Способ получения экзотоксинсодержащего препарата из раствора

 

Использование: биотехнология, производство экзотоксинсодержащих препаратов. Сущность изобретения: культивируют продуцент экзотоксина Bacillus thurlngiensls затем культу pa ль ну ю жидкость фильтруют для удаления остатков питательной среды и концентрированияее с помощью ультрафильтрационных мембран с различными размерами пор 5000-10000 Да, затем в концентрате устанавливают рН 4,5-5,5,0 упаривают до содержания сухих веществ 2,4-4,8 г/л и повторно проводят ультрафильтрацию на тех же мембранах. 10 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБПИК (я)5 А 01 N 63/00

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР ГОСПАТЕHT СССР)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I л

K АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4751765/13 (22) 17.10.89 (461 07,02.93. Бюл, N 5 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (72) А. А. Соломин, Н, А. Усачев, Ф. LU. Исангалин, В, А. Чугунов и Г. 3. Короткая (56) Авт, свид. ¹ 885533884488, кл. С 12 N 1/00, 1980.

ТУ на Витоксибациллин. ТУ вЂ” 64 — 15 — 01—

87. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКЗОТОКСИНСОДЕРЖАЩЕГО ПРЕПАРАТА ИЗ РАСТВОРА

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при производстве экзотоксинсодержащих биологических препаратов -" средств защиты растений, Производимые в настоящее время экзотоксинсодержащие препараты типа битоксибациллина характеризуются низким

0,2 — 0,4 вес,% содержанием основного энтомопатогенного агента — экзотоксина. Для повышения его содержания был предложен способ, в соответствии с которым спорокристаллический комплекс и остатки питательной среды отделяются центрифугированием (фильтрацией), зкзотоксин переводится в осадок гидроксидом кальция, осадок отделяется центрифугированием (фильтрацией) и высушивается.

Такой способ имеет ряд недостатков, основными из которых являются неполное осажд ние экзотоксина гидроксидом каль5U, 1792613 А1 (57) Использование: биотехнология, производство экзотоксинсодержащих препаратов, Сущность изобретения; культивируют продуцент экзотоксина Bacillus thurlnglensis затем культуральную жидкость фильтруют для удаления остатков питательной среды и концентрирования ее с помощью ультрафильтрацибнных мембран с различными размерами пор 5000 — 10000 Да, затем в концентрате устанавливают рН 4,5-5,5,0 упаривают до содержания сухих веществ 2,4-4,8 г/л и повторно проводят ультрафильтрацию на тех же мембранах. 10 табл. ция, что приводит к его потере более 50, Использование гидроксида кальция усложняет способ и ведет к увеличению стоимости препарата за счет технологических затрат.

Целью настоящего изобретения является снижение себестоимости единицы веса Я препарата. ©

Поставленная цель достигается тем, а что; 6д — нерастворимые в воде остатки питательной среды и присутствующие в растворимом состоянии высокомолекулярные соединения удаляются с помощью ультрафильтрации культуральной жидкости на мембранах с размерами пор по пропусканию белков с молекулярным весом (500010000) Да; — рН фильтрата доводят до 4,5 — 5,5, упаривают до концентрации экзотоксина (2,4—

4,8) г/л и выпавший осадок отделяют ультрафильтрацией на мембранах с разме1792613

28 — 30 С ром пор по пропусканию белков с молекулярным весом (5000 — 10000) Да, Сущностью данного способа является применение ультрафильтров с размером пор по пропусканию белков с молекулярным весом (5000 — 10000) Да, что дает возможность очистки экзотоксина от сопутствующих высокомолекулярных веществ с минимальными потерями.

Способ заключается в том, что применение мембран с размером пор по пропусканию белков (5000 — 10000) Да позволяет повысить содержание экзотоксина в препарате с минимальными потерями.

