Способ определения холестерина

 

Использование: медицина, ферментативный анализ. Цель изобретения - повышение точности способа. Сущность изобретения: процесс осуществляют в две стадии, на первой из которых ведут обработку образца при температуре 20-55°С в течение 2-20 мин реагентом, содержащим холестеринэстеразу, буферную смесь и детергент, при этом происходит гидролиз этерифицированного холестерина. На второй стадии осуществляют окисление холестерина с помощью холестериноксидазы и регистрацию скорости образования пероксида водорода . Регистрацию ведут хемилюминесцентным методом. 9 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4850152/14 (22) 22,05,90 (46) 15,01.93, Бюл, ¹ 2 (71) МГУ им. М.В.Ломоносова (72) Ю, В. Родионов, Н.Ю. Филиппова, А,Ф,Духович и Н.Н,Угарова (56) EP N 265933, кл. С 12 Q 1/60, 1988. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ XOflЕСТЕРИHA (57) Использование: медицина, ферментативный анализ. Цель изобретения — повыИзобретение относится к области ферментативного анализа и может быть использовано в клинических исследованиях при диагностике атеросклероза, диабета, мочекаменной болезни, функциональных расстройств печени и некоторых инфекционных заболеваний.

Известен также способ определения холестерина, основанный на измерении скорости выделения пероксида водорода.

Определение холестерина данным способом, который по своей сути наиболее близок к заявляемому изобретению, выполняется следующим образом. Аликвота исследуемого образца, например сыворотки крови, вносится в измерительную кювету спектрофотометра, содержащую реакционную смесь следующего состава:

Буферная смесь 0,1 М, рН 5--9

Субстраты пероксидазы

Соли желчных кислот 1-20 мМ, Неионные детергенты — 0,1-10 г/л

Холестеринэстераза 100 — 30000 ед/л

Холестериноксидаэа 100 — 30000 ед/л

„,5U 1788467 А1 (я)з G 01 N 33/48, 33/92, С 12 Q 1/60, 1/28, 1/46 шение точности способа, Сущность изобретения: процесс осуществляют в две стадии, на первой из которых ведут обработку образца при температуре 20 — 55 С в течение

2 — 20 мин реагентом, содержащим холестеринэстеразу, буферную смесь и детергент, при этом происходит гидролиз этерифицированного холестерина. На второй стадии осуществляют окисление холестерина с помощью холестериноксидазы и регистрацию скорости образования пероксида водорода. Регистрацию ведут хемилюминесцентным методом. 9 табл.

Пероксидаза 2500 ед/л, Далее проводят регистрацию изменения оптической плотности при температуре 2040 С в течение 2 — 15 мин.

Недостатки рассматриваемого способа определения холестерина заключаются в следующем.

Оптимальные условия проведения реакций гидролиза и окисления не идентичны V (не совпадают оптимум рН, температурный СО оптимум, концентрации детергентов), что,QQ приводит к использованию больших количеств ферментов. 1

Проведение определения холестерина рассматриваемым способом основано на одновременном проведении 3-х последовательных реакций. Исходно в исследуемых а образцах содержится как этерифицированный, так и неэтерифицированный холестерин, причем соотношение, этих форм холестерина может меняться в зависимости от сыворотки. Кроме того, скорость гидролиза этерифицированного холестерина холестеринэстеразой зависит от длины и

1788467 степени насыщенности остатка жирной кислоты. Поэтому начальная скорость образования пероксида водорода зависит не только от общей концентрации холестерина, но и от соотношения разных форм холестерина в образце, что приводит к снижению точности определения.

Целью изобретения является повышение точности определения, Поставленная цель достигается предложенным способом, заключающимся в том, что исследуемую пробу добавляют s водную среду инкубации состава: не менее 0,01 м/л буфера с рН 6,5-8,0; не менее 5 г/л холевокислого натрия и не менее 10 ед/л холестеринэстеразы, инкубируют не менее 2 мин при 25 — 55 С, после чего аликвоту инкубационной смеси вносят в измерительную кювету. содержащую не менее 0 01 м/л при рН

8,0 — 8,6, не менее 0,003 ед/л пероксидазы, не менее 0,5 ед/л холестериноксидазы, не менее 0,1 г/л и-йодфенола и не менее 0,1 г/л люминала, с последующей регистрацией скорости образования пероксида водорода хемилюминесцентным методом.

Предложенный способ отличается от известного порядком проведения операций, а именно, разделением стадии гидролиза и экстракции со стадией окисления, что дает возможность осуществлять гидролиз в оптимальных условиях при температуре 25— о Ф

55 С не менее 2 мин, соотношением реагентов s гидролизующей и окисляющей смесях, а также тем, что регистрация скорости образования пероксида водорода осуществляется хемилюминесцентным методом.

