Способ определения нарушения функционального состояния мембран кардиомиоцитов
Использование: экспериментальная медицина . Сущность изобретения: In vitro регестрируют изменения активности мембраносоязанной Na, К, АТФазы, для чего сначала определяют исходную трансмембранную разность потенциалов кардиомиоцитов в питательной среде при температуре , оптимальной для жизнедеятельности преперата; затем hpenapaf помещают в аналогичную питательную среду с температурой 3-4°С, инкубируют в ней в течение 90± 5 мин. Повторно измеряют трансмембранную разность потенциалов, после чего препарат возвращают в исходные условия перфузии, регистрируют динамику восстановления трансмембранной разности потенциалов , по которой устанавливают величину и время ее полумаксимального восстановления. Рассчитывают скорость восстановления трансмембранной разности потенциалов и по ней определяют состояние нарушения функции мембраны кардиомицитов.
,, Ж„„1749832 А1
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (st)s G 01 N 33/483
У770B
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ кардиомицитов, »»
° »
»»
ЪФ
Изобретение относится к эксперимен- фракцию мембран инкубирувт с субстратом тальной медицине и может быть использо- (Ат©) и исследуют фотоколлориметрически вано для выявления нарушений и активность Na, К, АТФаэы. По накоплению повреждениймембранкардиомиоцитовпОд: неорганического фосфата, который являетдействием экстремальных факторов, а так- ся продуктом гидролиэа АТФ, судят об ак- Q жескринингефармакологическихпрепара- тивности мембраносвяэанного фермента, QO тов, - ..: .: снижение которото является показателем ()
Известен способ оценки функционал - . нарушения функционального состояния ного состоямия мембран кардиомиоцитов, мембран. основанная на комплексном исследавании, Наиболее близким является способ реа имвнно вмявлении нарушений структуры " гистрации активности и термоийактивации сарколеммы, определении активностй мем- Иа, К, AT©ççû. При этом миокардиальную браносвязайной йа, К. АТФазы, а также йа- ткань дваждй гомогенизируют, гомогенат руеенйи результатов их деятвльноетй. — - фильтруют и суспендируют в среде, содернакоплейия Са в цитозоле кардйомицитов. жащей 20 мм имидвэола, 20 мм пирофосфаДля этого навеску кани Миокарда гочоГ6 N натрия, 1 мм ЭДТА и имеющей рН 7,8 и зируат для выделения с®рколеммальной темпера ру 4 С. Осадок промывают, осажфракции фермента, гомогенаты подвергаВТ дают и суспендируют в среде хранения. дадиференциальному центрифугированию, лее-оценивают N8, К. АТФазную активность (21) 4777067! 14 (22) 02.01.90 (46) 23.07.92, Бюл. Й 27 (71) Иркутский государственный медицинский йнститут (72) И.Л.Ясинский, Ф.З.Меерсон и В.В.Малышев . (56) Бюлл. эксп. биол., 1986, т. Hl, N. 12, с, 685-687. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАРУШЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ
МЕМЬРАН КАРДИОМИОЦИТОВ (57) Использование: экспериментальная медицина. Сущность изобретения: In vitrо регестрируют . изменения активности мембраносвязанной Na, К, АТФазы, для чего сначала определяют исходную трансмембранную разность потенциалов кардиомиоцитов в питательной среде при температуре, оптимальной для жизнедеятельности йреперата; затем препарат Мййещают в аналогичную питательную среду с температурой 3-4 С, инкубируют в ней в течение 90+
5 мин. Повторно измеряют трансмембранную разность потенциалов, после чего пре парат возвращают в исходные условия перфузии, регистрируют ди»йамику восстановления трвнсмембранной разности потенциалов; по которой устанавливают величину и время ее полумаксймального восстановления. Рассчитывают скорость восстановления трансмембраййой разности потенциалов и по ней опоеделяют состояние нарушенйя функции мембраны 3
1749832 опытных и контрольных образцов. Оценку функционального состояния мембран пр0 водят путем регистрации изменений активности Na, К, АТФазы в результате определения кинетики ее термоинактива- 5 ции. Для этого по мере инкубации мембраносвязаиного фермента при 52ОС в течение 2 ч исследуют активность N3, К, АТФаэы. Возрастание скорости термоинактивации в опытных пробах, по сравнению с контролем, 10 свидетельствуют о повреждении мембраносвязанного фермента и, следовательно, о нарушении функционального состояния мембран кардиомиоцитов. Однако данная методика неспособна оценить ФС мембран, 15 изменение которого может реализоваться при воздействиях без нарушения конфор-мационной стабильности фермента и изменений кинетики его термоинактивации, Целью изобретения является повыше- 20 ние тонкости способа и его упрощение, Для этого сначала определяют исходную трансмембраниую разность потенциа- лов кардиомиоцитов в питательной среде при температуре 32 С вЂ” оптимальной для 25 жизнедеятельности препарата 1n vitro. Затем препарат помещают в среду с t 3-4 С, инкубируют и повторно измеряют траисмембранную разность потенциалов, Далее препарат возвращают в исходные условия 30 жизнедеятельности и регистрируют динамику восстановления трансмембранной разности потенциалов, по которой устанавливают величину и время ее полумаксимального восстановления; Скорость 35 определяют по формуле
Л.е
Ф где Ь е — изменение трэисмембранного потенциала ээ время; 40 — время, в течение которого наступает полумзксимальное восстановление потенциала.
