Способ получения 4 @ -дезокси-13(s)-дигидро-4 @ - йододоксорубицина

 

Использование: микробиологическая промышленность, производство антибиотиков . Сущность изобретения: для получения 4 -дезокси-13(5)-дигидро-4 -йододоксоруби цина используют штамм Streptomyces peucetlus DSM 2444. Последний выращивают при 27-30°С в течение 3-5 дней в жидкой питательной среде, содержащей источники азота и углерода и минеральные соли, в присутствии 4 -диокси 4 йододоксиоу5ицина в форме его хлоргидрата в конечной концентрации 0,1 мг/мл среды. Полученнуо культуральную жидкость разделяют, и отделенный мицелий экстрагируют ацетоном. Жидкую фазу экстрагируют смесью дихлорметана и метанола в объемном соотношении 9:1 при рН 8 0. Полученные экстракты объединяют и концентрируют при пониженном давлении до сухого состояния. Затем концентрат растворяют в дихлорметане и хроматографируют на колонке из силикагеля, забуференного до рН 7,0. Целевой продукт элюируют последовательно смесью дихлорметана , метанола и воды при объемном соотношении 95:5:0,25 л 90:10:0,5. Второй элюат концентрируют в присутствии Н-пропанола, выделяют целевой продукт и переводят в форму его хлоргидрата. 1 з.п. ф-лы, 2 табл. «« Р.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

К ПАТЕНТУ

О OH О

0Н (3

NH2 (1) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4356221/13 (22) 15,07,88 (46) 07,09,92. Бюл. t4 33 (71) Фармиталиа Карло Эрба С.р.л. (IT) (72) Джузеппе Каззинелли, Тереза Бордони, Серджо Мерли и Джованни Ривола (Щ (56) Аналогов в патентной и научно-технической литературе не выявлено. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 4 -ДЕЗОКСИ13(S)-ДИГИДРО-4 -ЙОДОДОКСОРУБИ ЦИ

НА (57) Использование: микробиологическая промышленность, производство антибиотиков. Сущность изобретения: для получения

4 -дезокси-13(S)-дигидро-4 -йододоксоруби цина используют штамм Streptomyces

peucetIus DSM 2444. Последний выращивают при 27 — 30 С в течение 3 — 5 дней в жидкой питательной среде, содержащей источники азота и углерода и минеральные соли, в приИзобретение относится к микробиологической промышленности, в частности производству антибиотиков.

Для осуществления способа используют штамм Streptomyces peucetlus M 87 F.1.

Штамм получен селекцией путем воздействия на исходный штамм S. peucetlus подвида aureus АТСС 31428 нитрозогуанидином.

Штамм зарегистрирован под каталожным номером DSM 2444 в немецкой коллекции микроорганизмов, Западная Германия.

Штамм применяют для стереоселективного восстановления функциональной группы кетона в 13-положении 4 -дезокси-4

-йододоксорубицина:

„„ЯЦ „„1760986 А3 (я)ю С 12 P 1/06//(С 12 Р 1/06, С 12 R 1:465) сутствии 4 -диокси-4 -йододоксирубицина в форме его хлоргидрата в конечной концентрации 0,1 мг/мл среды. Полученную культуральную жидкость разделяют, и отдавленный мицелий экстрагируют ацетоном. Жидкую фазу экстрагируют смесью дихлорметана и метанола в обьемном соотношении 9:1 при рН 8.0. Полученные экстракты объединяют и концентрируют при пониженном давлении до сухого состояния. Затем концентрат растворяют в дихлорметане и хроматографируют нэ колонке из силикагеля, забуференного до рН 7,0. Целевой прсдукт элюируют последовательно смесью дихлорметана, метанола и воды при объемном соотношении 95:5:0,25 и 90:10:0,5. Второй элюат концентрируют в присутствии Н-пропанола, выделяют целевой продукт и переводят в форму его хлоргидрата, 1 з.п. ф-лы, 2 табл, с получением специфически 4 -дезокси-13(S)-дигидро-4 -йодоксорубицина, одного из

1760986 динение FCE 24883 (II) вместе с соединением (I) и небольшими количествами других продуктов разложения.