Упаривание экзотоксина при рН 4,5 — 5,5 до концентрации экзотоксина (2,4 — 4,8) г/л позволяет очистить экзотоксин от балластных веществ, прошедших через мембрану (нуклеотиды, пептиды и т.п,), повторной ультрафильтрацией. 20

Пример 1. Культивирование микроорганизмов Вас. thuringiensis штамм 98 — 1с проводили в ферментаторе объемом 8 л на дрожже-полисахаридной питательной среде (ДПС) следующего состава, :

25 дрожжи кормовые 3,0 мука кукурузная 1,5 синтетический пеногаситель 0,08 при следующих условиях; 30 тем и е ратура культивирования частота вращения мешалки 200-300 об/мин избыточное давление 0,4 — 0,5 атм расход воздуха 0,1 л/ч

Содержание сухих веществ в полученной культуральной жидкости (КЖ) составляло 2,8 г/л, рН КЖ (6,0-0,5) ед. рН, а содержание экзотоксина 0,43 г/л. 40

После ферментации из КЖ удаляли остатки питательной среды методом тангенциальной фильтрации на ультрафильтрационных мембранах с различными размерами пор, в диапазоне (4500-0,1), Разделение проводили 45 в следующих условиях: скорость тангенциального потока (2,0-5,0) л/с температура КЖ (25+-5) С трансмембранное 50 давление (0,2+-0,02) М ПА

Потери экзотоксина (г/л) и его содержание(г/кг) в сухом концентрате после ультрафильтрации на мембранах с разными диаметрами пор показаны в табл, 1, 55

Экзотоксин, выделенный в виде фильтрата, упаривали до его содержания в концентрате фильтрата 2,4-4,8 г/л при рН

4,5 — 5,5, что позволило очистить экзотоксин от балластных веществ, прошедших через мембрану (нуклеотиды, пептиды и т,п.), повторной ультрафильтрацией.

Данные представлены в табл. 2, где приведены потери экзотоксина (г/л) и его содержание (г/кг) в сухом концентрате после очистки фильтрата в зависимости от содержания экзотоксина в концентрате фильтрата (г/л), Выбор допустимого измерения рН раствора выбран на основании данных, представленных в табл, 3, где приведено содержание (г/кг) экзотоксина в сухом концентрате после очистки фильтрата в зависимости от его рН.

Затем полученный фильтрат высушивали распылом, либо упаривали в 8 — 10 раз по объему. В первом случае предварительно в фильтрат добавляли фосфорнокислый аммоний (10% вес. по сухим веществам) в качестве диспергатора и клей КМЦ (5 вес. по сухим веществам) в качестве поверхностноактивного вещества, Концентрация экзотоксина в сухом препарате составила 3,9 вес.

ЛК вЂ” 50 на комнатной мухе — 0,006 . Во втором случае после упаривания в раствор добавляли 0,1 объема диметилсульфоксида (ДМСО) и 0,005 / объема бриллиантового зеленого в качестве стабилизатора экзотоксина и консерванта и клей КМЦ (5 вес. по сухим веществам) в качестве поверхностноактивного вещества. Концентрация экзотоксина в жидком препарате составила 10 г/л (1%), ЛК вЂ” 50 на комнатной мухе — 0,01, Пример 2, Выращивание культуральной жидкости Вас. thuringlensis штамма

202-1с проводили в ферментаторе обьемом

8 л на поликомпонентной питательной среде (П П С) следую щего соста на, : дрожжи кормовые 2,8 мука кукурузная 1,4 кальций хлористый 0,3 гидролизат шрота хлопкового 3,0 зеленая патока 1,0 синтетический пеногаситель 0,03

Культивирование проводили при условиях, описанных в примере 1, Содержание сухих веществ в полученной КЖ составляло

2,2 г/л, pH=(6,0+-0,5) ед. рН, содержание экзотоксина — 0,28 г/л, Из полученной КЖ был получен экзотоксин в соответствии с условиями примера 1, данные представлены в табл. 4 — 6, Потери экзотоксина (г/л) и его содержание в сухом концентрате (r/êã) после ультрафильтрации на мембранах с разными размерами пор, Потери экзотоксина (г/л) и его содержание (г/кг) в сухом концентрате после очистки фильтрата в зависимости от содержания зкзотоксина в концентрате фильтрата (г/л), 1792613

30

Таблица 1

Содержание (r/êã) экзотоксина в сухом концентрате после очистки фильтрата в зависимости от его рН, Затем полученный фильтрат высушива- 5 ли распылом, либо упаривали в 2 — 3 раза по объему и далее поступали так же, как и в первом примере. Концентрация экзотоксина в сухом препарате составила 3,5 вес.

