Способ обнаружения и определения мочевины в кормовых дрожжах

 

Использование; ветеринария, химикотоксикологические и госконтрольные ветеринарные исследования. Сущность изобретения: проводят очистку экстракта из пробы дрожжей гидроокисью меди, постановку реакции в смеси серной и орто-фосфорной кислот по объему 25 и 10% соответственно, содержащей 100 мг% диметилглиоксима. Для расширения предела прямолинейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией мочевины при определении массовой доли мочевины постановку реакции проводят в указанной смеси, дополнительно содержащей 8-10 мг% тиосемикарбазида. 1 з.п.флы, 2 табл. ч-Ё

союз соВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (sijs G 01 N 33/48

5,$ 1Pu,ф

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ьвьк тФ .б " «;. г 1 . иК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ. (21) 4790617/13 (22) 09.02.90 (46) 30.07.92.Бюл. N. 28 (71) Восточно-Сибирская зональная научноконтрольная лаборатория (72) 3.Г.Олейник (56) Определение мочевины в сыворотке крови и моче по цветной реакции с диацетилмонооксимом. Унифицированные клинические лабораторные методы иссле-. довании. — Лабораторное дело, 1974, N. 2, с. 124 — 125, Храмов В,А. и др. Вопросы мед. химйи, 1969, В. 4, с. 435, Гуторанов В. Лабораторное дело, 1982, N. 10, с. 29.

Изобретение относится к ветеринарной лабораторной практике, а именно к химикотоксикологическим и госконтрольным ветеринарным исследованиям, и может быть использовано также в микробиологической промышленности при производстве кормовых дрожжей.

Кормовой микробный белок производится на основе комплексной химической и микробиологической переработки целлюлозосодержащего растительного сырья. В соответствии с действующей нормативно-технической документацией содержание белка. (протеина) определяется по общему азоту, что создает возможность фальсификации по протеину выпускаемой продукции путем введения мочевины на заключительной стадии производства.

„„Я „„1751675 А1 (54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЧЕВИНЦ В КОРМОВЫХДРОЖЖАХ (57) Использование; ветеринария, химикотоксикологические и госконтрольные ветеринарные исследования. Сущность изобретения; проводят очистку экстракта из пробы дрожжей гидроокисью меди, постановку реакции в смеси серной и орто-фосфорной кислот по объему 25 и 10Д соответственно, содержащей 100 мг, диметилглиоксима. Для расширения предела. прямолинейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией мочевины при определении массовой доли мочевины постановку реакции проводят в указанной смеси, дополнительно содержащей 8 — 10 мг% тиосемикарбазида. 1 з,п.флы, 2 табл.

Кормовые дрожжи содержат много трудноустранимых пйггментов,- липидов, белков и других мешающих определению веществ, а используемые при определении мочевины способы депротеинизации биологических жидкостей для исследования О дрожжей не пригодны;

Для определения содержания мочеви- (, П ни в биологических жидкостях Гкровь, ллвзма и сыворотка крови, моча) применяют уреазный и диацетилионооксимовый ЦЯ° ге@

MO) несложные и быстрые методы . Особенно широко используют унифицированный метод определения мочевины по цветной реакции с ДАМО, Однако для надлежащей очистки экстрактов из кормовых дрожжей и получения высокоочищенных фильтратов не пригодны условия и реагенты (трихлоруксусная или

1751675

15

20 сульфаниловая кислота), широко применяемые для очистки (депротеиниэации) биологических жидкостей. Экстракты иэ кормовых дрожжей подлежат не только депротеиниэации, но и депигментации, что требует применения более жестких условий их осуществлени с использованием других реагентов, которые, в свою очередь, делают невозможной постановку ДАМО реакции из-за высокой интерференции и низкой чувствительности, Известен также способ определения мочевины в биологических обьектах с использованием диметилглиоксима (ДМГ), в котором, используя малоизвестную тиосемикарбазидную (TCK) модификацию реакции Фирона, В,А.Храмов и др. вместо ДАМО (2,3-бутандионмонооксим), в качестве реактива на никель применяют ДМГ (2,3-бутанметилглиоксим, диацетилдиоксим), а в качестве реактивной смеси — 25%-ный раствор серной кислоты, Однако указанный способ имеет малый диапазон линейной зависимости между оптической плотностью цветной реакции и концентрацией мочевины в реакции, большую лабильность реакции от условий ее выполнения, высокую интерференцию и низкую чувствительность; а условия фотометрии не оптимальны, Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является диметилглиоксимовый методопределения содержания мочевины в биологических жидкостях, включающий депротеинизацию, центрифугирование (фильтрование), прибавление к центрифугату катализатор-кислотной смеси и раствор

ДМГ, перемешивание; нагревание в кипящей водяной бане, охлаждение, постановку эталонной пробы со стандартным раствором мочевины, измерения оптических плотностей при 510-550 нм в 10 мм кювете против контроля на реактивы и вычисление результатов по порции.

