Штамм микроскопического гриба beauveria ваssiаnа для получения энтомопатогенного препарата

 

Использование: микробиологическая промышленность, производство препаратов для защиты растений от вредных насекомых . Сущность изобретения: штамм гриба Beauveria basslana выделен из вирулентных изоляторов. Депонирован в коллекции ВИЗРа под N° 70И. Для получения препарата штамм культивируют на жидкой питательной среде Чапека с добавлением 0,5% дрожжей в виде отвара в течение 14 дней при 24-25°С. Получают биомассу гриба в виде пленки. Выход 4,8 г на 1 л культуральной жидкости (по сухому весу), титр 198,3 млрд/г. Для обработки растений используют суспензию с титром 4 107 спор/мл. 4 табл.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (! 9) (!!) ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4872978/13 (22) 08,06.90 (46) 15,02,93. Бюл. N 6 (71) Научно-исследовательский институт биологии при Иркутском государственном университете (72) Б.Н,Огарков, Т.И,Алферьевская, Г. Р, О га ркова и Е. П, Пол угуе ва (73) Б.Н. Огарков (56) Авторское свидетельство СССР

¹ ò557722116622, . кKJлt. А 01 N 63/00, 1970.

Авторское свидетельство СССР

N 115262, кл. А 01 N 63/00, 1983. (54) ШТАММ ГРИБА BEAUVERlA BASSlANA

ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННОГО ПРЕПАРАТА

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к производству биопрепаратов для защиты растений от вредных насекомых.

Известен штамм гриба Beauveria

bassiana CL 67 — 13 п, С267 — ВП, используемый против тепличной белркрылки, Недостатками известного штамма является невысокая вирулентность, что требует бал ьшого расхода препарата, а так же отсутствие пониженных аллергенных свойств.

Известен штамм Beauveria bassiana (Bals,) Vuill. 80 ¹ 4 для получения препарата против тепличной белокрылки.

Недостатком известного штамма является его сравнительно невысокая вирулентность и отсутствие пониженных аллергенных свойств, Данный штамм принят за прототип.

Целью изобретения является получение штамма с повышенной вирулентностью и обладающего пониженными аллергенными свойствами, (я)л С 12 N 1/14, А 01 N 63/04 (57) Использование: микробиологическая промышленность, производство препаратов для защиты растений от вредных насекомых. Сущность изобретения: штамм гриба Beauveria bassiana выделен из вирулентных изоляторов. Депонирован в коллекции ВИЗРа под N 70И. Для получения препарата штамм культивируют на жидкой питательной среде Чапека с добавлением

0,5% дрожжей в виде отвара в течение 14 дней при 24-25 С. Получают биомассу гриба в виде пленки. Выход 4,8 r на 1 л культуральной жидкости (по сухому весу), титр

198,3 млрд/г. Для обработки растений используют суспензию с титром 4 10

7 спор/мл, 4 табл.

Штамм гриба Beauverla bassiana 70 И отобран из серии вирулентных изолятов, активных в отношении вредных насекомых с примерно равными биологическими особенностями и пониженной аллергенностью

caw% в отношении теплокровных животных чело- 4 века (табл, 1). О

Экспериментальные исследования по (Л выявлению сенсибилизирующей активно- со сти энтомопатогенных грибов проводили Ш согласно Методических указаний по гигиенической оценке микробных средств защиты растений от насекомых и болезней на основе неспорообразующих микроорганизмов. (ь)

Сенсибилизацию морских свинок проводили троекоатно подкожно в дозах 10, 7

10, 10 и 10 спор/животное на каждый исследуемый штамм, Тестирование осуществляли на 7-е сутки после последнего воздействия внутрикожным введением специфического антигена, Антиген получен в Казанском НИИЭМ, Для выделения аллер1795980 геноактивных компонентов из гриба В.

bassiana в качестве экстрагирующей жидкости использовался 0,85 раствор NaCl pH

7,0 + 0,2. Время экстракции биомассы гриба — 24 ч при t +40. Полученный антиген представляет собой высокомолекулярный белковый комплекс, содержание белка 1,8 мг/мл, антиген атоксичен, активен в иммунохчмических реакциях, при постановке внутрикожных проб на сенсибилизированных животных в дозах 600 и 300 PNU и 0,1 мл дает положительные кожно-аллергические реакции. Антигены, полученные из различных штаммов В. bassiana обладают внутривидавым (штаммовым) перекрестом." "5

Препарат активен в реакциях замедленного типа (ГЗТ), Оценка сенсибилизирующей активности проводилась на 3 местных штаммах (табл. 2, 3, 4).

