Штамм бактерий bacillus мyсоidеs для получения препарата против возбудителей заболевания картофеля
Использование: сельскохозяйственная микробиология, получение средств защиты картофеля от болезней. Сущность изобретения: использование штамма Bacillus mycoldes ВНИИСХМ № 137 для получения препарата против возбудителей болезней картофеля. Штамм выделен из белковых клубней картофеля: выращивается на МПА при 28°С. Усваивает глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, маннит, ксилозу, использует нитратные, аммонийные формы источников азота. Препарат получают, выращивая штамм на кзртофельно-f люкозной среде при 28°С в течение 48 ч. Концентрацию клеток в суспензии доводят до 107 - 108 на 1 мл. Наибольший эффект отмечен против фузариозной, резиновой и мокрой гнили. Патологический процесс в клубнях при использовании препарата снижается на 40,2-86,4%. 4 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАР CT В Е ННЫ и КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕН ИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4826595/13 (22) 21.05.90 (46) 30.10.92. Бюл, N. 40 (71) Институт экспериментальной ботаники им, В,Ф.Купревичэ (72) Н.А,Дорожкин, Л.M.Íîâèêîâà, И,В.Викторчик, С.И.Бельская, В.С,Колесников и
И.И,Кедрова (56) J.Basic, Microblol, 1987, 27, М 9. р, 515519. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ВАСИ LUS
MYC0iDES ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА
ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЗАБОЛЕВАНИЯ
КАРТОФ ЕЛЯ (57) Использование:. сельскохозяйственная микробиология, получение средств защиты картофеля от болезней. Сущность иэобретеИзобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, защите растений и может быть использовано для борьбы с фитопатогeHHbIMN микроорганизмами, поражающими картофель, Известен ряд штаммов бактерий родэ
Bacillus, являющихся антагонистами различных возбудителей болезней сельскохозяйственных культур. Штамм ВасШоз
thurlnglensis ИПМ-216 обладает фунгицидным действием в отношении фитопатогенных грибов. Штамм Bacillus subtliis В-116 оказывает антагонистическое действие на грибы Pythium u Rhysoctonia. Штаммы
Baciilus mesenthericus 1701 и Bacillus
poIymyxa — обладают антагонистическим действием на возбудителей корневой гнили пшеницы, Штамм Bacillus subtilis подавляет возбудителей белой гнили подсолнечни. Ж 177)639 А) (5>>s А 01 N 63/ОО, С 12 N 1/26 ния: использование штамма Bacillus п>усоЫез ВНИИСХМ >ч . 137 для получения препарата против возбудителей болезней картофеля, Штамм выделен из белковых клубней картофеля: выращивается на МПА при 28 С. Усваивает глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, маннит, ксилоэу, использует нитратные, аммонийные формы источников азота. Препарат получают, выращивая штамм на картофельно-глюкозной среде при 28 С в течение 48 ч. Концентрацию клеток в суспензии доводят до 10—
7 l0 на 1 мл. Наибольший эффект отмечен против фузариозной, резиновой и мокрой гнили, Патологический процесс в клубнях при использовании препарата снижается на
40,2-86,4%. 4 табл. ка, Однако зти штаммы оказывают ограниченное действие, направленное на отдель- ("- ных грибных возбудителей болезней различных сельскохозяйственных культур.
Наиболее близким к предлагаемому штамму является штамм бактерий Bacillus
cereus — антагонистический микроорганизм ъ против грибов Cuivularla pallescens, Macrophomina phaseolt. ColIetotrlchum
gIoesporIdes.
Недостатком известного штамма является его узкий спектр действия только на указанные грибы, поражающие кукурузу и маниок, и неспособность воздействовать на другие фитопатогенные грибы и бактерии, в частности на патогенную микрофлору кар-; тофеля.
Целью изобретения является получение нового штамма бактерий, обладающего бо1771639 лев широким спектром антагонистической активности на возбудителей болезней карТофЕЛЯ.