Оценку функционального состояния мембран кардиомиоцитов проводят по от- 45 ношению скорости полуйексймального восстановления опытного к контрольному препарату и при значении полученного отношения.< 1,0, определяют нарушение функционального состояния мембран 50 кардиомиоцитов,::
П р им е р. Обьектомоцеики ФСмембрзн кардиомиоцйтов являетсю препарат папиллярной мышцы, выдвленйый из левого желудочка сердца крысы. Крысу нзркотизи- 55 руют, сердце извлекают. i папиллярную мышцу препарируют в охлажденном до 34 С растворе Кребсэ-Хеизелвйта. Для осуществления способа используют мыацы с диаметром 0,5-6,7 мм и длиной не менее 5 мм, Препарат помещают в кювету, через которую протекает со скоростью 25-30 мл/мин. раствор Кребса-Хензелейта, имеющий состав, мм: NaO 118; КО 4,8, СаС! 1,6;
КН2РО< 1.2; MgSO42.4; йаНСОз 25,2; глюкоза 11,0. Раствор оксигенируют смесью Ог—
95$ и СОг — 5$ до насыщения его Ог 500—
550 мм рт.ст. и установления рН 7,35. Раствор подают в термостатированную при 32+
0.1 С кювету, à его избыток возвращают в оксигенератар с помсицью непрерывно работающего перистальтического насоса.
Фиксированную в кювете папиллярную мышцу, стимулируют иадпороговыми прямоугольными импульсами с частотой 1 Гц.
После стабилизации деятельности препарата в течение 15 мин осуществляют проведе-. ние способа.
Для отведения трансмембранной разности потенциалов используют метод микроэлектродной техники и стеклянные микроэлектроды с диаметром кончика не более 0,5 мкм и собственным сопротивлением 20-30 мОм. Трансмембранные потенциалы подавали нэ вход усилителя постоянного .тока с входным сопротивлением около 20
ГОм и далее на осциллограф.
Трансмебрэиный потенциал регистрируют до холодовой инкубации при температуре 32 С, в конце холодовой инкубации кзрдиомиоцитов при 3-4ОС и далее непрерывно при реперфуэии препаратов в питательной среде с температурой 32 С. По результатам их измерений строят кривую динамики восстановления Е, рассчитывают скорость вго пояумаксимэльиого восстановления и вычисляют Е 1!2и кс, т.е., если Емин
- 68 мВ, Емакс 10 м8, то Е 1/2макс
Ецио + Ем 85 5 В.
Далее относительно величины Е 1/2 c на оси абсцисс графика определяют границы интервала времени t - 0,5 мии, откладывают перпендикуляр нэ крйвую грэфмка, а от границ выделенного участка кривой— перпеидикуляры иэ жь ординат. то отрезок на оси ординат составит Ье за время t. 8 случае, ecw Ла будет равна 12 мВ, то скорость полумэксимзльного восстановления
Ем аостэвйт:
У- Яи-24 мВ/мин.
Велйчинз в Е, полученная по кривой переходного процесса восстановления Е отра.жает данный napaseesp у интактных кардиомиоцитов (контроль).
После 5 ч стресса, рассчитанные аналогичным способом переходные параметры восстановления. составляют
1749832
Составитель С.Рябов
Техред М. Моргентэл
Редактор М.Блзнар
Корректор М.лароши
Заказ 2593 . Тираж . . Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101
Енин 38 мВ; Емакс - 69 мВ; Е 1/2макс
53,5 мВ: Е за 0,5 мин - 1,5 мВ. тогда V
9 мВ/мин, 4,5
0,5
Для расчета ИФСИ вычисляют отноае- 5
we величины Ч, е (9 мВ/мин) опытного препарата к ее значению в контроле (24 м8/мин), т.е. с — — — у контрольного 24 10
Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить точность определения нарушения функционального состояния мембран кардиомиоцитов. Способ прост, тэк кзк в принципе основан на одном при- 15 еме —. измерении Е в течение 1,5 — 5 мин, Предлагаемый способ может быть широкоиспользован и практике экспериментальных исследований нарушений функционального состояния мембран кардиомиоцитов. з 20 именно изучении патогенеза повреждений и нарушений деятельности мембран кардиомиоцитов, разработки способов профилакти"ки заболеваний сердечно-сосудистой системы, сопровождающихся нарушениями 25 и повреждениями мембран кардиомиоцитов. в поиске эффективных медикаментозных средств, предупреждающих эти нарушения, а также скрининге фармакологических пре30 паратов, для выявления и оценки их влияний на мембрану и мембраносвязанную Ма, К, АТФазу кардиомиоцитов.
Формула изобретения
Способ определения нарушения функционального состояния мембран кзрдиомиоцитов путем регистрации изменения активности мембрзносвязанного фермента, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа и его упрощения, регистрируют трэнсмембранный потенциал кардиомиоцитов йри 32 С, затем охлаждают препарат до 3-4 С, инкубируют его, вновь измеряют потенциал, возвращают препарат в исходные условия, регистрируют динамику восстановления потенциала, рассчитывают величину скорости v его полумэксимального восстановления по формуле ч- Ье/t, где Ье — изменение трансмембранного гютенцизла за время Ф;, т — время, в течение которого наступает полумзксимзльное восстановление потенциала, затем рассчитывают отношение полученного показателя к таковому в контроле и при значении полученного отношения менее 1,0 определяют нарушение функционального состояния мембран кзрдиомиоцитов.
