Способ получения антигена вируса иммунодефицита человека 1 типа

 

Изобретение относится к вирусологии, а именно к разработке высокоэффективного способа получения антигена вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Цель - ускорение способа, увеличение выхода антигена, а также снижение риска инфицирования работающего персонала. Клетки штамма ГКВ N 4005 (перевиваемые моноциты человека, хронически инфицированные ВИЧ-1) сокультивируют с перевиваемыми лимфоцитами человека линии МТ-4 в соотношении 1:(1-9). Через 4-5 сут культивирования клетки осаждают и полученной культуральной жидкостью инфицируют клетки МТ-4. На 4-е сутки культивирования инфицированные клетки МТ-4 осаждают центрифугированием, обрабатывают лизирующим буферным раствором и инэктивируют инфекционный вирус. 2 табл. сл С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4827359/13 (22) 21.05.90 (46) 07.03.92. Бюл, N 9 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Научно. производственного обьединения "Вектор" (72) А,Г. Покровский, О.А. Мамаева,. O.А.

Плясунова, Н.Н. Киселев и С.А. Куляндин (53) 576.858(088.8) (56) Заявка FR M 2592893, кл. С 12 N 7/00, 1985.

Заявка РСТ N 85/04897, кл. С 12 К 7/00, 1985, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА. I

ТИПА (57) Изобретение относится к вирусологии, а именно к разработке высокоэффективного

Изобретение относится к вирусологии, биотехнологии, в частности к культивированию вирусов, а именно к разработке высокоэффективного способа получения антигена вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), пригодного для использования в диагностических тест-системах, в частности иммуноферментной, иммуноблотинге. а также для получения инфекционного вируса, иммунизации лабораторных животных и др.

Известен способ получения антигенов

LAV, основанный на культивировании уникал ь ной культуры-.продуцента ви руса, сконструированной на основе перевиваемых Т-4 лимфоцитов человека с помощью сортера клеток. в результате чего была получена культура, максимально обогащенная клетками, имеющими сайты связывания, специфичные для вируса LAV.

„„5U„„1717631 А1 (s>)s С 12 N 7/00, А 61 К 39/21 способа получения антигена вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Цель — ускорение способа. увеличение выхода антигена, а также снижение риска инфицирования работающего персонала, Клетки штамма ГКВ Nò 4005 (перевиваемые моноци. ты человека, хронически инфицированные

ВИЧ-1) сокультивируют с перевиваемыми лимфоцитами человека линии MT-4 в соотношении 1:(1-9), Через 4-5 сут культивирования клетки осаждают и полученной культуральной жидкостью инфицируют клетки MT-4, На 4-е сутки культивирования инфицированные клетки МТ-4 осаждают центрифугированием, обрабатывают лизирующим буферным раствором и инактивируют инфекционный вирус. 2 табл.

Однако второй этап получения антигенов вируса остается традиционным— очистка вируса с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахароэы.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения антигенов ретровируса HTLV-III при культивировании

Т-клеточной линии лимфоцитов человека

НТ, штамм Н9/HTLV-!ИВ, который селектирован по фенотипу зрелых Т-лимфоцитов:

ОКТЗ (62%); ОКТ4 (39%); ОКТ8. и может в течение длительного срока продуцировать вирус HTLV-Ill (ВИЧ-1). Фирмы "Оо Pont", "Abbot" (США) и "Wellcome" (Великобритания) используют для тест-систем высокоочищенный антиген ВИЧ-1, получаемый при культивировании штамма-продуцента

Н9/НТ1 Ч-III ð.

Однако известный способ требует культивирования инфицированных клеток в

1717631 больших объемах, что резко повышает риск инфицирования работающих и требует создания условий с высоким уровнем защиты.

Последующая очистка вируса связана с ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Зто трудоемкая процедура, требующая высококвалифицированного персонала и дорогостоящего оборудования.

Недостатком известного способа является низкая стабильность при культивировании используемого штамма-продуцента, который требует периодического подсева неинфицированных клеток, что приводит к риску вытеснения иэ культуры продуцирующих ВИЧ-1 клеток неинфицированными, а также длительность процесса: по данным иммунофлюоресценции нэ 6-е сутки культивирования доля вируспродуцирующих клеток составляет 32 и только на 14-е сутки достигает 97%. При определении активности обратной транскриптазы (за активность обратной транскриптазы принимают включение радиоактивной метки в импульсах н 1 мл культуральной жидкости) для штамма

Н9/HTLV- IIIB даже к 14-м суткам культивировэ;,ля включение метки не превышает

4,1х i 0 имп/мл.