Органический экстракт концентрируют при пониженном давлении досуха и остаток 5 растворяют в дихлорметане и хроматографируют на колонке силикагеля, стабилизированного буфером с рН 7,0, градиентом смеси дихлорметан-метанол-вода. Соединение (I) вымывают первым смесью в отно- 10 шении 95;5:0,25, затем соединение FCE

24883 (II) смесью в отношении 90:10:0,5. Из объединенных фракций после промывки водой, концентрирования до небольших объемов в присутствии н-пропанола, добав- 15 ления эквивалента хлористоводородной кислоты и избытка н-гексана, получают п реципитат чистого FCE 24883 (tl) в виде гидрохлорида(В)

О OH ОН

ОС"з O OH H

ИЗС

g I

FCE 24883 (II) как свободное основание растворимо в полярных органических растворителях и водных спиртах, тогда как его гидрохлорид (III) растворим в воде, но ма- 35 ло растворим s органических растворителях. Гидрох.::орид соединения СЕ 24883 имеет следующие физико-химические свойства:

Точка плавления: 200 С (разлагается): 40 удельное вращение (a )D + 188О (с =

=0,05, метанол).

Спектр поглощения в УФ и видимой области: H20 Cage 232, 254, 290 и 480 нанометров (я = 492, 370, 127, 163);

ИК-спектр (КВг); пики при следующих частотах: 3400, 2970, 2920, 1610, 1580, 1472, 1440, 1410, 1380, 1355, 1320, 1280, 1235, 1210, 1110, 1080, 1060, 1030, 1010, 985, 965, 940, 920; 900, 890, 870, 860, 830, 810, 785, 755, 730, 710, 540, 480, 450 и 415 см

Спектр ЯМР на ядрах 1Н (ДМСО-da, 200

МГц, 22 С) млн.д: 14,03 (широкий синглет, 2Н, OH-6, ОН-11), 7,6-7,0 (м, ÇH, Н-1, Н-2, Н-З), 5,26 (м, 1 t1, Н-1). 4,96 (д, J = 5,2 Гц, 1Н, OH-1З),4,92 (м, 1Н, H-7), 4,55(м, 1Н, H-4),4,51 (т, J = 6,7 Гц, 1, OH-14). 4,20 (с, 1Н, ОН-9), 3,97 (с, ЗН, 4-ОСНэ), 3,76 (ддд, J = 3,5, 6,7, 11,0 Гц, 1Н, СН(tl)-ОН), 3.60 (д.кв., J = 1,0, 6,0 Гц, Н-5), 3.48 (ддд, J = 7,2, 6,7. 11,0 Гц, 1Н, СН(Н)-ОН): 3,37 (ддд, J = 5,2, 3,5, 7,2 Гц.

1Н, Н-13), 3.,02 (м, 1Н, Н-З), 2,81 (м, 21- . СН2 t0), 2,15 (дд, J =- 2,0, 15,3 Гц. 1Н, H-Be), 1.97 (дд, J = 6,0, 15,3 Гц, 1Н, Н-8 акс), 1,7 — 1,9 (м, 2Н, СНз-2) и 1,14 (д. J = 6,0 Гц). ЗН, СНэ-5); молекулярная формула: CQ7H3pN1p HCI. m/Z в О эквиваленте к свободному основанию:

656 (MH); 655 (M) и 410 (M ), соответствующие агликону.

Селективная жидкостная хроматография высокого давления позволяет разделигь (два максимума с временем задержки

18,8 и 10,3 минут) два стереоизомерных спирта при С-13, присутствующих в образце синтетического 4 -деэокси.-13-дигидро-4 иододоксорубицина, полученного восстановлением йода боргидридом натрия.

Используя тот же метод жидкостной хроматографии высокого давления, получа:от соединение FCE 24883 (ll) как отдельный пик с временем задержки 19,3 минуты, соответствующим времени медленно движущейся составляющей синтетического

13-дигидропроизводного.

Метод жидкостной хроматографии высокого давления. Колонка: две секции RP сферисорб S 30032 (С18 Зр, разделение фзэ

Великобритания) размером 150 х 4.5 мм. соединенные в ряд; температура.45" С; мобильная фаза А: 0,05 M водного IHgP04, подкисленного до рН 3,0 смесью HYPO<-метанол в отношении 80:2 по объему; подвижчая фаза B: метанол; проявление, изократное за 30 минут (42;/ А+ 587, В): скорость потока 0.6 мл/мин; детектировгн1.e:

254 нанометра, Кислотный гидролиз соединения (It) (0,2 н. хлористоводородная кислота, 80 С, 30 минут) дает красный осадок соответствующего агликона, тогда как сахарная компонента, а именно З-амино-2,3,4.6-тетрадеэокси-4-иод- =ликсогексогексоза, присутствует в водной фазе и идентифицирована в сравнении с аутентичным образцом, полученным при кислотном гидролизе соединения (!).

