Штамм бактерий воrdетеllа реrтussis - продуцент коклюшного токсина

Авторы патента:

ШМЕЛЕВА ЕЛЕНА ИВАНОВНА

МЕРЦАЛОВА НАТАЛЬЯ УСТИНОВНА

СУХИНОВА ЕЛЕНА ЕВГЕНЬЕВНА

КИРИЛЛОВА ГАЛИНА АНАТОЛЬЕВНА

ЗАХАРОВА НИНЕЛЬ СЕРГЕЕВНА

БАЖАНОВА ИРИНА ГЛЕБОВНА

РЕМОВА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА

ОЗЕРЕЦКОВСКАЯ МАРИЯ НИКОЛАЕВНА

РАДАВСКИЙ ЮРИЙ ЛЕОНИДОВИЧ

ЗАИКИН АЛЕКСАНДР АРЕФЬЕВИЧ

ГАВРИШ ОЛЕГ ГЕННАДИЕВИЧ

ЧЕЧЕТ ВИКТОР АЛЕКСАНДРОВИЧ

C12N1/20 - бактерии; питательные среды для них

A61K39/10 - Brucella; Bordetella, например коклюша

Использование: медицинская микробиология , диагностика коклюша, получение коклюшного токсина. Сущность изобретения: для получения коклюшного токсина используют новый штамм Bordetella pertussis ГИСК № 203. Штамм культивируют на жидкой полусинтетической среде с добавлением анионообменной смолы. Выращивание ведут в статических условиях в течение 72- 120 ч при 35-37°С. В конце культивирования концентрация бактерий составляет 56 ±2.6 МОЕ/мл, лейкоцитозстимулирующая активность супернатантов - 8-9 ЛС -единиц/0,1 мл, Выход высокоочищенного белка токсина 2,1 ± 0,26 мг с 1 л супернатанта. 2 табл. |СЛ с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4856618/13 (22) 12.07.90 (46) 15,09.92. Бюл. ¹ 34 (71) Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова и

Институт биоорганической химии и нефтехимии АН УССР (72) Е.И.Шмелева, Н.У,Мерцалова, Е,Е.Сухинова, Г.А.Кириллова, Н,С.Захарова, И.Г,Бажа нова, Т.Н. Ремова, М.Н.Озерецковская, Ю.Л.Радавский, А.А,Заикин, О.Г.Гавриш и

В.А.Чечет (56) Сухинова Е,Е., Е.И.Шмелева, Мерцалова Н,У., Кичатова Л,Г. Изучение продукции антигенов и их токсических свойств в процессе культивирования коклюшных микробов. Токсинообразование В.pertussis в среде определенного химического состава./Сб. "Разработка новых бактериальных вакцин". М., 1987, с,27 вЂ” 35.

Изобретение относится к медицине, а именно к разделу получения медицинских и биологических препаратов для иммунологических целей, в том числе для иммунноферментного анализа и иммуннохимических исследований, Известные лабораторные и свежевыделенные штаммы В.pertussis характеризуются слабой токсинообразующей активностью. Более выраженной токсинообразующей активностью (в 1,5 вЂ” 2 раза) при культивировании в жидких средах обладает штамм № 475. Однако, выход концентрированных и очищенных токсинов при использовании этого штамма недостаточно высок.

Цель данного изобретения вЂ” получение высокопродуктивного токсиногенного сероварианта штамма Bordetella pertussis, „„5U „„1761795 А1 (st)s С 12 N 1/20, А 61 К 39/10 (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BOR0ETELLA

PERTUSSiS вЂ” ПРОДУЦЕНТ КОКЛЮШНОГО

ТОКСИНА (57) Использование: медицинская микробиология, диагностика коклюша, получение коклюшного токсина. Сущность изобретения: для получения коклюшного токсина используют новый штамм Bordetella pertussis

ГИСК № 203. Штамм культивируют на жидкой полусинтетической среде с добавлением анионообменной смолы, Выращивание ведут в статических условиях в течение 72120 ч при 35 вЂ” 37 С. В конце культивирования концентрация бактерий составляет 56 ":2,6

МОЕ/мл, лейкоцитозстимулирующая активность супернатантов вЂ” 8-9 ЛС -единиц/0,1 мл, Выход высокоочищенного белка токсина

2,1+. 0,26 мг с 1 л супернатанта. 2 табл.

Штамм 475а получен селекционным путем из штамма ¹ 475.

Штамм № 475а хранится в коллекции

Государствен ного научно-исследовател ьского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им.

Л,А.Тарасевича М3 СССР под номером 203.

Штамм имеет следующие характеристики, Морфологические и культуральные свойства: неподвижные, овоидной формы мелкие палочки (коккобактерии), располагающиеся отдельно или парами, без признаков полиморфизма, Грамотрицательные.

