Способ определения антигепариновой активности тромбоцитов

 

Изобретение относится к медицине, а именно к коагулогии, и может быть использовано для лабораторной диагностики нарушения функций тромбоцитов. Цель - повышение чувствительности и упрощение способа. Сущность изобретения: определяют содержание гепарина в пробе до и после АДФ-агрегации тромбоцитов и по разности в содержании гепарина судят об антигепариновой активности тромбоцитов. Положительный эффект: при использовании изобретения позволит повысить чувствительность на 30%.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N ЗЗ/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ! .ъ с

4 фь.

C) (21) 4437003/14 (22) 06,06,88 (46) 07.10.92. Бюл. N 37 (71) Алтайский государственный медицинский институт (72) Р.Э.Такташев, А,B.Ñóâîðoâà, В.Э,Миллер и О.И.Колесникова (56) Лычев B,Ã. // Лабор.дело,— 1974.—

¹ 12.-С, 730 — 732 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕПАРИНОВОЙ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ

Изобретение относится к медицине, а именно к коагулогии, и может быть использовано для лабораторной диагностики врожденных и приобретенных нарушений функции тромбоцитов, для выявления 4 тромбоцитэрного фактора (4ТФ) внутрисосудистого свертывания крови и тромбообразования.

Известен способ определения 4ТФ и антигепариновой активности (АГА) тромбоцитов, основанный на учете действия прогретой, бедной тромбоцитами плазмы крови, содержащей то или иное количество термостабильного 4ТФ, на тромбин-гепариновое время свертывания донорской бедной тромбоцитами плазмы, являющейся источником фибриногена и антитромбинаIII, Степень укорочения тромбин-гепаринового времени свертывания служит мерилом активности 4ТФ. Разницу определяют в секундах, она составляет от 0 до 5 с, в среднем

2,4 + 0,3 с, Аналогичное исследование проводится в плазме. полученной после

АДФ-агрегации, При нормальной функцио. Ы,, 176742О А 1 (57) Изобретение относится к медицине, а именно к коагулогии, и может быть использовано для лабораторной диагностики нарушения функций тромбоцитов. Цель— повышение чувствительности и упрощение способа. Сущность изобретения: определяют содержание гепарина в пробе до и после

АДФ-агрегации тромбоцитов и по разности в содержании гепарина судят об антигепариновой активности тромбоцитов. Положительный зффект; при использовании изобретения позволит повысить чувствительность на 30%. нальной способности тромбоцитов разница составляет больше чем 5 с, а при тромбоцитопатиях зта разница отсутствует или слабо выражена (Лаб.дело, 1974, N 12, с,720).

Известный способ требует тестирования двух нестойких реактивов — тромбина и гепарина; недостаточно точная их подгонка указана самим автором, как основная причина ошибок метода. С целью контроля в способе-прототипе используется донорская плазма с возможными у различных доноров колебаниями уровней фибриногена и антитромбина-III. Кроме того, в плазме доноров присутствуют ингибиторы гепарина, которые, несомненно, могут искажать результаты, а выражение активности 4TcD и АГА в секундах не позволяет судить о конкретных цифрах нейтрализованного гепарина.

Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что определяют содержание гепарина до и после АДФ-агрегации тромбоцитов и по его

1767420

212 тысяч

0,08 ЕД/мл плазмы ребенок

236 тысяч

29

76/

0,1 ЕД/мл плазмы мать

304 тыс.

34о

84 о/

0,09 ЕД/мл плазмы разнице судят об ACA тромбоцитов и активности 4ТФ.

Использование предлагаемого способа позволяет упростить определение АГА тромбоцитов, так как не требуется многocT) пенчатое тестирование нестабильного по своей активности гепарина, а используется стандартный раствор фибриногена вместо субстратной донорской плазмы с непостоянным содержанием фибриногена, антитромбина-!!!, с наличием ингибиторов гепарина в ней, что существенно влияет на воспроизводимость способа-прототипа и, как следствие, делает необходимым проведение повторных исследований крови у тех же лиц с целью верификации полученных результатов. Укаэанных недостатков лишен предлагаемый способ, который, помимо всего, позволяет выразить активность 4ТФ в конкретных цифрах нейтрализуемого им гепарина, Способ осуществляют следующим образом.

У обследуемого силиконированной иглой берут кровь и смешивают ее в силиконированной пробирке с 3,8 раствором цитрата натрия в соотношении 9:1, затем центрифугируют при 1500 об/мин в течение

5 мин. Отбирают богатую тромбоцитами плазму и делят ее на две порции. В одной порции, богатой тромбоцитами, плазмы onределяютАДФ-агрегацию тромбоцитов. После этого исследование обеих порций плазмы проводят параллельно, Богатую тромбоцитами плазму центрифугируют в пластиковых пробирках при 4000 об/мин в течение 20 мин. Берут бедную тромбоцитами плазму и прогревают на водяной бане при 56 С в течение 5 мин. После тепловой дефибринации осаждают фибриноген центрифугированием в течение 10 минут при .4000 об/мин. Надосадочный слой снимают для проведения исследования, В силиконированную пробирку набирают 0,4 мл рабочего раствора тромбина (ак-, тивностью 13 с на стандартном растворе фибриногена в 0,4 буфере Михаэлиса), Рабочий раствор тромбина прогревают на водяной бане при 37 С в течение 2 минут и добавляют к нему 0,2 мл исследуемой дефибринированной плазмы. Сразу включают секундомер. Через 3 мин инкубации этой смеси при 37 С 0,1 мл ее переносят в проРезультаты обследования: — количество тромбоцитов — адгезия тромбоцитов — АДФ-агрегация — содержание гепарина бирку с 0,3 мл раствора фибриногена и регистрируют время свертывания. По калибровочной кривой находят процентное содержание антитромбина-ii!.

