Способ получения декстраназы

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к способу получения декстраназы из микромицетов. С целью повышения активности декстраназы, увеличения выхода конечного продукта и упрощения процесса , в качестве продуцента используют штамм-продуцент Aspergillus tnsuetus ВКПМ F-342, являющийся вариантом штамма Aspergillus tnsuetus F-11 б. который выращивают на питательной среде, содержащей в качестве индуктора низкомолекулярный декстран полиглюкин в количестве 0,4- 0,6%, а также автолизат дрожжевого или фементолиза биомассы микроорганизмов в количестве 0,2-0,5%. Преимуществом предложенного способа является увеличение декстраназной активности на 20%. увеличение выхода конечного продукта в среднем на 30%, снижение концентрации индуктора в питательной среде в 2 раза и сокращение сроков культивирования на 20-22%.

союз сОВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО И20БРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

K АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4163218/13 (22) 19.11.86 (46) 23.08.92. Бюл. М 31 (71) Институт микробиологии АН БССР и

Всесоюзный научно-исследовательский институт биотехнологии (72) А.Г. Лобанок, О.Н. Зинченко, В.И. Шишло, З.А. Рожкова, Г.А. Молодова, Т.И. Данилова, А.К. Хасирджаева и Е.И. Беленькая (56) Авторское свидетельство СССР

М 747889, кл. С 12 и 15/00, 1978.

Авторское свидетельство СССР .

М 896069, кл. С 12 и 15/00, 1980. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕКСТРАНАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения декстраназы из микромицетов. С целью повышения активности декстраназы, увеличения выхоИзобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения декстраназы из микромицетов, Целью изобретения является повышение активности декстраназы, увеличение выхода коиечного продукта и упрощение процесса.

Сущность изобретения заключается в использовании штамма Asperglilus insuetus

ВКПБ F-342, который выращивают на питательной среде с полиглюкином и автолизатом дрожжевым или ферментолизатом биомассы микроорганизмов. Низкомолекуляриый декстран полиглюкин, в отличие от высокомолекулярного нативного декстрана, выпускается отечественной промышленностью (МРТУ 42 Q 3548-67). Он является ..единственно доступным в СССР полимером декстраиовой природы. штамм Asp.

„„5U„„1756355 А1 (Я)4 С 12 N 9/46. 1/14 // (С 12 N 9/46, С 12

R166) да конечного продукта и упрощения процесса, в качестве продуцента используют штамм-продуцент Aspergillus fnsuetus

ВКПМ F-342, являющийся вариантом штамма Aspergillus lnsuetus F-116. который выращивают на питательной среде, содержащей в качестве индуктора низкомолекулярный декстран полиглюкин в количестве 0,40,6, а также автолизат дрожжевого или фемеитолиза биомассы микроорганизмов в количестве 0,2 — 0,5 . Преимуществом предложенного способа является увеличение декстраназной активности иа 20, увеличение выхода конечного продукта в среднем на 30, снижение концентрации индуктора в питательной среде в 2 раза и сокращение сроков культивирования нэ

20-22%.

insuetus ВКПМ F-342 является вариантом штамма Asp.! nsuetus Г-116. Депонироваи в коллекции микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Получение штамма.

Суспензию спор гриба Asp. insuetus Г116 рассевали иа чашки Петри с агаризоваиной средой Чапека-Докса, содержащей в качестве источника углерода голубой декстран. Добивались получения.отдельных колоний. После 4 сут выращивания отбирали наиболее крупные колонии с широкой зоной просветления среды вокруг иих. Наличие таких зои свидетельствует о гидролыЗе содержащегося в,среде дежстрйиз выделенным в питательную среду ферментом декстраиазой. Каждую отобранную ко1756355 лонию пересевали на скошенный картофельно-декстроэный агар. выращивали при

26 С в течение 2-х недель. затем проверяли декстранаэную активность, культивируя штамм на качалке, в жидкой питательной

"реде двух вариантов:

1 — питательная среда с 0,5 полиглюкина;

2 — питательная среда с 0.5 полиглюкина и 0,5 автолиэата дрожжевого или ферментолйзата бйомассы микроорганизмов.