Недостатком известного способа является то, что мягкие условия депротеинизации, а тем более с использованием 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУК), не обеспечивает необходимой степени депигментации и депротеинизации экстракта из навески кормовых дрожжей с получение высокоочищенных от мешающих определению веществ фильтратов (центрифугатов).

Диапазон линейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией мочевины ограничен, Способу присущи высокая интерференция, низкая специфичность и, особенно, чувствительность реакции.

Также отсутствуют методы обнаружения и

55 полуколи ественно о определения мочевины, которые исключали бы необходимость определения в случае ее отсутствия, а при наличии ее давали бы возможность правильно выбрать концентрацию стандартного (рабочего) раствора мочевины для подстановки эталонной пробы (реакции).

Целью изобретения является увеличение чувствительности способа определения мочевины.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу проводят очистку (депигментацию и депротеинизацию) экстракта из пробы дрожжей гидроокисью меди, постановку реакции в смеси серной и арто-фосфорной кислот по объему 25 и 10% соответственно, содержащей 100 мг % диметилглиоксима, а фотометрию — при 490 нм (при обнаружении). Для расширения предела прямолинейной зависимости между onтической плотностью и концентрацией при определении массовой доли мочевины постановку реакции проводят в смеси указанных кислот с диметилглиоксимом, дополнительно содержащей 8-10 мг% тиосемикарбазида, а фотометрию — при 540 нм.

Сущность способа состоит в том, что мочевина в сильнокислой среде с диметилглиоксимом образует желтый комплекс, а при дополнительном присутствии тиосемикарбаэида — красный комплекс, которые фотометрируют при 490 и 540 нм соответственно.

Для полуколичаственного определения и повышения достоверности результатов обнаружения за счет исключения влияния на результаты измерения возможной остаточной интерференции на нижней границе чувствительности, наряду с полноценной ставят неполноценную реакцию (беэ ДМГ), с последующей фотометрией при 490 нм (Д !. В положительных случаях вычисля490 ют полуколичественное содержание мочевины в дрожжах по полученным значениям оптических плотностей, используя выведенные экспериментальным путем коэффициенты (например, 2,9 для навески пробы 0,5 г и 3,6 для навески 1 r). B сомнительных случаях обнаружения вычисляют соотношение значений полученных величин оптических плотностей полноценной и неполноценной реакций (Д :Др . кото490, 490 рые при отсутствии мочевины в пробе менее

3,7 для навески 0,5 г и менее 4,1 для навески дрожжей 1,0 г.

При определении массовой доли ставят эталонную пробу с концентрацией мочевины в стандартном растворе. близкой к массовой доле исследуемого вещества в исследуемой пробе (по результатам полуко1751675 личественного вычисления), а вычисление проводят по принципу пропорций.

Предлагаемый способ отличается от известного методом депротеиниэации с одновременной депигментацией с исполь- 5 зованием гидрата окиси меди. составом реакционной смеси как по концентрациям кислот, ТСК и ДМГ, так и по составу (отсутствие железа хлорного), увеличением предела линейной завйсимости между 10 оптической плотностью и концентрацией мочевины, уменьшением времени экспозиции в кипящей водяной бане, максимальной приближенностью концентрации эталонного раствора к исследуемой пробе. Кроме 15 того, предлагаемому способу присущи качественное определение (обнаружение) мочевины, в котором возможное влияние интерференции на результаты исследова- ния учитывается путем постановки реакции 20 на пробу без ДМГ, измерения оптической плотности и вычисления соотношения оптических плотностей полноценной и неполноценно реакцией, а также полуколичественное вычисление мочевины по изме- 25 ренной оптической плотности и выводимым экспериментальным путем коэффициентам.

Пример, Получение экстракта (вытяжки), Навеску пробы массой 0,5 или 1,0 г взвешивают с погрешностью не более 0,002 r, 30 помещают в фарфоровую ступку и тщательно растирают пестиком в течение 2 — 3-х мин.