Это дОстиГается с помощью штамма
Bacillus mycoIdes 683 (син. ВасИЬз cereus 5 чаг. mycoldes (Flugge) SmIth.). Штамм получен в 1984 году в лаборатории низших растений ИЭБ им, В.Ф. Купревича АН БССР путем выделения в культуру из клубня картофеля с симптомами бактериальной гнили. 10
Штамм депонирован в коллекции культур микроорганизмов ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под регистрационным номером 133 в группе споровых микроорганизмов 2/П-" 990 r. 15
Культурально-морфолотические признаки.
Клетки грамположителькые, прямые неподвижные палочк" 5-10 х 0,8 — 1,2 мкм; образует спорь. П л культивировании при 20 о
28 С в течение 3 суток характеризуется следующим ростом: на мясопептокном агаре (МПА) рост обильный; колонии разрастаются слоем по поверхности субстрата, имеют характерное 25 мицелиальное строение, серовато-белые, матовые, складчатые с волнистыми краями; ка Глюкозосолевой среде M/9 (состав среды указан ка с. 4 описания) колонии сухие, серо-белые, матовые, в центре морщи- 30 нистые, к краям плоские, неровные; ка среде Фриза рост слабый, колонии тонкие, плоские, белые, матовые, стел ощиеся с ровной бугристоватой поверхностью и почти ровными краями, 35
На жидкой среде {мясо-пегпонный бульон МПБ) рост в виде хлопьевидной пленки на поверхности среды, выпадающей в осадок на 6 — 7 сутки, Среда остается прозрачной. 40
На ломтиках картофеля дает рост, Колонии складчатой формы имеют кремовчю Окраскуу.
Физиолого-биохимические признаки, Хорошо усваивает углеводы: глюкозу, 45 сахарову, мальтозу, лактозу. маннит, ксилозу с выделением кислоты. Из галактозы кислоту не образует.
Потребляет неорганический азот в форме нитратов (йлМОЗ, КМОЗ,) и аммокийный 50 (NHqCl). Развивается в присутствии органи- . ческих источников азота: пептока, дрожжевого экстракта, Разлагает белок с образованием аммиака.
Гидролизует крахмал, нитраты восстанавливает до нитритов, икдол не образует, желатину разжижает, молоко не свертывает.
Образует к""Tà Iýsó, Аэроб. Оптлмальный рост при температуре 28 С. Реакция
Фогес-Проскауера положительная.
Штамм хранится ка агариэованной среде (минеральной или картофельной) в холодильнике с периодическими пересевами, Безвредность (токсигеккость).
Исследования по Определению токсигенности проводились ка беспородных белых мышах при пероральном л внутрибрюшинном введенил, На квжд:.й опыт tlpM различных путях введения бы о взято по 10 животных, Для получения суспензии бактерии выращивали на косяках с
КаРтсфЕЛЬНЫМ аГаРОМ В тЕЧЕНИ= СУТОК ПРИ температуре 28 С, после чего см. вали стерильной дистиллированной водой. Количество бактерий в суспекэии Определяли по оптическому стандарту мутности.
Культуралькый фильтрат получали путем центрифугирования при 6 тыс. об /мик в течение 20 мин культуоы бактерий, выра-. щенной на жидкой среде Чапека в течение
48 час при темпер,.туре 28 С, Для определения вирулекткости бактерий животным вводили суспекзию с титром и от, 10 до 1 10 микробных тел/мл в количестве 0,5 мл.внутриброшикно и 1,0 мл перорально, ЛДао рассчитать ке удалось иэза отсутствия гибели животных.
Определение токсигеккости исследуемого штамма бактерий проводили путем введения стерильного культурального фильтрата белым мышам внутрибрюшинно в количестве 0,5 мл и 1,0 мл перорально.
ИЭМЕНЕНИЯ ПОВЕДЕНИЯ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО состояния животных не отмечено.
При проведении испытаний предлагаемого штамма бактерий случаев заболевания людей или животкы", не было установлено.
Штамм Bacillus mycoides 683 не патогенен для теплокровных организмов.