Таким образом. был отобран штамм, накапливающий большое количество декстраназы (до 100 ед/мл) при культивировании в течение 96 ч на питательной среде 2.

Штамм Asp insuetus ВКПМ F-342 характеризуется следующими культурноморфологическими и биохимическими признаками:

Морфологические признаки.

На среде Чапека-Докса мицелий белый, септированный. Конидиеносцы прямостоящие, толщиной 3,0 — 4,0 мкм, несептированные. Конидиальная голов.а овальная, образована вершинным вздутием конидиеносца. Размеры головки (8-9) (7 — 8) мкм, стеригмы 14,0 — 7,0 мкм расположены одним слоем, бесцветные, конидии окуглые, гладкие, диаметром около 5,0 мкм.

Культуралькые признаки, Агар Чапека-Докса с сахарозой. Пятисуточная колония диаметром 2,8 — 3,0 см.

Колония круглая, пушистая, выпуклая, воз1 душный мицелий белый, На 6-е сутки роста при 28 С колония достигает диаметра 3,23,4 см, в центре появляется зона спороношения сероватого цвета.

Картофельно-декстрозный агар, На 5-е сутки при 28 С колония имеет диаметр 2,5—

2,7 см, профиль колонии выпуклый, края ровные, рост концентрический, воздушный мицелий серо-коричневого цвета, по краю колонии белый, к 6-и суткам центр колонии более светлый, диаметр 2,8-3,0 см.

Агар Чапека-Докса с декстраном. Четырехсуточная колония круглая, белая, пушистая, выпуклого профиля, с ровными краями, диаметр колонии 3,2-3,5 см, вокруг колонии зЬна просветления декстрана шириной до 8,0 мм. В центре колонии на 5-6-е сутки появляется конидиеносная зона диаметром до 1,5 см.

Физиолого-биохимические признаки.

AspergIIlus Insuetus ВКПМ F-342 гидролиэует крахмал, молоко свертывает на 6-е сутки, желатину разжижает воронкообразно. Использует аммонийную, нитратную и белковую формы азота. Нитрзты восстанавливает. Активно ассимилирует глюкозу, са20

30 Гриб выращивают на качалке при 200 об/мин в течение 120 ч при 29 С в колбах емкостью 100 мл с 25 мл питательной среды следующего состава, ; нативный декстран 1,0; ИаИОэ 0,3; KHzP0< 0,1; KCI 0,05;

35 MgS04 . 7H20 0,05, рН 5,0. Культуральную

55 харозу, мальтоэу, лактоэу, арабинозу, ксилозу, маннит и глицерин.

Условия хранения штамма, Штамм поддерживают на картофельнодекстроэном агаре или агаре Чапека-Докса при 26 С.

Штамм Аер. Insuetus ВКПМ F-342 не токсичен, так как получен иэ исходного нетоксичного штамма Asp, insuetus Г-116 без применения мутагенных факторов.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что продуцент Авр.

insuetus ВКПМ F-342 культивируют в колбах в течение 93-96 ч или в ферментерах в течение 60 — 70 ч на питательной среде следующего состава, : полиглюкин 0,40,6; МаИОэ 0,3; KHzP04 0.1, KCI 0,05;

MgS04 7Н20 0,05; автолизат дрожжевой или ферментолизат биомассы микроорганиэмов 0,2 — 0,5.

Декстраназную активность выражают в глюкозных единицах. Единица активности соответствует количеству освободившихся при действии фермента на субстрат восстанавливающих групп при 37 С за 1 мин, эквивалентному одному микромолю глюкозы.

Пример 1 (контроль). Культивирование штамма Asp, Insuetus Г-116 в оптимальных условиях, жидкость (КЖ) с активностью декстраназы

80 ед/мл отделяют фильтрованием. Конечный продукт осаждают этиловым спиртом известным способом, при этом выход препарата составляет 1 г/л КЖ.