Приливают 1-2 см воды и продолжают расз тирать 2 — 3 мин. Затем приливают 8 — 10 см дистиллированной воды и с помощью пес- 35 тика смывают растертую массу с поверхности ступки и пестика. без потерь суспензию переносят в химический стакан вместимостью 150 — 200 см . Остатки суспензии из з ступки трижды смывают по 10 см воды в 40 стакан, Суспензию в стакане оставляют стоять при периодическом перемешивании и комнатной температуры в течении 5 — 10 ч или в холодильнике до следующего дня, Депротеинизация, депигментации экс- 45 тракта и получение фильтрата.

Суспензию (экстракт) пробы хорошо перемешивают, приливают 25 см 6 -ного раствора меди сульфата, перемешивают, оставляют стоять 5 — 10 мин, Затем прилива- 50 ют 25 см 1,25 -ного раствора гидроокиси з натрия, перемешивают, оставляют стоять

2-3 мин, повторно перемешивают, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см,. доводят содержимое колбы водой до метки, 55 перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр..

Затем проводят доочистку полученного фильтрата, Для этого к фильтрату при постоянном перемешивании стеклянной палочкой приливают по каплям 33-40 -ный раствор гидроокиси натрия до рН 9,0-10,0.

Выпавший осадок меди гидроокиси отфильтровывают через плотный бумажный фильтр, а доочищенный фильтрат подкисляют серной или смесью серной и орто-фосфорной кислот до исчезновения голубого оттенка.

Обнаружение и полуколичественное определение мочевины.

Для проведения испытания применяют колориметр фотоэлектрический КФК вЂ” 2, ФЭК-56 или другого типа с наличием светофильтров с максимумом пропускания 490 и

540 нм; смесь кислот (серной концентрированной — 25 см, орто-фосфорной — 10 см, з воды дистиллированной — 53 см; смесь рез, активов; к 88 см смеси кислот приливают 10 з см 1 -ного раствора диметилглиоксима з (ДМГ) на 96 -ном этаноле, перемешивают и при необходимости, спустя 5 — 10 мин фильтруют через стеклянный пористый фильтр (используют в день приготовления).

Проведение обнаружения.

В четыре пенициллиновых флакона вносят по 1 см доочищенного фильтрата проз бы, в два из которых приливают по 4,5 см смеси Реактивов с ДМГ, à B два других — по

4,5 см смеси кислот (без ДМГ). Флаконы закрывают резиновыми пенициллиновыми пробками, хорошо перемешивают содержимое и вместе со штативом ставят. в кипящую водяную баню (стерилизатор электрический) на 40 мин. Для уменьшения испарения содержимого флакойов пробки сверху покрывают слоем полиэтиленовой пленки,. затем поролоном (1,0 — 1,5 см толщиной) и металлической пластинкой (крышкой стерилизатора) с грузом.

После нагревания пробы немедленно охлаждают в холодной воде, содержимое флаконов повторно хорошо перемешивают.

Измерение оптических плотностей каждой реакции проводят при 490 нм в 10 мм кювете против воды. Получают 01 оптическую плотность исследуемой (пд4ноценной) реакции и Dz — оптическую плотность неполноценной (без ДМГ) реакции..Учет качественной реакции.

За положительную реакцию на мочевину принимают наличие желтой окраски, интенсивность которой четко превышает интенсивность окраски неполноценной, В сомнительных случаях вычисляют соотношение значений измеренных величин оптических плотностей. При отсутствии мочевины, когда Д1.:Д2 составляет менее

490, 490

3,7 для навески 0,5 r и 4,1 для навески 1,0, 1751675 дальнейшая количественная оценка и определение мочевины не требуются.

Вычисление полуколичественное, По величинам значения оптических плотностей (д1 и д2 0), используя предлагаемые соответствующие коэффициенты (2,9для навески около 0,5 r и 3,6 для навески около 1 г), вычисляют значение величины предполагаемой (возможной) оптической плотности, которая характеризует интерференцию при 490 нм. Затем вычисляют разницу между фактически полученной Д1 и установленной путем вычисления величиной возможной (предполагаемой) оптической плотности.. Полученный результат указывает на полуколичественное содержание.(Х, ) мочевины в пробе.

