Способ определения чувствительности к иммуномодуляторам

 

Использование: медицина, аллергология , иммунология. Цель: упрощение и повышение точности способа, а также снижение побочного действия. Сущность изобретения: проводят измерение экспрессии поверхностных дифференцировочных антигенов кластера CD 23, а также антигенов главного комплекса гистосовместимости II класса по интенсивности флюоресценции при инкубации с моноклональными антителами ИПО-3 и ИКО-1 в опытных пробах по отношению к контрольным с интегральным учетом интенсивности флюоресценции клеточной суспензии спектрофлюориметрически. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕ ТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G О1 N ЗЗ/483

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4860406/14 (22) 17.08.90 (46) 23.11.92. Бюл. N 43 (71) Всесоюзный научнйй центр радиационной медицины AMH СССР (72) B.Ã,Áåáåøêo, А.А.Чумак, Д,А.Базыка, В,К.Прахова, Н,В.Беляева и Ю.Л,Коноплева (56) int techn. Ыо!, 1989, v.2, N. 1, р. 33 — 38. (54) "ПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ИММУНОМОДУЛЯТОРАМ (57) Использование: медицина, аллергология, иммунология. Цель: уп(эощение и повыИзобретение относится к медицине, в частности к аллергологии и иммунологии, и может быть использовано в биологии, Определение in vitro чувствительности иммунокомпетентных клеток к воздействию иммунокорректоров имеет важное значение в связи с различными эффектами их воздействия на субпопуляции иммунокомпетентных клеток, что приводит к развитию нежелательных побочных эффектов, Известны способы оценки и отбора эдаптогенных препаратов по их эффективности в эксперименте. Способ осуществляется введением экспериментальным животным изучаемых препаратов с учетом их воздействия по летэтельности. Однако указанный способ применим только при определении общих механизмов действия препаратов и не учитывает как индивидуальных особенностей, так и особенностей воздействия нэ иммунную систему.

Известен также способ автоматизированной оценки индивидуальной лекарственной чувс Гви гель ности по свойству

« . Ж 1777078 А1 шение точности способа, а также снижение побочного действия. Сущность изобретения: проводят измерение экспрессии поверхностных дифференцировочных антигенов кластера С0 23, а также антигенов главного комплекса гистосовместимости И класса по интенсивности флюоресценции при инкубации с моноклонэльными антителами ИПО-3 и ИКО-1 в опытных пробах по отношению к контрольным с интегральным учетом интенсивности флюоресценции клеточной суспензии спектрофлюориметрически. 3 табл.

I» лекарственных веществ повреждать мембрану эритроцитов in vitro при инкубации крови с лекарственными препаратами и оценке повреждения спектрофотометрически по скорости реакции кислотного гемолиза, Способ прост в выполнении и информативен, однако не применим к исследованию иммунокомпетентных клеток, а также при тестировании препаратов. не o6- 4 ладающих повреждающим мембрану дей Г ствием. )

IQQ >

Известен способ прогнозирования чувствительности нейтрофилов к иммуномодуляторэм со стимуляцией зимоэаном, продигиозаном, трипсином, пептидогликэнами, лизоцимом, левэмизолом по восстановлению нит роси не го тетразолия с визуальным учетом. К достоинствам способа относится быстрота исполнения, к недостаткам — отсутствие возможности определения чувствительности лимфоиитов и их субпопуляций, применение токсических веществ (пиридин).

1777078 фракции по розеткообразованию с эритроцитами барана (Е-POK и Еа-РОК) и фагоци- . тарной активности. К недостаткам способа 10

15 ки эффективности иммуномодулирующих препаратов в реакции бластной трансфор- 20 мации. Иммунокомпетентные клетки пацииммуномодуляторам производится изме-. рение экспрессии поверхностных дифференцировочных антигенов кластера CD 23, 50

Известны также способы индивидуального прогнозирования эффективности левамизола у больных талассемией путем выделения мононуклеаров, инкубации их с левамизолом (опытная проба) или контрольным раствором и определения в пробах количества Т-лимфоцитов и их активной относится отсутствие стандартизации в связи с зависимостью от качества эритроцитов, применение разнородных методических приемов при оценке количества розеткообразующих и фэгоцитирующих клеток, отсутствие оценки В-клеток.

Наиболее близким к изобретению техническим решением является способ оценента инкубируют с иммуномодулятором или митагеном, после чего исследуют изменения пролиферативной активности по включению 3Н-тимидина с автоматизированным учетом на сцинтилляционном счетчике или подсчитывают количество бластных клеток под микроскопом. Метод считается достаточно информативным, К недостаткам его относятся длительность инкубации (от 72 ч при исследованиях с РНА до 96 ч при исследовании активности иммуномодуляторов. аллергенов и др,) биологически активных веществ, низкая эффективность при исследовании воздействия митогенов на очищенные субпопуляции клеток в связи с необходимостью их предварительного выделения из суспензии мононуклеаров с помощью проточной цитофлюориметрии или другими дополнительными способами с проведением всех указанных этапов в стерильных условиях.

