Штамм бактерии brucella авоrтus, используемый для изготовления вакцин против бруцеллеза

 

Использование: микробиология, профилактика бруцеллеза, вакцина против бруцеллеза . Сущность изобретения: вакцину готовят из нового штамма Brucella abortus ВГНКИ№20-1-ДЕП. Штамм отличается низкой остаточной вирулентностью отсутствием абортогенности и агглютиногенности. Для получения вакцины штамм выращивают , отделяют клетки, доводят их концентрацию до 10 млрд.кл/мл и расфасовывают. Вакцина по иммуногенным свойствам превосходит вакцинный штамм 19 и не вызывает образования агглютининов, что позволяет постинфекционные реакции от поствакцинальных. 1 табл. (Л С Недостатком прототипа является то, что вакцинный штамм 19 обладает высокими агглютиногенными свойствами, вызывает у привитых животных серопозитивные реакции , которые трудно отличить от серопозитивности у зараженных животных и вызывает аборты у стельных коров. Цель изобретения - получение штамма бруцелл для создания вакцины, обладающей высокой стабильностью, иммуногеннох| о XI ю о

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4861199/13 (22) 21.08,90 (46) 15.09.92. Бюл. М 34 (71) Северо-Кавказский зональный научноисследовательский ветеринарный институт и Донской сельскохозяйственный институт (72) В,С.Рягузов, В,Н.Никитенко, А.П.Пономарев, Г.Е.Ирская, П,М,Потатуркин, Л.В.Ропаева, И,П.Хабузов, Л.А,Малышева, А.А.Харченко и С,Г.Щипко (56) 1. Ромахов В.А„Клочков А,А. и др. Иммуногенные свойства вакцины из штамма

Br,abortus 104-М в опыте на морских свинках. Труды ВИЭВ, 1985, т. 63, с. 7 — 11.

2.Михайлов Н,А, Салманов К,М. и др.

Результаты проверки свойств отдельных серий сухой живой противобруцеллезной вакцины из штамма 82, Научные труды

Казанского ветеринарного института, 1980, т. 135, с. 48-60.

З.Вершилова П.А., Чернышева М.И. Испытание иммунитета у морских свинок, вакцинированных Brabortus 19 В А к высоковирулентной культуре Br.suis 1330,—

Ветеринария, 1959, N12,,с. 23.

4,Шевченко Н., Малахова Т. и др. Сравнительное испытание иммуногенных и антигенных свойств противобруцеллезных вакцин из различных штаммов, Труды Уз, НИВИ, 1978, т. 28, ч, 1, с. 142 — 147, Изобретение относится к микробиологии и предназначено для получения противобруцеллезной вакцины. Известны вакцинные штаммы бруцелл: 104М, 82, 19 ВА, Штаммы

104М и 19 ВА обладают высокой иммуногенностью и агглютиногенностью. Штамм 82 иммуногенный, слабоагглютиногенный.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является штамм

В rucella abortus.

„„Я2„„1761796 А1

ABORTUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИН ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА (57) Использование: микробиология, профилактика бруцеллеза, вакцина против бруцеллеза. Сущность изобретения; вакцину готовят из нового штамма Brucella abortus

ВГНКИ N 20-1-ДЕП, Штамм отличается низкой остаточной вирулентностью отсутствием абортогенности и агглютиногенности.

Для получения вакцины штамм выращивают, отделяют клетки, доводят их концентрацию до 10 млрд,кл/мл и расфасовывают.

Вакцина по иммуногенным свойствам превосходит вакцинный штамм 19 и не вызывает образования агглютининов, что позволяет постинфекционные реакции от поствакцинальных, 1 табл.

Недостатком прототипа является то, что вакцинный штамм 19 обладает высокими агглютиногенными свойствами, вызывает у привитых животных серопозитивные реакции, которые трудно отличить от серопозитивности у зараженных животных и вызывает аборты у стельных коров.

Цель изобретения — получение штамма бруцелл для создания вакцины, обладающей высокой стабильностью, иммуногенно1761796 ют в пробирки с мясопептонным глюкозно55 стью, безвредностью, и слабой агглютиногенностью, неабортогенностью, Сущность изобретения. Новый штамм

Br,àÜîrtus 21 — 5 получен из штамма

Br.abortus 21 путем пассажирования через организм стельных коров и отселекционирован в стабильных P — формах.