Например, при массе навески пробы дрожжей кормовых 0,5 г, общем объеме доочищенного f ильтрата 100 см", Д1" =0,110, Д2 =0,024. Тогда 0,024 2,9=0,0692— предполагаемая оптическая плотность за счет интерференции; 0,110-0,692=-0,04 г— содержание мочевины в 100 r дрожжей, т.е, 0,04 мочевины в кормовых дрожжах(фактическое содержание 0,05%).

Определение массовой доли мочевины, Для проведения испытания применяют смесь реактивов: к 88 см смеси кислот приз ливают 2 см 0,4 -ного раствора тиосемиз карбазидной (ТСК) и 10 см 1 -ного раствора ДМГ на 96О-ном этаноле; основной стандартный раствор мочевины с содержанием 100 мг/100 см, Рабочий исходный з стандартный раствор мочевины готовят путем разведения основного в 20 Раз (5 смз основного и 95 см воды), в 1 см которого з содержится 50 мкг мочевины. Другие рабочие стандартные растворы мочевины romвят путем разведения исходного:

В табл, 1 приведены стандартные растворы.

При необходимости доочищенный фильтрат дополнительно разбавляют водой в 2 раза (при навеске 0,5 г будзет соответствовать общему объему 200 см или соотношению 1:400).

Проведение испытания, В два пенициллиновых флакона вносят по 1 см дистиллированной воды, в два флакона — по 1 см фильтрата пробы и в два з флакона — по 1 см рабочего стандартного з раствора. Содержание мочевины в рабочем растворе должно быть близким к определяемой в пробе массовой долей мочевины, предварительно обнаруженной полуколичественным способом (например, 0,04 ).

Во все флаконы приливают по 4,5 см смеси реактивов (смесь кислот, ТСК и ДМГ), флаконы закрывают резиновыми пробками

Х О

2 llî

Д

20 где Д1 — оптическая плотность искомой массовой доли мочевины;.

Д2 — оптическая плотность известной массовой доли мочевины;

25 С вЂ” массовая доля мочевины в пробе, соответствующая известной оптической плотности (Д2),, До — оптическая плотность реакции на реактивы (реакции с водой).

30 Пример вычисления:

Оптическая плотность реакции на реактивы (реакции с 1 см воды): Д =0,129;

Др=0,131, Оптическая плотность реакции на пробу

35 (реакции с 1 см фильтрата пробы): Д1=0,203 з и Д1=0,207, Оптическая плотность реакции с рабочим стандартным раствором (реакции с 1 з см рабочего стандартного раствора, соот40 ветствующего 0,04 мочевины): Д2=0,214 и, Д2=0,216.

Тогда 0,04 0,074 0,04

0 086

45 х, 0,04 0,076 0,04

0.216 — 0,131 0.086 х, о

50 Среднеарифметическое — 0,0353 .

За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое результатов двух параллельных определений.

Результаты исследования во времени (6

55 дней) проб KopMQBblx дрожжей без и с точными добавками мочевины на пределе чувствительности (0,01 и 0,02 ) способа приведены в табл, 2.

Из табл. 2 видно, что способу-прототипу присущи высокая интерференция и низкая с отверсзиями для выравнивания давления, хорошо перемешивают содержимое и вместе со штативом ставят в кипящую водяную баню (стерилизатор электрический) на 20

5 мин (точно), В водяной бане пробки сверху покрывают полиэтиленовой пленкой, затем поролоном (1-1,5 см толщиной) и металлической пластинкой (крышкой) с грузом. После нагревания пробы сразу же охлаждают

10 в холодной воде, содержимое флаконов перемешивают. Измерения оптических плот- ° настей каждой реакции проводят при 540 нм в 10 мм кювете против воды.

Обработка результатов.

15 Массовую долю мочевины (Х, %) вычисляют по формуле

1751675

Таблица 1

Массовая оля мочевины в иссле емой и обе, Номер стандартного раствора

Концентрация мочевины в стандартном рабочем растворе, мкг/см и и объеме экст акта 100 см из навески 1 0 г из навески 0.5 r. при объеме экстракта 200 см иэ навески

0,5 r

0,50

0,25

0,125

0,05

0,025

0.0125

1,00

0,50

0,25

0,10

0,05

0,025

2,00

1,00

0,50

0,20

0,10

0,05

- 50,0

25,0

12,5

5,00

2,50

1,25

2

4

6 чувствительность, Предлагаемый способ характеризуется малой степенью разброса(5), высокой сходим ость ю (Sx), существенностью разницы (() и достоверностью (р<

<0,0001), Коэффициент вариации (V,.$) ха- 5 рактеризует высокую воспрбизводимость предлагаемого способа по сравнению с прототипом, что указывает на относительно низкий разброс результатов (чем меньше, V

, тем выше воспроиэводимость и сходи- 10 мость результатов исследования).