Данные КАП показывают, что при вве- 20 дении дозы 10, 10 спор/животное сенси7 5 билизация наступает при воздействии всех штаммов Beauveria bassiana, при поступлении дозы 10 и 10 спор/животное, признаки сенсибилизации развиваются у отдельных животных. Штаммы В. bassiana

80 М 4, В. bassiana 70 И, B. bassiana CL

67 — 13 и, Остальные штаммы в указанных дозах проявляют высокую сенсибилизирующую 30 активность. Это позволило рассчитать среднеаллергенную дозу DVgo, вызывающую сенсибилизирующий эффект у 50 животных (табл. 2), Изучение сравнительной силы аллергенности различных штаммов B. bassiana показало, что при тестировании морских свинок специфическим антигеном по показателям внутрикожных проб и среднеаллер енной дозе, рассчитанной по методу 40

Кербера в модификации Ашмарина И,П., Воробьева А.А., 1968, wTBMMbl В, Ьазз!апа 80

N 4, В. bassiana Cl 67 — 13 и, В, bassiana 70

И обладают пониженной аллергенной активностью.

Штамм депонирован в коллекции ВНИИзащиты растений.

Штамм характеризуется следующими морфолого-физиологическими свойствами.

Колонии округлые, слегка приподнятые над субстратом, на 7-й день культивирования достигает 5 — 7 мм в диаметре, на 14-й день 7 — 11 мм.

Мицелий белый, мучнистый, легко бе.рется, консистенции муки, Конидиеносцы короткие. зачастую ветвящиеся, средних размеров, располагаются в виде многочисленных скоплений вдоль гиф, Конидиеносцы с конидиями не создают округлых темных головок, а располагаются по всей толще грибницы. Толщина мицелия 1,8 — 2,8 мк, Конидии яйцевидные или несколько округлые, 2,3 — 3,0 мк.

На гусеницах Galleria веПопеИа 1 . мицелий белый, обильный, вначале войлочномучнистый, с возрастом порошащий.

На имаго Qomphocerus slbirlcus L. вначале рост белого гриба между сегментами, впоследствии по всему покрову порошащий.

На имаго Trialeurodås vaporariorum

Westw, белый, обильный, с возрастом мучнистый, Гриб хорошо растет на отварах свеклы, моркови, а также на твердых питательных средах: пшено, овес, ячмень. Наиболее интенсивный рост на среде Чапека с добавлением 0,5 дрожжей, слабее — на сусло-ага ре, Физиологические признаки, Источник углерода. Используют глюкозу, сахарозу, лактозу, маннит, дульцит, мальтоэу, сорбит, инозит и галактозу, Слабо ксилозу, Источник азота. Используют пептон, мочевину, гликоль, азотно-кислый калий, азотно-кислый натрий, азотно-кислый аммоний, серно-кислый аммоний. Слабо использует хлористый аммоний. Штамм растет при 12 — 30 С, оптимальная температура роста 24-25 С, рН среды 5,2-5,8.

Пример 1. Обработку тепличной белокрылки в теплицах осуществляют водной суспензией препарата, Подготовка рабочего раствора водной сус пензии препарата. Подготовка рабочего раствора водной суспензии препарата складывается из нескольких этапов.

Определение титра получаемого препарата.

Определение (взвешивание) необходимой навески препарата для обработки, Навеску препарата помещают в двойной слой марли, отмь|вают конидии, смешивают с нужным количеством воды и после тщательного перемешивания используют для заправки опрыскивателя.

Опытный образец грибного препарата на основе В. bassiana готовят на жидкой питательной среде Чапека с добавлением

0,5 дрожжей в виде отвара, рН среды 5,25,8. Время культивирования 14 дней при

24 — 26 С. Титр препарата составляет 198,3 млрд/г выход биомассы (масса сухой грибной пленки) 4,8 г на 1 л среды. Растения (огурцы), заселенные белокрылкой, обрабатывают суспензией с содержанием конидий

4 ° 10 в 1 мл. Техническая эффективность препарата на 7 сутки составила 74,1 .