Целью изобретения является упрощение способа и повышение его точности. а также снижение побочного действия.

Указанная цель достигается тем. что в способе определения чувствительности к а также энтигенов главного комплекса гистосовместимости П класса по интенсивности флюоресценции при инкубации с моноклональными антителами ИПО-3 и

ИКО-1 s опытных пробах по отношению к контрольным с интегральным учетом интенсивности флюоресценции клеточной суспензии спектрофлюориметрически, Моноклонэльные антителэ ИПО-3 первоначально разработаны для выявления количе25

45 ственного содержания В-бластов человека, ИКО-1 — для определения количества нормальных и лейкозных клеток, несущих HLADr антигены, Пример. Данные клинико-иммунологического мониторинга больного N., 40 лет.

При обследовании 23.05,90 содержание лейкоцитов 4,6 х 10 в; лимфоцитов 33;4 (1,52 х 10 в 9/л), CD3 + 37,9 (0,57 х 10 в

9/л), С04 + 12,4 g (0,19 х 10 в 9/л), С08 +

20,8 (0,32 х 10 в 9/л), CD4 + /8+ 0,60. CD22

+ 17,9 (0,27 х 10 в 9/л), HLA-Dr + 11,8 (0,18 х 10 в 9/л), У больного взята кровь иэ вены в количестве 5 мл, разведена в 2 раза забуференным раствором Хэнкса (0,1 М фосфатный буфер, рН 7,4). Суспензия мононуклеаров выделена нэ рефрижераторной центрифуге К-80 (ГДР) s градиенте плотности фиколла (Pharmacla Diag nost les) — верографина, d — 1,076. Суспензия доведена до концентрации 1 х 10 клеток в мл на проточном цитоанализаторе Laborscale PSL-1PSA-1 (Венгрия). В лунки 96-луночного планшета (Flow) внесено по 50000 клеток, иэ расчета 1 опытная и 1 контрольная лунки для моноклонального антитела ИПО-3 и столько же для ИКО-1. В опытные лунки внесено по

50 мкл тактивина в концентрации 2 мгlмл.

Планшет инкубировали при 37 С в течение

60 мин, после этого осторожно стряхнули и внесли по 20 мкл моноклональных антител в рабочем разведении. После 45 мин инкубации при постоянном смешивании на вортекс-миксере отцентрифугировали планшет при 100g в течение 5 мин и отмыли 0,97, раствором натрия хлорида. В опытные и контрольные лунки внесли по 20 мкл меченных флюоресцеина изотиоцианатом антител к Fab-фрагментам иммуноглобулинов мыши. инкубировали 60 мин в темноте при перемешивании. После инкубации суспензию клеток отмыли физиологическим раствором, предварительно проверенным на отсутствие флюоресценции, в лунках оставили по 20 мкл клеточной суспензии. Измерение флюоресценции проводили на одноканальном спектрофотометре — флюориметре для 96-луночных планшетов "Suma!

РЕ2" производства Carl Zeiss (ГДР) при длине волны возбуждения 488 нм, светофильтре фотоумножителя с максимумом трансмиссии 530 нм, в качестве стандартного образца испольэовали темное поле, опорных — 3 лунки, заполненных 0,9 раствором натрия хлорида. Результаты получали в виде показателей для каждой пробы, коэффициенты вычисляли по формуле

К =—

Ь

177707) 10

15 ных клеток

25

45 где К вЂ” коэффициент экспрессии (чувствительности к иммуномодулятору);

А — показатель флюоресценции для лунки с иммуномодулятором;

Ь вЂ” показатель флюоресценции для контрольной лунки, Результаты исследования чувствительности к иммуномодуляторам: ИКО-1: К для тактивина 1,19, вилозена 0,99, ИПО-3: К для тактивина 1,05, вилозена 1,02. В соответствии с данными обследования (затяжное течение хронического обструктивного бронхита, сниженное относительное и абсолютное содержание CO3+, CD4+ лимфоцитов, соотношения CD4+/8+, количества клеток, экспрессирующих HLA-Dr, чувствительности субпопуляции к тактивину 1и

vitro) принято решение о назначении курсовой терапии тактивином. После проведенной комплексной терапии с включением тактивина отмечено значительное улучшение клинического состояния, При обследовании 27.06.90 содержание лейкоцитов 5,7 х 10 в 9/л; лимфоцитов 29 (1,65 х 10 в 9/л), CD3 + 44,1 (0.73 х 10 в 9/л), CD4 + 28,4 (0,47х10в9/л), CD8+21,2 (0,35х 10в9/л), С04+/8 + 1,34, CD22 + 26,7 (0,45 х 10 в

9/л), HLA Or+ 22,3 (О. 37 х 10 в 9/л), И КО-1:

К для тактивина 1, 04, вилозена 1.03; ИПО-3:

К для тактивина 1,02, вилозена 1,03. Таким образом, отмечена корреляция между данными исследования in vitro и клинической эффективностью. Отдаленные результаты терапии изучены через 6 мес. и показали удовлетворительное состояние больного и нормальные значения показателей иммунного статуса.