Целью изобретения является ускорение способа, повышение выхода антигена, а также снижение риска инфицирования работающего персонала.

Поставленная цель достигается использованием обогатительного пассажа на перевиваемых лимфоцитах человека линии

MT-4, которые обеспе .ивэют продуктивный тип инфекции.

Сущность предлагаемого способа заключается в следуют ем.

Клетки штамма-продуцента ВИЧ-1 (штамм ГКВ N 4005) сокультивируют с клетками перевиваемой линии лимфоцитов человека MT-4 в соотношении 1:1 — 1:9 (обогатитель,ый пассаж). Через 4-5 сут культивирования суспензию клеток центрифугируют и культ> ральной жидкостью инфицируют клетки MT-4. После 4 сут культивирования инфицированные клетки

MT-4 осаждают центрифугированием, обраоатывают лизирующим буфером и инактивируют инфекционный вирус. Полученный таким образом лизат клеток может быть использован в кэ .естве антигена в диагностических тест-системах, вчастности таких,,как иммуноферментная и иммуноблотинг.

Пример 1. Сокультивирование клеток

MT-4 с клетками-продуцентами ВИЧ-I.

В роллеоную бутыль, содержащую (4,8-5.4).10 клеток MT-4 приливают (4.8 — 5,4).10 клеток посевной культуры ГКВ

М 4005(т.е. соотношение клеток MT-4 и клеток-продуцентов ВИЧ-1 составляет 1:1).

Примеры использования других соотношений клеток в обогатительном пассаже приводятся в табл. 1. Содержимое роллерной бутыли тщательно перемешивают и разливают по (3,2 — 3,6) 10 клеток в стериль8 ные роллерные бутыли, В каждую бутыль доливают ростовую питательную среду по

300 + 10 мл, Питательную среду для культивирования готовят следующим образом, К

415 2О мл питательной среды RPM1-1640 приливают 75 и 10 мл сыворотки плода коровы, 10 + 1 мл 3%-ного раствора а-глутамина, 1,0+ 0,1 мл 30%-ного раствора линкомицина (или канамицина 100 мкг/мл).

8,0 + 10 мг гентамицина. Засеянные роллерные бутыли инкубируют при 36 — 37 С и частоте вращения 1 — 2 об/мин в течение

4-5 сут.

По окончании инкубации контролирую г уровень вируспродукции иммуноферментным методом. Подготовку образцов для

ИЭА осуществляют, инактивируя ВИЧ-1 добавлением к пробе твина-80 до конечной концентрации 0,1% с последующей инкубэцией при 6 +.2 С не менее 24 ч. Из приготовленных таким образом ыроб готовят ряд последоватежММЬ"двукратных разведений, которые затем вносят попарно по

100 и 1 мкл в лунки сенсибилизированных планшетов тест-системы "Вектор" или

"АЬЬоц", Дальнейшие операции и учет результатов проводят в соответствии с инструкцией по применению тест-системы. За титр вирусного антигена принимают то конечное разведение исходного материала, в котором достоверно выявлялся антиген

ВИЧ-1 (табл. 1), Пример 2. Получение лизата инфицированных ВИЧ-1 клеток МТ-4.

Посевной ВИЧ-1 для, заражения клеток

MT-4 получают следующим образом, На 45-е сутки сокультивирования (пример 1) содержимое роллерных бутылей переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют при 4 - 2 С, частоте вращения 5000 об/мин (4000 g) в течение 10 мин. Полученный супернатант используют далее в качестве по- 0 севного ВИЧ-1.