ЛК вЂ” 50 на комнатной мухе — 0,006 . Концен- 10 трация экзотоксина в жидком препарате составила 8 г/л (0,8 ). ЛК вЂ” 50 на комнатной мухе — 0,1 4.

Содержание и потери экзотоксина измерялись с помощью тонкослойной хрома- 15 тографии и спектрофотометрирования при длине волны 260 нм по способу (2). Ошибка измерений не превышала+-3; . ЛК вЂ” 50 рассчитывалась по методу Кербера (3).

Расчет себестоимости единицы продукции экзотоксинсодержащего препарата проведен на основании данных по стоимости оборудования, материалов, сырья.

Формула изобретения

Способ получения экзотоксинсодержащего препарата из раствора путем концентрирования, отл ич а ю шийсятем, что, с целью снижения себестоимости целевого продукта, концентрирование осуществляют

Перечень оборудования, необходимого для получения экзотоксинсодержащего препарата, представлен в табл, 8, где приведены наименование и стоимость оборудования, применяемого при получении экзотоксинсодержащего препарата.

Нормы расхода сырья и материалов для получения экзотоксинсодержащего препарата представлены в табл. 9,где показаны нормы расхода сырья и материалов на получение единицы веса экзотоксинсодержащего препарата

На основании приведенных данных видно, что отличие в затратах по получению сухих и жидких препаратов заключается в разных соответствующих расходах электроэнергии и материалов. С учетом этого можно подсчитать разницу в ценах единиц продукции препарата, полученного разными способами (см. табл, 10).

Таким образом, применение данного способа позволяет снизить себестоимость препаратов при сохранении его потребительских характеристик ультрафильтрацией на мембранах с размером пор по пропусканию белков с мол. м.

5000 — 10000 Да, в полученном концентрате рН устанавливают 4,5 — 5,5, затем концентрат упаривают до содержания экзотоксина

2,4 — 4,8 г/л и повторно проводят ультрафильтрацию на вышеуказанных мембранах.

1792613

Таблица 2

П р и м е ч а н и е. Размер пор мембраны равен 10000 Да, рН фильтрата 5,0, Таблица 3

П р и м е ч а н и е. Степень концентрирования равна 10, размер пор мембраны 10000 Да

Таблица 4

1792613

Таблица 5

П р и м е ч а н и е. Размер пор мембраны равен 100РО Да, рН фильтрата 5,0

Таблица 6

П р и м е ч а н и е. Степень концентрирования равна 10, размер пор мембраны 10000 Да

Таблица 8

1792613

Таблица 9

У ельные о да

Наименование сырья, материалов и энергоресурсов, единица измерения

Г1редлагае- ип мый спос Г. б

1 СЫРЬЕ И МАТЕРИАЛЫ питательная среда

Са(ОН)2, xr хлористый барий углекислый аммоний, 2 ЭНЕРГОРЕСУРСЫ

Пар перегретый, р =075 МПА

1 = (185 + - 5) С, ГКал

Вода питьевая, хозяйственная, куб.м

Сжатый воздух, тн/м

Холод:

- захоложенная вода, р = (0,27 — 0,3) ГКал

- оборотная вода, куб.м

Электроэнергия, Квт ч/усл.т

Стоцные воды, куб.м

Теплоэнергия, ГКал/усл.т

Неиэмен H ы

0,008

30+-5

30 i-5

150+-10

40+-10

150+-10

40+-10

Y

600+ - 270,и "7

600+ - 270

1". 3

80+ - 26

18+ 4

Таблица 10

Составитель А.Соломин

Редактор Т.Никольская Техред M.Mîðãåíòàë Корректор Е.Папп

Производственно-издательский комбинат "Патент . г Ужгород, ул.Гагарина !01

Заказ 464 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКН Г СССР

113035, Москва, Ж-З5, Раушская наб., 4/5