Штамм Вг.abortus 21-5 депонирован в лаборатории контроля и стандартизации бруцеллезных и кампилобактериозных препаратов ВГНКИ,.

Штамм Вг,abortus ВГНКИ N 20-1-ДЕП характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биологическими признаками.

Морфологические: клетки штамма 21 — 5 представляют коккабактерии 1 — 1,5 мкм в длину, по Граму отрицательны, по Козлов.скому сохраняют красный цвет, по Романовскому — нежно-фиолетовый.

Культуральные: бактерии штамма 21 — 5 хорошо растут на глюкозно-глицериновом печеночно-пептонном бульоне и агаре Д и других средах, имеющих нейтральную или слегка щелочную реакцию (рН 6,8 — 7,2) в аэробных условиях при температуре 37 С.

На плотной среде образуют выпуклые, матовые, полупрозрачные колонии.

Биохимические: штамм 21 — 5 представлен P — (100® колониями, при окраске по

Уайт-Вилсону реакция с трипафлавином положительна, с P — сывороткой агглютинируют; сероводород не образует, каталазная активность незначительная, не ферментирует глюкозу, лактозу, маннит, рамнозу, инозит. Растет на среде с содержанием фуксина, а при аналогичном содержании тионина рост не отмечается.

Серологические признаки, не вызывает агглютининов и комплементсвязывающих веществ в диагностических титрах, Агглютинируется R-сывороткой.

Биологические признаки; непатогенен, неабортогенен (безвреден), и риживаемость на морских свинках при дозе 100 м.к. до 2-х мес., 2 млрд.м.к. — до 3 мес, пассажирован через организм пяти стельных коров и десчтикратно через организм морских свинок, Миграцией на привитых животных не обладает.

Иммуногенные признаки: иммуногенность в эксперименте на морских свинках составила 63,6 — 83.3,, на крупном рогатом скоте 75 .

Отличительные признаки штамма

Бруцелла абортус 21-5: а) слабая агглютиногенность. При прививках лабораторных животных и крупного рогатого скота не вызывает образования аг10

50 глютиннов и комплементсвязывающих веществ в диагностических титрах; б) высокая иммуногенность у морских свинок до 83,3 через 3 месяца, а на крупном рогатом скоте до 75 спустя год после прививок; в) непатогенен: безвреден (неабортогенен). Приживаемость у морских свинок при дозе 100 м,к, до 2 мес„2 млрд м,к. до 3 мес; г) от вакцинированных животных на невакцинированных не мигрирует.

II. Отличие штамма Br.abortus 21 — 5 от близких штаммов

Штамм Br.abortus 21 — 5 отличается от слабогглютиногенного штамма Br.abortus 82 меньшей остаточной вирулентностью (отсутствием абортогенности), отсутствием сохранения агглютининов и комплементсвязывающих веществ.

Отличается от агглютиногенного штамма N 19 отсутствием агглютиногенности, что позволяет отличать постинфекционные реакции от поствакцинальных. ! II. Пределы варьирования признаков (5 — 10 $)

Селекционирован в P-форме из пятикратно пассажированной через организм стельных коров культуры.,Рост на глюкозноглицериновом МПА наблюдается в виде

100 колоний, содержащих Р-формы бруцелл по антигенным свойствам.

Пример 1, Вакцинный штамм Бруцелла абортус 21 — 5 получен следующим образом, Методом неоднократных воздействий ультрафиолетовыми лучами из вирулентной культуры вначале получен штамм 21, Затем проведен пассаж культуры штамм 21 через организм 5 стельных коров (сроки от 3 до 8,5 мес), Дозы вакцины от 100 млрд (1-я корова), 2 — 3 коровы по 200 млрд, 4-я — 220 млрд, 5-я — 300 млрд. Спустя один месяц от вакцинированных неделей, выделяли культуры штамма Br.abortus, которых изолировали из региональных лимфатических узлов, предлр1аточных и надвыменных. Из 5-го пассажного варианта селекционирован вакцинный штамм 21 — 5 в Р-форме.