Указанные отличительные признаки позволяют повысить чувствительность определения, Пример 1, К 0 02 мл сыворотки крови добавили 1,8 мл гидролизующей смеси (смесь 1: 0,1 M трис-HCI., 15.0 г/л холевокислого натрия, 0,05 ед/мл холестеринэстеразы, рН 7.,2). После перемешивания инкубировали 20 минут. Затем из полученного раствора отбирали 0,1 мл и добавляли в измерительную кювету люминометра LKB

1250, доводили до обьема 1,0 мл смесью 2 (смесь 2: буфер 0,1 M трис-HCI, рН 8,2, содер>кащий 3,0 г/л холевокислого натрия, 0,5 ед пероксидазы, 0,05 ед холестериноксидазы, 0,1 г/л п-иодфенола, 0,1 г/л люминала), Перемешивали и через одну минуту фиксировали интенсивность люминесценции.

Пример 2. Условия измерений те же, что и в примере 1, за исключением того, что изменяли концентрацию пероксидазы. данные, приведенные в таблице 2, получены

25 ные представлены в табл. 5.

30 Из данных, приведенных в табл, 5, сле35

50

5

15 для стандартной сыворотки с концентрацией холестерина 6,1 мкМ.

Из данных, приведенных в табл. 2, следует, что оптимальными концентрациями пероксидазы.при анализе являются концентрации не менее 0,003 ед/л.

Пример 3. Условия измерения те же, что и в примере 1, за исключением того, что изменяли концентрацию холестериноксидазы. Результаты измерений приведены в таблице 3 для стандартной сыворотки с концентрацией 6,1 мкМ.

Из данных, приведенных в табл. 3, следует, что оптимальными являются концентрации холестериноксидазы не менее 0,5 ед/л, Пример 4. Условия измерений те же, что в примере 1, за исключением того, что изменяют концентрацию п-йодфенола. Данные приведены в табл, 4, Из данных, приведенных в табл. 4, следует, что оптимальной концентрацией ийодфенола является концентрация не менее

0,1 г/л, Пример 5. Условия измерения те >ке, что в примере 1, за исключением того, что изменяют концентрацию люминола. Дандует, что оптимальной концентрацией люминала является концентрация не менее 0,1 г/л.

Пример 6. Условия проведения эксперимента аналогичны таковым в примере

1, за исключением того, что при анализе стандартной сыворотки (5 мМ) используют различные значения рН при проведении первой стадии реакции гидролиза. Результаты измерений приведены в табл. 6.

Из полученных данных следует, что оптимальные значения рН для проведения реакции гидролиза составляют 6,5-8,0.

Пример 7, Условия эксперимента аналогичны условиям в примере 1, за исключением того, что используют различные концентрации холевокислого натрия в гидролизующей смеси, Результа ы измерений приведены в табл. 7.

На основании данных, приведенных в табл. 3, оптимальная концентрация холевокислого натрия в гидролизующей смеси составляет 5 — 20 г/л.

Пример 8. Условия проведения эксперимента аналогичны таковым в примере

1, за исключением того, что изменяют температуру, при которой проводится гидролиз (табл. 8).

Из данных, приведенных в табл, 8 следует, что полный гидролиз этерифицированного холестерина достигается при

1788467

Таблица1

Таблица2 температуре 25 — 55" С при концентрации холестеринэстеразы из поджелудочной железы в гидролизующей смеси 2 г/л (активность холестеринэстеразы 30 ед/л).

Пример 9. Условия эксперимента те же, что в примере 1, за исключением того, что изменяют концентрацию холестеринэстеразы в смеси. Данные представлены в табл, 9, На основании данных, приведенных в табл. 9, оптимальная концентрация холестеринэстеразы составляет не менее 10 ед/л при температуре 45- С и времени гидролиза

10 мин.

Ф ормула изобретения

Способ определения холестерина, включающий инкубацию исследуемой пробы в среде, содержащей буфер, субстрат пероксидазы, соль желчных кислот, холестеринэстеразу, холестериноксидазу и пероксидазу и последующую регистрацию скорости образования перекиси водорода, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения

5 точности способа, исследуемую пробу добавляют в водную среду инкубации, содержащую буфер с рН 6,5-8,0 в концентрации не менее 0,01 М, холевокислый натрий в концентрации не менее 5 г/л. холестеринэ10 стеразу не менее 10 ед/л, инкубируют не менее 2 мин при 25 — 55 С, затем аликвоту инкубационной смеси вносят в измерительную кювету, содержащую буфер с рН 8,0-8,6 в концентрации не менее 0,01 М, холевокис15 лый натрий в концентрации не менее 1 г/л, пероксидазу не менее 3 ед/л, холестериноксидазу не менее 0.5 ед/л, и-иодфенол в концентрации не менее 0,1 г/л и люминол в концентрации не менее 0,1 г/л, а регистра20 цию проводят путем измерения хемилюминесценции.

1788467

Табл ицаЗ

Та блица4

Таблица5

Таблица 6

Таблица8

Таблица9

1788467

Таблица7