В роллерную бутыль, содержащую (2;6-2,7) 10 клеток MT-4, приливают

520 -20 мл посевного ВИЧ-1, содержимое бутыли тщательно перемешивают и инкубируют при 36-37 С не менее 1 ч (адсорбция

ВИЧ-1 на клетках МТ-4). По окончании адсорбции суспензию инфицированных клеток рассеивают в роллерные бутыли по

2,0 +é 0,1 10 клеток в бутыль. доливают ро1717631 стовую питательную среду (как в примере 1) до конечного обьема 400 ".20 мл. Засеянные роллеры инкубируют на роллерной установке при 36 — 37 С и частоте вращения

1-2 об/мин в течение 96 «5 ч. 5

По окончании культивирования отбирают пробы культуральной жидкости и клеток и определяют в них титр антигена ВИЧ-1 методом иммуноферментного анализа (по примеру 1), а также оценивают долю вирус- 10 продуцирующих клеток (ВПК) методом непрямой иммунофлюоресценции (НИФ) с сывороткой крови, содержащей антитела к

ВИЧ-1. Кроме того, уровень вируспродукции оценивают по активности обратной 15 транскриптазы (табл. 2).

За активность обратной транскриптазы принимают включение радиоактивной метки в импульсах на 1 мл культуральной жидкости, Культуру клеток MT-4, инфици- 20 рованную ВИЧ-1, переносят в центрифужные стаканы и промывают охлажденным до 6:" 2 С физиологическим раствором (рН

7,4). Осадок промытых клеток ресуспендируют в физиологическом растворе до кон- 25 центрации (2 «- 0.2) 10 кл/мл и добавляют равный обьем лизирующего буфера, охлажденного до (б ": 2) С.

Лизирующий буфер готовят следующим образом. 30

Навеску трис (0,12 "- 0,01 г) растворяют 90 мл физиологического раствора, с помощью соляной кислоты доводят рН до

7.6 «-0,1. К полученному раствору прибавляют 1,0 ":0,1 мл тритона х-100, навески

0,05 0,01 r азида натрия, 0,01 «-0.001 г ингибитора трипсина (фирмы "Sigma" ) и

0,02 «= 0,001 г фенилметилсульфонилфлуорида той же фирмы. После полного растворения обьем доводят до 100 мл. 40

После 10-минутной инкубации при

6 «- 2 С лизированные клетки переносят в центрифужные. пробирки вместимостью

45 мл, уравновешивают и центрифугируют в течение 10 мин при частоте вращения 12000 45

V об/мин и температуре 6 «-2 C (центрифуга (-8, "Beckman", ротор JA-20). Осадок отбрасывают, а к супернатанту приливают этиленимин до конечной концентрации

0,1 — 0,01%. Лизат клеток замораживают, оттаивают, приливают равный обьем буферного раствора А, перемешивают и центрифугируют в роторе JA-20 при частоте вращения 18000 об/мин и температуре

6 «-2 С в течение 15 мин.

Буферный раствор А готовят следующим образом. Навеску трис 0,6 «- 0,05 г растворяют в 90 мл физиологического раствора. доводя рН до 7,4 «-0,1. К полученному раствору прибавляют навески 0,03 «-0,003 г

ЭДТА, 0,1 ":0.01 г дезоксихолата натрия, 0,1 0,01 r додецилсульфата натрия и

1,0:" 0,1 мл тритона х-100. После полного растворения объем раствора доводят до

100 мл.

Предлагаемый способ получения антигена ВИЧ-1 позволяет выделять полноценный вирусный антиген, содержащий полный набор вирусспецифических белков. Кроме того, потери вирусных белков при получении антигена составляют не более 20-30%.

Формула изобретения

Способ получения антигена вируса иммунодефицита человека l типа, включающий культивирование инфицированных клеток на стандартной питательной среде с последующим получением вирусного антигена, отличающийся тем. что, с целью ускорения способа, повышения выхода антигена и снижения риска инфицирования работающего персонала. из клеток используют лимфоидные клетки МТ-4, их инфицирование проводят культуральной жидкостью, полученной в результате совместного культивирования клеток МТ-4 с перевиваемыми моноцитами человека штамма

ГКВ % 4005, взятых в соотношении 1:(1-9) в течение 4 — 5 сут, э антиген готовят через 4 сут культивирования лизированием клеток.

Таблица 1

i 717631

Таблица 2

Составитель А.Покровский

Редактор И,Дербак Техред М.Моргентал Корректор Т.Малец

Заказ 853 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Рауаская наб., 4/5

Г!роизводственно-издательский комбинат "Патент". r, Ужгород, ул,Гагарина, 101