Пример 2. Опытным образцом препарата на основе В. bassiana 70 И проиэве1795980 денным по тому же способу, что и в примере

1, обрабатывают садки с выходящими на коконирование личинками лиственичной муки (Charttophlla lariclcola Karl,). крону лиственницы. Спустя месяц садки разбирали и учитывали процент погибших личинок и коконов. В садках, обработанных подстилкой (расход препарата 5 кг/га при

5 титре 2 млрд/г), было найдено 220 особей насекомых (личинок, коконов}, из которых

150 особей погибло с явными признаками мускардиноза, что составляет в среднем

68,1% от общего числа найденных особей, 10

В каждый из трех садков помещали по

100 особей личинок лиственичной муки.

Садки плотно закрывали проволочной сеткой и закапывали в лесную подстилку под. Формула изобретения

Штамм микроскопического гриба

Beauveria basslana В ИЗР hb 70 0 для получения энтомопатогенного препарата

Таблица 1

Биологические особенности штаммов энтомопатогенного гриба Beauverla bassiana, выделенных из патологического материала у р р

Данные окончательного учета смертности насекомых на 30-е сутки.

Таблица2

Дозы, вызывающие сенсибилизирующий эффект у 50% животных при подкожном введении энтомопатогенных грибов

1795980

Таблица 3

Внутрикожные аллергические пробы у морских свинок после подкожной сенсибилизации знтомопатогенными грибами

Таблица4

Показатели специфических аллергических реакций у зкспериментальных животных, сенсибилизированных различными штаммами

« - --- --и

Схема сенсибил. дозы спор животных

Положительные результаты

Иш п= 12

Наименование штанов

Кожно-аллергические пробы

Або. чис.

РСЛЛ/реакция лейколизиса лейкоСодержание зозинофилов к базофилов.,г. итов кожпроб

НЗю мм

Показ. ливиса лейкоц.

Р Або. чис.

И«ш

3x0,1х1О

Зхо, 1 х! О

23, 412, о

18,3в 1,8

7,5+1,4

7,2 «1,6

11 91,6

5 50,0

4 25,0

2 0

58. 3

41,6

25,0

8,3

66,6

В.Bassiana

80 N

3х0, lхl от

3x0,1х1Оз

Зхо,Ix!0

3хО, !к! О

3x0,1х1От

В.bassiana а.67-13п

2

11

4

Зхо, 1 х10з

3r0, i x!0

3x0,1х1ОР

Зхо,lxlos

Зхо, 1 х1 Оз

2,9! О, I

7,010,4

40, 0 0,2

3,5 0 1

2,0! 0,4

В.bassiana 70

Контроль (несем сибилизированные животные) 2,4 о,! 2,7 0,3

6, 8I 2, О

Составитель Б.Огарков

Техред M.Moðãåíòàë Корректор Т.Вашкович

Редактор В.Трубченко

Заказ 442 Тираж Подписное

ВНИИПИ ГЖударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4j5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

12 100,0

33,3

41,Ь

16,6 91,6

58,3

33,3

8,3

4,6то,5

3,5 0,4

2,04"0,2

2,0%0,2

7;5+o,ь

Ь,8 0,3

5, О+0,1

З,оь0,1

7,4 0,3

Ь,820,2

3,4 0,1

3,0-0,1

4,820,

4,0«0,2

2,08!0,2

2,4«0,!

u,90,!

7, I! О, 3

4,Тн0,2 (0,05 7

C0,05 5

70,05 3

70,05 1 (ОО! и (0,01 4 (0,05 4

s0,О5 2 (0,05 Ь (0,05 5

10,05 4 у0,05 3

33.3

33,0

16,6

50,0

41,6

33,3

25, О

17,9«2,1

I6,3! I 9

8,4" 1,6

6,4«2, 3

23,2 I,В

10,1в2,0

6,9+ 1, 4 е, ьг;0 (0,001 (О, 001

УО, 05

70,05 (0,001 (0,01 (0,05

70,05

jО,ОО1 (O,0l l0, 05

70,05