Исследования вируленткпсти и патоГенности для картофеля проводили на сортах Белорусский ранний, Огонек и Теми путем искусственного заражения клубней, Для этого промытые, обработанные спиртом и обожженные целые клубни картофеля механически повреждались штампом на глубину 10 мм в пуповинной части. В полученные углубления пипеткой вводили 03 мл бактериальной суспензии 1-2-х суточной культуры в концентрации 10 млн бактериальных клеток в 1 мл стерильной дистилированной воды. Для каждого образца берется
10 клубней. В контрольный образец с механическим повреждением вводится стерильная вода. Клубни укладывают во влажные камеры и выдерживают при температуре
28 С в течение 8-10 дней, после чего и рово1771639 дят учет индекса пара>кения. Проведенные испытания показали полную авирулентность штамма Bacillus mycoldes 683 для всех исследуемых сортов картофеля, Пример 1. Выявление бактериальных 5 штаммов, обладающих антагонистическими свойствами проводили методом отсроченного антагонизма на глюкоза-солевой среде
М-9. Состав среды: 30 мл солеваго концентрата (NazHPO< — 6,0; КН2РΠ— 3,0; NaCI — 10
0,5; NH Испытуемые «а антагонизм бактерии 15 засевают пятнами Д 0,3 — 0,5 см на застывшую среду в чашки Петри. Инкубируют 48 час., после чего культуры убивают парами хлороформа (30 мин), Чашки проветривают в течение часа и засевают тест-культурой, 20 Чашки помещают в термастат на 24 часа, если тест-культура — бактерия, и на 72 часа для грибов, после чего выявляют наличие антагонистических штаммав, вызывающих вокруг своих колоний зоны антагонизма 25 тест-кул ьтур. Всего исследовано более 200 штаммов различных бактерий, выделенных иэ стеблей и клубней картофеля. Отобрано 5 штаммов рода Bacillus, обладающих 30 антагонистическими свойствами в различной степени (табл, 11. Из них наиболее антагонистическим эффектом и спектрам ингибируемых фитопатагенов обладает штамм Bacillus mycoldes 35 683. Он оказывает антагонистическое воздействие на ряд грибов и бактерий, участвующих в патогенезе клубневых гнилей картофеля, таких как Fusarlum sambuclnum, Fusarlum avenaceum, F.culmorum, F.solanl, 40 Phoma solanlcola, Geotrichum candldum, Erwlnia aroideae, Bacillus mesentericus vulgatus, Trichocladlum sp,, Alternaria. sp., Gliocladium sp,, Stemphyllum эр„ Pseudomonas xanthoclora, Fusarium 45 oxys po rum. Наибольший эффект действия отмечен по отношению к грибам рода Fusarium (зона подавления в Д=28-36 мм) — возбудителям сухой фузариоэной гнили; Geotrlchurn 50 candidum (Д=26 мм) — возбудителю резиновой гнили картофеля и бактерии Erwinia агоЫеае (Д=34 мм) — вызывающей мокрую гниль клубней. Пример 2. Исследовали на антагони- 55 стическую активность культуральную жидкость бактерий, проявивших антагонизм на агаризованной среде. Штаммы бактерий 683, 671, 795, 1019, 851. 863 рода Bacillus культивировали в колбах вмкосткю 250 мл с 50 мл 1 у жидкой глюкоза-солевой среды при Т 28 С в течение 48 часов, В качестве посевного материала использовали 2-х суточную культуру штаммов, выращенных в пробирках на картофельном ага ре. Антагонистическое действие культуральнай жидкости (КЖ) определяли общепринятым методом бумажных дисков па отношению к одному из самых вредоносных возбудителей клубневых гнилей Fusarlum sambuclnum. Для этого диски иэ фильтровальнай бумаги Д=8 мм смачивали в !