека и различного вида животных, разводят в 100 раз на поддерживающей среде Игла (рН = 7,2), содержащей антибиотики (пенициллин 200 ед/

/мл, стрептомицин 100 мкг/мл). Объем

5 разведенного вируса составляет 100мл.

Комплемент связывающий антиген вируса готовят в диплоидной культуре клеток легочной ткани плода человека. 10

Матрицы с клеточной культурой (пробы

20, 21, 22) заражают полученным разведением вируса. Доза заражения составляет 10 ИД,/мл. После 2-часового контакта вируса на клетках культу- 1б ру несколько раз промывают фосфатносолевым буферным раствором (рН = 7,2).

Зараженные клетки инкубируют в термостате при температуре 35-36 С в течение 4-5 дней до наступления характер- 2< ных деструктивных изменений клеток.

Вируссодержащий материал подвергают

3-кратному замораживанию и оттаиванию в смеси сухого льда со спиртом.

Собранную жидкость центрифугируют

20 мин при 3000 об/мин для удаления клеточного детрита. Поддерживающая среда при выращивании вируса состоит из среды Игла с добавлением 1Х раствора бычьего альбумина и антибиотиков.

Полученный материал (пробы 20, 21, 22) проверяют на присутствие инфекционного вируса путем титрования возбудителя в диплоидной культуре кле35 ток легочной ткани плода человека при 36 С. В пробах из матрицев 20, 21, 22 инфекционный титр равен 6,0, 5,5,6,0 18 ИДЕо /мл °

Все пробы (NN 20, 21, 22) специфичны, так как нейтрализуются типоспецифической гомологической сывороткой до титра 1: 128. Вирусный материал контролируют на чувствительность к неспецифическим ингибиторам сывороток человека и животных в реакции нейтрализации на .клетках легочной ткани плода человека. С этой целью

10-кратные разведения вируса соединяют с падающими 2-кратными разведения50 ми сывороток (человека, морской свйнки, лошади, телят, хомяков). После

2-х часового контчкта нри комнатной температуре смеси вносят в пробирочные культуры клеток легочной ткани эмбриона человека (ЛЭЧ), которые а культивируют при температуре 36 С.

Ингнбирующую активность сывороток выражают в индексах ингибиции (в

4 антилогарифмах разности титров вируса в опытных и контрольных культурах) .

Все про ы (20, 21, 22) оказались резистентными к ингибиторам сыворо" ток человека и животных, Комплементсвязывающим антигеном вируса служит осветленная вирусосодержащая культуральная жидкость.

Подготовленные и проконтролированные на стерильность, специфичность, биологическую активность и ингибиторезистентность антигены подвергают лиофилизации. Для этого в каждую бутыль, содержащую 100 мл вирусного антигена, добавляют равный объем 137 пентона. Бутыли Р 20, 21, 22 обозначают как серии диагностикума Р 1, 2, 3. Затем каждую серию (по

10 мл антигена) разливают во флаконы емкостью 50 мл: по 20 флаконов каждой серии). Сразу по окончании лиофилизации (продолжительностью 40 ч) флаконы перекрывают резиновыми пробками. Полученный антиген (серии 1, 2, 3) повторно контролируют на стерильность, специфичность, биологическую активность, резистентность к ингибиторам сыворотки человека и животных. Инфекционный титр в готовых диагностикумах серий 1, 2, 3 составляет соответственно 6,0; 5,5; 6,0 1g

ИД /мл. Диагностикумы по всем Указанным вьппе контрольным исследованиям отвечают предъявляемым к ним требованиям.

Предлагаемый штамм имеет высокие показатели репродукционной активности на тканевых культурах различного происхождения и хорошо зарекомендовали себя в качестве антигена для серологической диагностики коронавирусной инфекции. Так, процент серопозитивных лиц по данным исследований составляет от 70,5 до 81,1 в зависимости от метода серологического обследования доноров (в PCK или в реакции нейтрализации на тканевых культурах).

Предлагаемый диагностический штамм отличается достаточной унифицированностью, так как может быть использован для выявления как комплементсвязывающих, так и вируснейтрализующих антител. Штамм характеризуется высокой экономической эффективностьв.

Для получения высокоурожайного вируса с титром 6,0 1g 1Щр>/мл из эталонТехред А. Кравчук Корректор Л. Пилипенко

Редактор Н.Сильнягина

Тираж 655 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам;изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Заказ 6486

Производственно-полиграфическое предприятие, r ужгород, ул. Проектная, 4

5 92495 ного штамма требуется затратить более 200 дней, а для получения аналогичного диагностикума из предлагаемого штамма требуется затратить только

5 дней. Экономический эффект по трудозатратам является 41-кратным, а по расходованию материалов — 21-кратным.

Использование штамма позволит в значительной степени повысить эффек-. тивность диагностики коронавирусной инфекции.