На среде Борде-Жангу колонии мелкие, диаметром 0,5 вЂ” 1 мм. Выпуклые, круглые, окруженные нередко ограниченной зоной гемолиза только в тонком слое среды (1,5 вЂ” 2

1761795 мм), содержащей 257; крови, Культуры не должны расти на мясо-пептонном агаре.

Оптимальная температура. выращивания 35 ": 1,0 С, Пример. Для культивирования

Bordetella pertussis используют жидкую полусинтетическую среду (модификация среды Коэн-Виллера), включающую казеиновый гидролизат, дрожжевой диализат, крахмал, соли(КгНРО4, КНгРО4, KCI, MgSO4, CaClz, NaCl) и аминокислоты (цистеин, глутаминовая кислота).

Лиофилизированный штамм N 475а высевают на чашки Петри со средой БордеЖангу. Период выращивания 2 вЂ” 3 сут. Затем с чашки делают пересев 10 вЂ” 15 типичных колоний на пробирки со средой Барде-Жангу. Смыв с пробирок 2го-Зго пассажей используют для посева в пробирки с жидкой полусинтетической средой, либо в пробирки с жидкой полусинтетической средой переносят из ампул сухую посевную культуру, разведенную жидкой полусинтетической средой, Пробирки помещают в аппарат для вращающихся пробирок и инкубируют 24 ч при 35 - 1 С. Чистую культуру из пробирок переносят в колбы Эрленмейера (200 мл среды), Колбы помещают в шуттель-аппарат и культивируют при 35 1 С до конца экспоненциальной фазы роста. После морфологического контроля культуру пересевают в колбы Эрленмейера и выращивают до конца экспоненциальной фазы роста, Полученную маточную культуру используют для засева матрацев с жидкой полусинтетической средой. В среду культивирования добавляют анионообменную смолу, Выращивание ведут в статических условиях в течение 72 вЂ” 120 часов при температуре 36 1 С.

В конце культивирования концентрация бактерий составляет 56 ч 3,6 MOE/мл, лейкоцитозстимулирующая активность супернатантов вЂ” 8 вЂ” 9 ЛС-единиц/0,1 мл. Выход высокоочищенного белка токсина, в среднем, 2,1 + 0,26 мг с 1 литра супернатанта, Определение лейкоцитозстимулирующей активности штамма, Определение лейкоцитозстимулирующей активности штамма проводится на мышах массой 14 вЂ” 16 г (6 вЂ” 10 мышей в каждой груп пе), В нутри бр юшин но вводят 0,5 мл испытуемого материала (суспензии культуры или супернатанта). Контрольным животным вводят 0,5 мл физиологического раствора, 5

Через 72 ч из хвостовой вены берут кровь. Количество лейкоцитов подсчитывают в камере Горяева. Одна единица лейкоцитозстимулирующей активности соответствует повышению уровня лейкоцитов в 1 мм крови на 10 тысяч, по сравнению с контролем.

Сравнительные данные продуктивности исходного и селекционированного штаммов ВогбесеПа pertussis.

В табл. 1 приведены данные опытов выращивания исходного и селекционированного штаммов В.pertussis в стационарных условиях в жидкой полусинтетической среде в присутствии анионообменной смолы, Культивирование ведут в течение 72 ч, Сравнительные результаты культивирования исходного и селекционированного штаммов Bordetella pertussis (табл. 1, Результаты экспериментов показывают, что при .спользовании селекционированного штамма увеличивается концентрация бактерий и повышается лейкоцитозстимулирующая активность супернатантов (0,05>Р>0,02), Полученные данные нашли подтверждение при многократных опытах изучения этих параметров для исходного и селекционированного штаммов.

Из супернатантов выделяют методов кислотного осаждения с последующим растворением осадка в буфере частично очищенные антигенные комплексы, содержащие коклюшный токсин, либо получают высокоочищенные гомогенные препараты коклюшного токсина, используя с незначительными модификациями методику Sekura R. О ет al, Результаты приведены в табл. 2.

Бактериальный рост, лейкоцитозстимулирующая активность супернатантов и выход целевого продукта при использовании исходного и селекционированного штаммов

Bordetella pertussis.

Приведенные в табл. 2 данные показывают, что при использовании селекционированного штамма достоверно повышается концентрация бактерий (0,01>Р>0,002), накопление токсина в среде культивирования (Р<0,001), выход активного белка при получении очищенных антигенных комплексов (0,01>P>0,002) и выход высокоочищенно го гомогенного препарата коклюшного токсина (Р<0,001), Формула изобретения

Штамм бактерий Bordetella pertussis

ГИСК N 203 вЂ” продуцент коклюшного токсина.

1761795

Таблица1

++ штамм после восстановления из высушенного состояния.

Таблица2

Концентрация бактерий

ЛС-активность супернатантов

Выход белка в очищенном АГ-комплексе

Выход высокоочищенного коклюшного токсина тамм

МСЕ/мл к-во к-во к-во тов

Составитель Е.Шмелева