В табл.1-3 представлены данные сопоставительного анализа исследования чувствительности к тактивину, вилозену, предниэолону, по способу-прототипу и заявляемому способу, Как видно из табл.1, отмечена корреляция экспрессии HLA-Dr антигенов (антитело

ИКО-1) при исследовании суммарной флюоресценции клеточной суспензии при инкубации с иммуномодулятором и индекса включения 3Н-тимидина при инкубации с

PHA и тактивином, Экспрессия антигена

CD23 (антитело ИПО-3) по данным суммарной флюоресценции коррелирует в меньшей степени, что связано с тем. что антиген характерен для В-иммунобластов и отражает активацию В-звена, наступающую в результате изменений Т-звена иммунитета.

Из табл.2-3 видно, что использование заявляемого способа возможно при определении чувствительности к различным модуляторам, обладающим как стимулирующим, так и ингибирующим действием на пролиферативную активность иммунокомпентентУказанный способ использован в Институте клинической радиологии ВНЦРМ

AMH СССР при исследовании чувствительности к иммуномодуляторам (тактивин, вилоэен) более чем у 800 больных с проявлением иммунодефицитов. подвергшихся воздействию ионизирующих и неионизирующих излучений. Отмечена положительная коррелятивная зависимость с результатами назначения в необходимых случаях иммунокорригирующей терапии (r—

0,76), что свидетельствует о полученном положительном эффекте — улучшении состояния здоровья больных, Формула изобретения

Способ определения чувствительности к иммуномодуляторам, включающий инкубацию иммунокомпетентных клеток с испытуемым препаратом, с последующей оценкой функционального состояния клеток по регистрируемому биофиэическому показателю,отличающийсятем.что,сцелью повышения точности способа, его упрощения, а также снижения побочного действия, инкубацию проводят в присутствии моноклональных антител ИКО-1 и ИПО-3. а функциональное состояние клеток оценивают по уровню флуоресценции, при этом регистрируют величину флуоресценции в пробе, не содержащей испытуемый препарат, и в пробе с препаратом и затем рассчитывают их. соотношение.

177707

Таблица 1

Сравнительный анализ результатов исследования чувствительности к тактивину (концентрация 2 мгlмл) в реакции бластной трансформации и по измерению флюоресценции клеточной суспензии с моноклональными антителами

ИПО-3 и ИКО-1 спектрофлюориметрически на анализаторе "Sumal РЕ2" (Carl Zeiss, ГДР), No пlп

Индекс активации в РБТЛ

Коэффициент экспрессии с моноклональными антителами

Номер исследования

РНА, 100 мкг/мл

РНА+ тактивин

И ПО-3

ИКΠ— 1

0,79

0,58*

0,83*

* При расчете не включались данные по наблюдению No90 3456 диагноз — острый лимфобластный лейкоз) в связи с особенностями экспрессии антигенов в зависимости от типа моноклональной пролиферации, Таблица 2

Сравнительный анализ результатов исследования чувствительности к вилозену (концентрация 5 мг/мл) в реакции бластной трансформации и по измерению флюоресценции клеточной суспензии с моноклональными антителами

ИПО-3 и ИКО-1 спектрофлюориметрически на анализаторе "Sumal РЕ2" (Cari Zeiss) . 1

3

5

7

9

11

12

13

14

Коэффициент корреляции по отношению к га e4r

90/3448

90/3449

90/3450

90/3451

90/3452

90/3453

90/3454

90/3455

90/3456

90/3457

90/3458

90/3459

90/3460

90/3461

90/3462

8,66

20,17

22.63

13,43

12,37

11,91

17,35

22,71

5,03

23.88

22.34

20,71

20,23

17,15

14,80

9,59

18,19

23.29

16,58

9,69

10,39

11,12

19,76

5.83

17,80

22,01

20,43

11,27

9,68

16.32

1,21

1,07

1,20

1,00

0,84

0,78

1,06 .

1,11

2,60

1.22

1,26

1,17

1,13

1,00 l,00

0,92

1,21

1,80

1,06

0,83

0.92

0,94

0,99

4,51

0,95

1.30

1,13

1,05

0,88

1,02

177707

1аблИ ца 3

Сравнительный анализ результатов исследования чувствительности к предниэолону (концентрация 3 мкг/мл) в реакции бластной трансформации и по измерению флюоресценции клеточной суспензии с моноклональными антителами

ИПО-3 и ИКО-1 спектрофлюориметрически на анализаторе "Sumaf РЕ2" (Carl Zeiss) Составитель Д.Базыка

Техред М.Моргентал Корректор И.Шулла

Редактор Г.Бельская

Заказ 4119 Тираж Подписное

8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-vë ят льский комбинат "Патент", г. ужгород, ул,Гагарина, 101