Цитотоксическую активность соединения FCE 24883 испытывают tn vitro на клетках Hela P 388 в сравнении с соединением (l) и доксорубицином. Выявлено, что соединение (II) не менее активное, чем 4 -деэокси4 -йододоксооубицин (I) и доксирубицин (табл. 1).

Активность IA vtvo соединения FCE

24883 (II) испытывают против рассеянного лейкоза Гросса. Мышам линии СЗН вводят внутривенно инъекцию 210 клеток на мышь, збрзбать ьают соединениями и иэучаюГ 24 ча»а весле с пухо ВОЙ иньекции.

1760986

При оптимальной дозе соединение FCE

24883 (II) более активное, чем доксорубицин, и такое же активное, как 4 -дезокси-4 -йододоксорубицин (!), с малой токсичностью, проявленной при активных дозах. Противоопухолевую активность соединения (II), оцененную как среднее время выживания обработанных животных над контрольными мышами, можно сравнить с активностью соединения (I) и доксорубицина (табл. 2).

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культуру микроорганизма

Streptomyces peucetius штамм М 87 F.1. (D

М 2444) выращивают 14 дней при 28 С на скошенном агаре следующей поддерживающей среды (Среда А); глюкоза 3, пивные дрожжи 1,2%; NaCI 0,1, KH2PO4 0,05, СаСОз 0,1 ; MgSO4 0,005 ; FeS04 7НгО

0,0005%: ZnSO4 7Н20 0,0005%; CuSO4 5HzO

0,0005%; агар 2, водопроводная вода до

100 мл, рН 0,7. Стерилизацию проводят нагреванием в автоклаве в течение 20 минут.

Споры выращенной культуры собирают и суспендируют- в 3 мл стерильной дистиллированной воды, Этой суспензией засевают 60 мл жидкой питательной среды, содержащейся в 300 мл колбах Эрленмейера: пивные дрожжи 0,3, пептон 0,5, Са(!!Оз) 4Н20 0,05%, водопроводная вода до 100 мл, Стерилизацию проводят нагреванием в автоклаве при 120 С в течение 20 минут, рН этой среды после стерилизации устанавливают между 6,8 и 7,0. Инокулированные колбы встряхивают два дня при температуре 28 С на роторной мешалке при

250 об/мин, описывающей окружность диаметром 7 см. 1,5 мл культуры, выращенной описанным способом, высевают в 300 мл колбы Эрленмейера, содержащие 50 мл следующей биотрансформирующей среды: дрожжевой экстракт 1,5, К2РО4 0,25, глюкоза 1,5, водопроводная вода до

100 мл, рН 6,9, Стерилизацию проводят нагреванием в автоклаве при 115 С в течение

20 минут. Раствор глюкозы стерилизуют отдельно и добавляют к каждой стерилизованной колбе в нужной концентрации.

Затем содержимое колб инкубируют при

28 С в условиях, описанных для фазы посева, в течение 24 часов. В это время в каждую колбу добавляют по 1,0 мл раствора соединения (!) в стерилизованной воде в концентрации 5 мг/мл. Встряхиваемые колбы инкубируют еще два дня и получают 70 -ое превращение соединения (!) в соединение (Ii).

Пример 2. Культуру микроорганизма

S, peucetius штамм M 87 F.1. выращивают

10 на твердой питательной среде, как описано в примере 1. Споры трех скошенных агаров обьединяют и собирают в 10 мл стерильной дистиллированной воды. Полученную таким образом суспензию высевают в 2-х л опрокидывающиеся колбы с круглым дном, содержащие 500 мл посевной среды, описанной в примере 1. Колбу инкубируют 48 часов на.роторной мешалке, вращающейся со скоростью 120 об/мин и описывающей окружность диаметром 7 см, при температуре 28 С, Весь посевной материал инокулируют в 10 л бродильный чан из нержавеющей стали, содержащий 7,5 л биотрансформиру15 ющей среды, описанной в примере 1 и стерилизованной водяным паром при 120 С в течение 30 минут. Раствор глюкозы стерилизуют отдельно и добавляют в стерилизованный бродильный чан в соответствующей

20 концентрации. Культуру выращивают при

28 С при помешивании с 230 об/мин и аэрации потоком воздуха со скоростью 1 л/л среды/мин. Через 48 часов доба вля ют субстратное соединение в концентрации, 25 описанной в примере 1, и после инкубирования культуры в течение 3-х дней получают

60%-ную конверсию соединения (I) в соединение (II).