5 Во вторую пробирку перед инкубацией при 37 С к 0,1 мл дефибринированной плазмы добавляют 0,15 мл 0,1 -ного раствора протаминсульфата. Во второй пробе определяют процентное содержание антитромбина-III по вышеприведенной методике (Trombos.-diathes Haemost., 1974, v.24, М 1 — 2, рр.224 — 229). Вычисляют разность между показателями первой и второй проб. По калибровочной кривой находят соiS держание гепарина в ед/мл плазмы, соответствующее разнице активности двух проб.

Определение содержания гепарина в плазме, полученной после АДФ-агрегации, проводят по методу (А,С, СССР hL 1448890, 01.09.88).

Далее до разности в содержании гепарина до агрегации тромбоцитов и после нее судят об АГА тромбоцитов или активности

25 4ТФ, выражаемой в ЕД нейтрализованного гепарина/мл плазмы, Пример 1, Б-ная С„9 лет, поступила впервые для обследования. С 8 лет отмечаются носовые кровотечения, экхимозы на туловище и конечностях. Рутинная клиническая коагулограмма нарушений не выявила, Затем была обследована в лаборатории гемоста за.

Результаты; — количество тромбоцитов — адгезия тромбоцитов 50 — АДФ-агрегация 75 — содержание

40 гепарина — содержание гепарина после

АДФ-агрегации 0,079 ЕД/мл плазмы — активность 4ТФ 0,001 ЕД/мл плазмы.

45 Предлагаемый способ позволили диагностировать тромбоцитопатию с нарушением секреции из тромбоцитов 4ТФ, Пример 2, Б-ная И., 5 лет, поступила в клинику с жалобами на частые носовые

50 кровотечения, спонтанные. В семье аналогичной кровоточивостью страдает мать девочки, 1767420 — содержание гепарина после АДФ-агрегации — активность 4ТФ0,073 ЕД/мл плазмы

0,017 ЕД/мл плазмы. 0,09 ЕД/мл плазмы

0,01 ЕД/мл плазмы

Диагноз: наследственная тромбоцитопатия с нарушением АГА тромбоцитов и секреции

4ТФ

Таким образом, с помощью предлагаемого способа удалось не только расшифро- 5 вать генез кровоточивости, но и установить его наследственный характер, что имеет значение для эффективной диспансеризации больных с нарушениями тромбоцитарного звена гемостаза. 10

Пример 3. Б-ная П., 7 лет. Диагноз:

Геморрагический иммунный микротромбоваскулит, кожно-суставно-абдоминальная форма. В клинической картине — типичный васкулитно-пурпурный тип кровоточивости 15 с поражением суставов, с абдоминальным синдромом.

Лабораторные данные: — количество тромбоцитов 330 тысяч 20 — адгезия тромбоцитов 37% — АДФ-агрегация 147% — аутокоагуляцион н ый тест на 10 мин. 108% — этаноловый тест "+++" — суммарная фибринолитическая активность крови 20 — неферментативная 30 фибринолитическая активность крови,4 — содержание гепарина 0,1 ЕД/мл плазмы — содержание гепарина 35 после АДФ-агрегации 0,01 ЕД/мл плазмы — активность 4ТФ 0,09 ЕД/мл плазмы

Таким образом, по лабораторным 40 данным, выявлены гиперагрегация тромбоцитов, гиперкоагуляция, наличие в плазме крови растворимых фибрин-мономерных комплексов, выраженное угнетение неферментативной фибринолитической активности крови, ассоциирующееся с повышенным уровнем активности 4ТФ (антигепаринового). При этом уровень гепарина в плазме крови снижен.

Больной проведена базисная терапия гепарином с дотацией антитромбина-1И в виде трансфузий свежезамороженной плазмы, при этом активность 4ТФ нормализовалась, с восстановлением до нормальных величин других показателей коагулограммы.

В данном случае предлагаемый способ позволил эффективно оценить антигепариновую активность плазмы крови, что способствовало проведению адекватной антикоагулянтной терапии.

Клинические примеры подтверждают чувствител ьность предлагаемого способа, который позволяет осуществить лабораторную диагностику врожденных и .приобретенных нарушений функции тромбоцитов и выявить феномен внутрисосудистого свертывания крови и гиперкоагуляции.

Метод легко воспроизводим в клинических условиях, требует значительно меньше времени на его проведение по сравнению со способом-прототипом.

Результаты исследования приведены в таблице.

Формула изобретения

Способ определения антигепариновой активности тромбоцитов, включающий получение обогащенной тромбоцитами плазмы, проведение АДФ-агрегации тромбоцитов с последующим получением бестромбоцитарной цитратной плазмы, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности и упрощения способа, определяют содержание гепарина в пробе до и после АДФ-агрегации тромбоцигов и по разности в содержании гепарина судят об антигепариновой активности тромбоцитов.

1767420 ж

"„k k

Редактор С,Кулакова

Заказ 3545 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издатепвский комбинат "Патент". г. Ужгород, уа.Гагарина, 101,с. г. т (Составитель Г.Тюнина

Техред М.Моргентал Корректор A,Êîçîðèç