ОК исследуемых штаммов бактерий и накладывали на засеянную грибом среду в чашках Петри. Чашки инкубировали в течение 72 часов, после чего измеряли эоны антагонизма. Результаты представлены в -,àáë, 2, иэ которой следует, что наибольшим антагонистическим эффектом отобранных антагонистов обладает штамм Bacillus mycoldes 683, который полностью подавлял рост гриба F.sarnbucinum в чашке. Пример 3. Использование штамма Вас!Ицз mycoides для подавления сухой и мокрой гнилей картофеля, Изучали антагонистическое воздействие штамма в опытах in vino на клубнях картофеля сортов Белорусский ранний, Темп, Огонек, С этой целью проводили искусственное заражение клубней вышеописанным способом (с. 3 — 4) суспензиями канидий гриба Fusarium sambuclnum и бактерий Erwlnla aroideae в концентрациях 10 канидий/Mfl и 10 бактериальных клеток/мл 6 соответственно. B опытных вариантах грибную и бактериальную инфекции смешивали с суспенэией штамма-антагониста Bacillus mycoldes в концентрации 10 и 10 бактериальных клеток/мл в соотношении 1:1, в контрольных — со стерильной водой в там же соотношении, Учет площади некроза инфицированных клубней показал ингибирующее действие штамма В,mycoides 683 на развитие сухой гнили, вызываемой грибом Fusarium sarnduclnum (табл. 3) и мокрой бактериальной гнили, вызываемой Erwlnla aroideae (табл. 4). Так, внесение штамма-антагониста в грибную и бактериальную инфекции приводит к снижению развития патологического процесса в клубнях на 40,2-86,4; . Таким образам, использование штамма Bacillus mycoldes 683 позволяет расширить арсенал биологических средств для борьбы с возбудителями клубневых гнилей картофеля. Формула изобретения Штамм бактерий Bacillus mycoides ВНИИСХМ М 133 для получения препарата против возбудителей заболеваиия картофеля. 7771639 Таблица I Антагониатичвокое действие раеличных штаииов бактерий рода bacillus на 4итопатотенные грибы и бактерии Вид тест-культуры Тк>>>> 01 9 6)О + 1,0 18,0 + 2,0,О + 1,О Рпеэт1шп ве)пдио3.»ц»> .. Pusarium aveaaceu») + 2, Pusarium culmorum Pusarium eolani 24>0 + 2,0 . 12,0+ 1,0. 10,0+ 1,0 24,0+ 2,0 6,0+ 1,0 18,0+ 2>0 10,0+ 1,О О 10,0 + 1;О 14,0Ф 12>0 Ф 1,0 10,0+ 1Î 0+ a>О 1,0 О B . . P>14 культ Ральной 3«иДкости Разли 1нь>к штаммов бактеРий рода Bacittus на рост Fusarium sambuctnum. es г!С r4c тег )1У ОСтьге Влияние штамма Bacfttus вусоЫез 683 иа развитие в клубнях картофеля гриба Fusartum sambuctnum — возбудителя сухой гнили Pusarium oxyeporum Phcma solanicola Trichocladium aeperum 0evtrichum candidu)». Qliocladium catenulatum Alternarla epp. Яее»>рЬу11а» врр. Er)1nia aroideae Peeudcmonae aanthachlora sac illus me sent ericue 30>о 34>0 36,0 28 0 10,0 в)о го,о 26>5 12>0 10,0 12 о 34 0 22>О го,о + 2,0 «+- >5 + 2,0 + 1,О + 1,0 + 2,0 + 2>5 «+ 1>0 + 1,0 + 2,0 +.2,0 «> 2,0 1>5 В,О+ 1,О 16,0 + 1>5 16,0 + 1,5 14>0 «+ 1,0 6,0-> 1 О 10,0 + 1„0 о О 10 1771639 Таблица 4 Влияние штамма Bacll!us mycoides 683 на развитие в клубнях картофеля сорта Темп возбудителя мокрой гнили Епи!п1а агоЫеае Составитель Н.Дорожкин Техред M.Mîðãåíòàë Корректор Н.Ревская Редактор Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул. Гагарина. 101 Заказ 3788 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
