Штамм streptomyces species - продуцент ингибитора - гликозидаз

 

Использование: биотехнология, в частности получение ингибиторов a - гликозидаз медицинского назначения. Сущность изобретения: предлагаемый штамм Streptomyces species ВКМ Ас - 1328 при культивировании в жидкой питательной среде образует ингибитор a - гликозидаз. Штамм выделен из почвенного образца Молдавской ССР. Предлагаемый штамм по своим морфологокультуральным, физиологическим свойствам отличается от всех известных продуцентов ингибиторов a - гликозидаз. Состав питательной среды для биосинтеза ингибитора, г/л: крахмал растворимый 40, соевая мука 5, натрий хлористый 3, калий фосфорнокислый двузамещенный 1, магний сернокислый 0,05, железо (II) сернокислое 0,01, цинк сернокислый 0,001, медь сернокислая 0,001, марганец сернокислый 0,001. Через 4 сут ферментации ингибиторная активность нативного раствора составляет 1000 - 2000 МЕ/мл в отношении панкреатической a - амилазы. Ингибитор не токсичен.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению ингибиторов α-гликозидаз медицинского назначения. Широкое распространение такого заболевания, как сахарный диабет, определяет необходимость поиска новых антидиабетических препаратов. Изобретение касается культуры Streptomyces species ВКМ Ас-1328 Д как продуцент ингибитора α-гликозидаз. По своим морфолого-культуральным, физиологическим свойствам и спектру действия ингибитора культура отличается от всех известных продуцентов ингибиторов α-гликозидаз. Известен штамм Astinoplanes species, образующий ингибитор α-гликозидаз, пригодный для применения в медицине. Известный штамм взят за прототип. Недостатком известного штамма является то, что он требует особых условий для хранения и культивирования. Цель изобретения создание нового непатогенного штамма актиномицета, синтезирующего ингибитор активный в отношении панкреатической α-амилазы, дисахаридаз и устойчивый к действию протеолитических ферментов. Предлагаемый штамм выделен из почвенного образца Молдавской ССР селективным методом "Приманки на природные субстраты", имеет следующую характеристику морфолого-культуральных, физиологических свойств и спектр действия ингибиторов. Предлагаемый штамм выделен из почвенного образца Молдавской ССР селективным методом "Приманки на природные субстраты", имеет следующую характеристику морфолого-культуральных, физиологических свойств и спектр действия ингиби- тора. Морфологические признаки. Воздушный мицелий хорошо развит. На большинстве использованных питательных сред образует прямые, слабо извилистые, изогнутые спороносцы. Споры прямоугольные, с гладкой оболочкой. На ряде сред на воздушном мицелии образует небольшие спорангии. Зооспоры овальные, с гладкой оболочкой, с монотрихальным жгутикованием. Культуральные признаки. Среда Чапека с крахмалом. Рост обильный. Воздушный мицелий желтовато-бурый (д4). Субстратный мицелий темно-коричневый (л5). Колонии холмистые, d=10-11 мм, края колонии ровные. Растворимый пигмент темно-коричневый, обильный. Образует овальные спорангии d=5-12 мкм. Среда Чапека с глюкозой. Рост скудный. Воздушный мицелий отсутствует. Субстратный мицелий бежевый (л7). Колонии с приподнятым центром, d=10-11, край колонии волнистый. Растворимый пигмент отсутствует. Среда минеральная Гаузе 1. Рост хороший. Воздушный мицелий изабелловый (к1). Субстратный мицелий бурый (к4). Колонии приподнятые над агаром, d=8 мм, край ровный. Растворимый пигмент светло-коричневый. Образует округлые спорангии d=3-10 мкм. Среда органическая Гаузе 2. Рост хороший. Воздушный мицелий пепельно-серый (к2). Субстратный мицелий темно-каштановый (07). Колонии приподнятые, кратеровидные, d= 8-9 мм, край неровный. Растворимый пигмент темно-коричневый, обильный. Среда крахмально-аммиачная. Рост обильный. Воздушный мицелий темно-серый (а2). Субстратный мицелий буровато-желтый (к5). Колонии холмистые, d=10-12 мм, край колонии ровный. Растворимый пигмент отсутствует. Овсяный агар. Рост обильный. Воздушный мицелий серый (в4). Субстратный мицелий оранжевый (о3). Колонии приподняты над агаром, d=10-11 мм, край колонии волнистый. Растворимый пигмент отсутствует. Образует овальные спорангии d=5-10 мкм. Глицерин-аспарагиновый агар. Рост обильный. Воздушный мицелий паленый (04). Субстратный мицелий рыжеватый (ж2). Колонии приподняты над агаром, d= 9-10 мм, край колонии ровный. Образует округлые спорангии d=5-20 мкм. Физиологические признаки. Культура слабо разжижает желатину, молоко пептонизируют, на клетчатке не растет, крахмал гидролизует, нитраты не восстанавливает, сахарозу инвертирует, образует меланоидный пигмент. Штамм очень хорошо растет, если в качестве единственного источника углерода используют глюкозу, фруктозу, ксилозу, рамнозу, маннит, хорошо растет в присутствии арабинозы, умеренно в присутствии сахарозы и сорбита. Спектр действия ингибитора. При глубинной ферментации культура Streptomyces species выделяет в нативный раствор ингибитор α-гликозидаз. Ингибитор активен в отношении панкреатической α-амилазы, сахаразы, мальтазы, бактериальной α-амилазы, декстраназы и глюкоамилазы. Заявленный штамм отличается от прототипа по морфолого-культуральным и физиологическим свойствам. В отличие от прототипа Astinoplanes species, не образующего воздушного мицелия, заявленный штамм Streptomyces species не требует особых условий для хранения и культивирования. Для получения ингибитора актиномицет культивируют при 28±1^оС на качалке (n=220 об/мин) в колбах Эрленмейера, емкостью 750 мл, содержащих 100 мл среды следующего состава, г/л: Крахмал растворимый 400 Соевая мука 5 Натрий хлористый 3 Калий фосфорнокислый двузамещенный 1 Магний сернокислый 0,05 Железо сернокислое 0,01 (II) Цинк сернокислый 0,001 Медь сернокислая 0,001
Марганец сернокислый 0,001
Продолжительность ферментации 96 ч. Амилолитическую активность определяли по методике R.Ruyssen Pharmaceutical Enzymes/Ed. by R. Ruyssen, A.Lauwers, E.Story-.Gent (Belgium): Scientia Scientific Company, 1978, P.83-84. За единицу ингибиторной активности принимали такое количество ингибитора, которое при 37^оС в течение 10 мин вызывает подавление амилолитической активности α-амилазы с 2 до 1 АЕ/мл. Ингибиторную активность нативного раствора Streptomyces species определяли в отношении следующих α-амилаз: панкреатическая бычья α-амилаза (получена экстракцией 0,01 М фосфатным буфером рН 7,0 из панкреатина медицинского производства Московского Мясокомбината, ТУ 09-23-113-77); панкреатическая свиная α-амилаза (кристаллическая суспензия, производство "Реанал" Венгрия); микробная α-амилаза из продуцента Bacillus subtilus (Япония); растительная α-амилаза диастаза из ячменного солода (Олайненский завод химреактивов). Величины ингибиторной активности в отношении перечисленных ферментов, IE/мл:
Панкреатическая бы-
чья α-амилаза 1000-2000
Панкреатическая сви-
ная α-амилаза 1000-2000
α-амилаза Bacillus
subtilus 50-100
Диастаза из ячменного
солода 0
Ингибитор не токсичен, LD₅₀ более 1000 мг/кг при внутривенном введении мышам и более 10000 мг/кг при пероральном введении.

Формула изобретения

Штамм Streptomyces species ВКМ Ас-1328 Д продуцент ингибитора a-гликозидаз.