Пример 2. Методика изготовления и контроля вакцины из штамма Бруцелла

abortus 21 — 5. Культуру штамма 21 — 5 засеваглицериновым агаром, имевшим рН 6,8 — 7,0.

После двухсуточного культивирования в термостате при 37 С в каждую пробирку вносят по 2 мл физраствора и смазывают бактериальную массу, Делают посевы на матровые колбы со скошенным мясо-пептонным глюкозоглицериновым агаром (M П ГТА). Поверхность агаровой пластинки тщательно увлажняют засеянной суспен1761796 зизй и матровые колбы помещают в термостат. После двухсуточного выдерживания при 37 С колбы вынимают и проводят визуальный осмотр с целью выявления загрязнения посевов. Затем в каждую колбу вносят по 40 — 50 мл физраствора и тщательно смывают бактериальную массу. Из смыва каждой колбы готовят мазки, окрашивают их по методу Грама, Козловского и микроскопируют для проверки чистоты смывов, Колбы, в которых обнаруживают постороннюю микрофлору, выбраковывают, а из остальных полученную взвесь сливают в мерный цилиндр для определения общего объема смыва.

При установлении концентрации бруцелл вакционного штамма 21 — 5 в полученной взвеси используют оптические стандарты мутности.

Доводят концентрацию бруцеллезных клеток до 10 млрд в 1 мл. После этого вакцину расфасовывают в стерильные флаконы по 250 мл, заливают пробки сургучом и хранят в холодильнике при 5 С до употребления.

Помимо оптической устанавливают и биологическую концентрацию вакцины, Определение проводят путем приготовления последовательных разведений исходной взвеси с оптической концентрацией 10 млрд. м.к. в 1 мл в пробирках с 4,5 мл физраствора до получения конечного разведения .1:100 с последующим посевом 0,1 мл каждого из двух последних разведений (1:100 и 1;1000) на 3 — 4 чашки Петри с глюкозно-глицериновым агаром из рыбного гидролизата, Посевы выдерживают в термостате при 37 С в течение 4 — 6 дней, после чего проводят подсчет выросших колоний.

Определяют среднее арифметическое число живых бруцелл, содержащихся в 1 мл каждого разведения. Полученные цифры складывают и делят на 2 (количество разведений). Данное число отражает сред5

40 нее количество живых клеток, содержащихся в 1 мл приготовленной вакцины.

До употребления вакцину проверяют также на чистоту роста и безвредность, Чистоту культуры проверяли микроскопическим исследованием мазков, приготовленных из полученной вакцины и окрашенных по методам

Грама и Козловского. Кроме того, еще йроводится высев на пластины МПГТА в чашки Петри для исключения загрязнения вакцины аэробными микроорганизмами, Из подозреваемых колоний готовят мазки, окрашивают и микроскопируют.

Загрязненность анаэробными микроорганизмами исключается высевом вакцины на среду Китт-Тароцци, Безвредность проверяют подкожным введением вакцины двум беременным морским свинкам в дозе 1 млрд м.к. с последующим наблюдением за ними и исследованием от них сывороток крови через 2 недели в PA u

РСК, Абортов и положительных результатов серологических реакций, как правило, не отмечалось, Данные приведены в таблице, Тестами для определения диссоциации служит трипафлавиновая проба, реакция термопреципитации и окраска колоний, выросших на пластине агара в чашках Петри по Уайту и Вилсону.

Трипафлавиновая проба и реакция термопреципитации всегда были положительн ыми.

Окраской колоний кристаллвиолетом по

Уайту и Вилсону обнаруживали до 100 шероховатых R-форм колоний.

Как видно из таблицы, штамм Бруцелла абортус 21 — 5 по иммуногенным свойствам превосходит коммерческий штамм Бруцелла абортус 19.

Формула изобретения

Штамм бактерий Brucella abortus

ВГНКИ М 20-1-ДЕП, используемый для изготовления вакцин против бруцеллеза, 7! 1761796 8

У

Сравнительные данные по иммуногенности противобруцеллезных вакцин

Составитель Л.Малышева

Редактор М.Самерханов Техред М.Моргентал, Корректор M,Ïåòðoâà

Заказ 3235 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская.наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101