Пример 2. Культивирование штамма

Asp. insuetus ВКПМ F-342 в оптимальных условиях, Гриб выращивают на качалке при 2000 об/мин в течение 96 ч при 29 С в колбах емкостью 250 мл со 100 мл питательной среды следующего состава, %: полиглюкин 0,5; ИаИОэ 0,3; КН2РО< 0,1; КО 0,05 ;

MgSO< 7HzO 0,05; автолизат дрожжевой

03, рН 5,0. Получают КЖ с активностью декстраназы 98 ед/мл, выход препарата после осаждения спиртом составляет 1,55 г с

1л КЖ.

Исследования показали, что для обоих продуцентов в качестве индуктора синтеза декстраназы можно использовать полиглюкин взамен нативного декстрана. При внесении в питательную среду в количестве 1 они дают практически одинаковые резуль1756355

Составитель B,Ñîèíà

Техред M.Ìîðãåíòaë Корректор Н.Гунька

Редактор Н.Рогулич

Заказ 3062 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 таты. Однако особенностью предлагаемого штамма Азр. Insuetus ВКПМ F-342 является то, что максимум накопления фермента достигается уже на 4-е сутки культивирования, т.е. происходит сокращение срока культивирования на 24 ч по сравнению с Asp.

insuetus Г-116. Кроме того, предлагаемый штамм, в отличие от исходного, обладает способностью к повышенному синтезу декстраназы при культивировании на питательных средах,. содержащих композицию полиглюкина и автолиэата дрожжевого или ферментолизата биомассы микроорганизмов. Введение в питательную среду этих недефицитных веществ позволяет в 2 раза снизить концентрацию индуктора при использовании предлагаемого штамма. На питательных средах с 0,4-0,6 / полиглюкина и

0,2-0,5% автолизата дрожжевого или ферментолиэага биомассы микроорганизмов уровень активности декстраназы в КЖ Asp, insuetus ВКПМ F-342 достигает своего максимального значения (96-100 ед/мл). При этом выход конечного продукта увеличивается в среднем на 30%, срок культивирования сокращается на 24 ч, При концентрации полиглюкина менее 0,4 и автолизата дрожжевого или ферментолиэата биомассы микроорганизмов менее 0,2% снижается как активность декстраназы, так и выход конечного продукта. Увеличение концентрации полиглюкина выше О,б и автолизата дрожжевого или ферментолизата биомассы микроорганизмов выше 0,5 также приводит к снижению an.ивности декстраназы.

При культивировании продуцента Asp, lnsuetus ВКПМ F-342 менее 96 ч активность

8 куль туральной жидкости не достигает саО его максимального значения, При культивировании Asp, Insuetus

ВКПМ F-342 в ферменте на питательной сре5 де с 0,5 полиглюкина и 0,4 автолиэата дрожжевого за 60-70 ч роста достигается максимальный уровень активности декстраназы в культуральной жидкости 60-80 ед/мл, при выходе конечного продукта 1,410 1,6 г/л, в то время как максимум активности декстраназы Азр. Insuetus Г-116 при выращивании в аналогичных условиях достигается к 75-80 ч и составляет 40 — 45 ед/мл, Преимуществом изобретения являются:

15 увеличение декстраназной активности на

20%, сокращение сроков культивирования на 20-22%, снижение концентрации индуктора в питательной среде в 2 раза и увеличение выхода конечного продук1 а в среднем

20 на 30, Формула изобретения

Способ получения декстраназы, предусматриваю ций глубинное культивирование продуцента Aspergillus insuetus в

25 аэробных условиях на питательной среде, содержащей индуктор декстраназы, источники азота, фосфора, минеральные соли до максимального накопления активности, о тличающийся тем,что,сцельюповыше30 ния активности декстраназы, увеличения выхода конечного продукта и упрощения процесса, в качестве продуцента декстраназы используют штамм Aspergiiius Insuetus

BY, IM F-342, в качестве индуктора — 0,4-0,6

35 мас. полиглюкина, а в качестве источника азота в питательную среду вводят 0,2-0.5% дрожжевого автолизата или ферментолизата биомассы микроорганизмов.