Пример 3. Цельное сусло (5 л) из

30 ферментации, полученной по примеру 2, фильтруют с использованием 2 диатомовой земли в качестве фильтра. Влажный осадок на фильтре экстрагируют ацетоном (3 л).

После фильтрации проводят две дополни35 тельных экстракции ацетоном для достижения полного выделения красных пигментов.

Обьединенные ацетоновые экстракты концентрируют при пониженном давлении и концентрат (1 л) объединяют с профильт40 рованным бульоном и исчерпывающе экстрагируют при рН 8,0 смесью дихлорметан-метанол в отношении 9:1. Органический экстракт, содержащий соединения (i) и (!!) с теми же продуктами распада, концентриру45 ют досуха при пониженном давлении. Остаток, растворенный в дихлорметане, хроматографируют на колонке силикагеля, стабилизированного буфером с рН 7,0 . (M/15 фосфатный буфер), градиентом смеси

50 дихлорметан-метанол-вода. После вымывания некоторых продуктов распада элюируют соединение I смесью в о ношении

95:5:0,25 с последующим элюированием соединения FCE 24883 (II) смесью в отноше55 нии 90:10:0,5.

Из обьединенных фракций г:осле промывки водой, концентрации до небольшого объема в пр сутствии н-пропанола, добавления одног0 эквивалента хлористоводородной кислоты и избы1к» н-гексана

: 1760986

20

0 OH 0

HbC

4 (,() 30

Таблица 1

In vItro активность 13-/S/-дигидро-4 -йододоксирубицина (соединение il, ГСЕ 24883) в сравнении с 4 -деэокси-4 -йододоксирубицином (соединение I, FCE 21954) и доксорубицином (Дх) И g

Н ci

10,8

10,4

8 а) доза, дающая 50% снижение числа клеток в сравнении с контрольными необработанными животными

Ь) клетки зпителиоидной карциномы шеи человека с) P388 — лейкозные клетки получают чистое соединение FCE 24883 (Н)

0,30, 60%-ный выход, в форме гидрохлорида (т.пл. 200 С, разлагается), Повторяя процесс, выделяют также нетрансформированное соединение I (0.13 г, 26%) в виде 5 гидрохлорида.

Пример 4. Образец соединения FCE

24883 (И) 200 мг растворяют в 0,2 н. водной хлористоводородной кислоте (50 мл) и нагревают 30 минут при 100 С. Кристалличе- 10 ский красный осадок (0,12 г) агликона собирают фильтрацией, промывают водой и сушат, Масс-спектр: m/е 416 (M ). Агликон идентифицирован как 13-(S)-дигидроадриамицинон сравнением с ау.-ентичным образ- 15 цом, Формула изобретения

1. Способ получения 4 -деэокси-13(Я)дигидро-4 -йододоксорубицина формулы заключающийся в том, что штамм

Streptomyc s peucetlus DSM 2444 культивируют в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники азота и углерода и минеральные соли, в присутствии

4 -дезокси-4 -йододоксирубицина в форме его хлоргидрата в конечной концентрации

0,1 мг/мл среды при температуре 27 — 30 С, пол ченную культуральную жидкость разделяют, отделенный мицелий экстрагируют ацетоном, а жидкую фазу смесьюдихлорметана и метанола в объемном соотношении 9:1 при рН 8,0, далее полученные экстракты объединяют и концентрируют при пониженном давлении до сухого состояния, затем концентрат растворяют в дихлормегане и хроматографируют на колонке иэ силикагеля, забуференного до рН 7,0, злюируют последовательно смесью дихлорметана, метанола и воды при объемном соотношении 95:5:0,25 и 90;10:0,5 соответственно, полученный второй злю>т концентрируют в присутствии н-пропанола, выделяют целевой продукт и переводят в форму его хлоргидрата, 2. Способ па п,1, отличающийся тем, -.To культивирование ведут 3 — 5 дней.

1760986

Таблица 2 а) Мышей линии СЗН иньекцировали внутривенно 2х10 лейкозных клеток и обрабатывали внутривенно соединениями через один день после опухолевой иньекции.

Ь) (Среднее время выживания обработанных мышей/среднее время выживания контрольных животных) х 100. с) оценено по результатам вскрытия погибших мышей.

Составитель Г. Смирнова

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор О. Юрковецкая

Редактор

Заказ 3195 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Активность 13-/S/-дигидро-4 йододоксирубицина (соединение II, FCE 24883) в сравнении с 4 -деэокси-4 -йододоксирубицином (соединение 1, FCE 21954) и доксорубицином (Дх) против рассеянного лейкоза Гросса