Чувствительность способа, характеризующая способностью выявлять наименьшее различие между двумя концентрациями (массовыми долями) исследуемого вещест- 15 ва, согласно данным табл, 2, характеризуется высокой величиной отношения разности между результатами определения к разности измеряемых концентраций (ЛД: ЛС), где ЛД вЂ” показатель прибора (оптическая 20 плотность); Л С вЂ” массовая доля (концентрация) определяемого вещества. На высокую чувствительность также указывает показатель минимальной концентрации (CM», определяемой по Браунсберг-Джамесу. 25

В высокобелковых и интенсивно окрашенных кормовых дрожжах чувствительность предлагаемого способа определения мочевины высокая (нижняя граница чувствительности 0,01 г/100 r, минимальная чув- 30 ствительность по Браунсберг-Джамесу

S; vn =0.0065 — 0,0085, по. ЛД: ЛС=0,87) при навеске дрожжей 1 г, общем объеме экстракта 100 смз, депротеинизации и депигментации гидроокисью меди, доочистке 35 фильтрата, 0,5 — 1 см фильтрата в Q,5 см реакционной смеси, типе аппарата ФЭК56М или КФК-2 (светофильтр 540 нм), толщине рабочего слоя кюветы 1 см, диапазоне линейной зависимости 0,5 — 50 мкг.. 40

Преимущества предлагаемого способа состоят также в том, что использован доступный дешевый реактив (ДМГ) отечественного производства. Стабильность развившейся цветной реакции позволяет выполнять анализы большими сериями, а простота постановки реакции дает возможность использовать ее в автоматическйх анализаторах.

Предлагаемый способ обнаружения и определения мочевины в кормовых дрожжах может быть использован в ветеринарной лабораторной практике при химико-токсикологическйх и госконтрольных исследованиях, а также в микробиологической промышленности для интенсификации производства кормовых дрожжей.

Формула изобретения

1, Способ обнаружения и определения мочевины в кормовых дрожжах путем получения экстракта, его очистки, постановки реакции при нагревании в смеси серной и орто-фосфорной кислот, содержащем диметилглиоксим, и фотометрии, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью увеличения чувствительности, очистку экстракта проводят гидроокисью меди, а содержание серной и орто-фосфорной кислот по объему составляет 25 и 10 соответственно при содержании

100 мг,ъ диметилглиоксима, а фотометрию проводят при 490 и 540 нм.

2. Способ по и. 1, о тл и ч а ю щи и с я тем, что, с целью определения массовой доли,и расширения предела прямолинейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией мочевины, смесь дополнительно содержит 8 — 10 мг тиосемикарбазида.

1751675

Таблице 2

Статистические данные по оптической плотности (Д!) и массоеой доле мочееины, г/100 г(5,5 см реакционной смеси 1 см вытлжки 1:100. фотомстрнч в см кювете при 540 нм).

Дрожжи с добавкой 0,01 $-ной мочееины

Пробы сдобвекой 0,02 $-ной мочееины

Статистические поквэвтели

Холоствл реакции нв и об ожжей по прото- no предлвтипу. Д Гвемому способу. Д по прототипу по предлагаемому и о по прототипу по предлагаемому п мвс.долк мвс.долл мвс.доле мвс.долл

0.1576

0,210 18

0.1489!

О

0.0096

0,222.

16

21

0,1867

0,0196

О

0,1061 0.0051

0.0250 0.0012

О

3.4

Составитель З.Олейник

Техред М,Моргентал Корректор Т.Вашкович

Редактор А.Лежнина

Заказ 2688 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно. издательский комбинат "патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

P

ЬД: dC

Снчн м 5: Vn

16

0.219 интерфер.

0.0933

0.0220

0.27

0.1

42,6

0,0059

0.0061

0,0013

5.03

0,0001

3,87

0,87

0,0065

0,0009

0,0002

32.0

0,0001

9,37

0,0064 .

0,1222

0,0288

0.10

0.1.

55,0

0,0029

0.0064

0,0014

4,76

0,0001

3.84

0,89

0,0067

0.0014

О 0003

28.3

0,0001 .

7.07

0,0085