Способ получения онкоовариального кислоторастворимого альфа- 2-глобулина

 

Использование: в медицинской биохимии для выделения из тканей онкоовариального кислоторастворимого альфа-2-глобулина, необходимого для разработки специфической иммунодиагностики. Цель изобретения: получение нового опухолеассоциированного кислоторастворимого антигена. Сущность из обретения: экстракт опухолевой и метастатической ткани первичной аденокарциномы яичников прогревают на кипящей водяной бане5-20 мин при95°С. Прогретый экстрактобрабатывают равным объемом 5-15% трихлоруксусной кислоты. Осаждают нерастворимую фракцию центрифугированием. Фракционируют кислоторастворимую фракцию сульфатом аммония. Растворяют осадок в минимальном объеме дистиллированной воды и подвергают гель-фильтрации его на колонке с сефадексом G-100. Осаждают сульфатом аммония-фракции, содержащие КРАГ. Растворяют осадок в дистиллированной воде с последующей ге.ль-фильтрацией его на колонке с сефадексом G-200 в летучем 0,05-0,2 М аммонийац-етатном буфере (рН 5,0-7,0} и лиофилизацией фракции, содержащей целевой продукт. Положительный эффект: изобретение позволяет в обычных с лабораторных условиях с помощью доступных реактивов получать новый онкоовари- f/y альный кислоторастворимый белок - человека.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s А 61 К 37/02, 35/54

ЕНИЯ (ГОСПАТЕНТ СССР)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ гиа=те;-.г и у i -а .и" а т (1 обрабатывают равным объемом 5-157ь трихлоруксусной кислоты. Осаждают нерастворимую фракцию центрифугированием.

Фракционируют кислоторастворимую фракцию сульфатом аммония. Растворяют осадок в минимальном объеме дистиллированной воды и подвергают гель-фильтрации его на колонке с сефадексом G-100. Осаждают сульфатом аммония фракции, содержащие КРАГ. Растворяют осадок в дистиллированной воде с последующей гель-фильтрацией его на колонке с сефадексом G-200 в летучем 0,05-0,2 M аммонийацетатном буфере (рН 5,0-7,0) и лиофилизацией фракции, содержащей целевой продукт. Положительный эффект: изобретение позволяет в обычных лабораторных условиях с помощью доступных реактивов получать новый онкоовариальный кислоторастворимый белок человека, нием, фракционирования кислотораствори- Qj мой фракции сульфатом аммония (210 — 300 С) г/л), растворения осадка в минимальном объеме дистиллированной воды и гельфильтрации его на колонке с сефадексом

Ж-100, осаждения сульфатом аммония (210— . 300 r/ë) фракций, содержащих КРАГ, рас- Од творения осадка в дистиллированной воде с пооиедуюгцеи геле-фиаетрацией его на ко- ) ° лонгке с сефадексом Ж-200 s летучем 0,1М д (0,05 — 0,2М) аммоний-ацетатном буфере (рН вЂ” 5,0 — 7,0) и лиофилизацией фракции, содержащей целевой продукт, В процессе разработки способа удалось полностью избежать диализа. Эта процедура не только длительная, но и негативна влияет на.нативность многих белков. Все

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4888984/14 (22) 04,12,90 (46) 15.04,93, Бюл, ¹ 14 (71) 2-й Московский государственный медицинский институт им. H,È, Пирогова (72) П.Г. Прокопенко, С.А. Борисенко,. О.В.

Макаров и Ю.С. Татаринов (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОНКООВАРИАЛЬ НОГО КИСЛОТОРАСТВОРИМОГО

АЛЬФА-2-ГЛОБУЛИНА (57) Использование: в медицинской биохимии для выделения из тканей онкоавариального кислоторастворимого альфа-2- глобулина, необходимого для разработки специфической иммунодиагностики. Цель изобретения: получение нового опухолеассоциированного кислоторастворимого антигена. Сущность изобретения: экстракт опухолевой и метастатической ткани первичной аденокарциномы яичников прогревают на кипящей водяной. бане 5-20 мин при 95 С, Прогретый экстрактИзобретение относится к медицине, а именно к медицинской биохимии и может быть использовано для выделения из тканей онкоовариального кислотарастворимого альфа-2-глобулина (КРАГ), Цель изобретения — разработка способа получения онкоовариального кислоторастваримого альфа-глобулина, Поставленная цель достигается описываемым способом получения КРАГ из опухалевой и метастатической ткани первичной аденакарциномы яичников путем прогревания экстрактов на кипящей водяной бане

15(5 — 20 мин) при 95"С, обработки прогретого экстракта равным объемом 107 (5—

15 g,) трихларуксуснай кислоты, осаждения нерастворимой фракции центрифугирава5U 1808333 А1

1808333 агапы данного способа выстроены таким образом, что воспроизведение его до получения целевого продукта занимает 16-20 ч. Новым в предлагаемом способе является то, что в результате последовательного применения описанных этапов в течение 16 — 20 ч из экстрактов аденокарциномы яичников или ее метастазов в сальник можно получить новый опухолеассоциированный кислоторастворимый альфа-2-глобулин с чистотой препарата

65-80 / и выходом 16,6 — 25 . Новый онкоовариальный кислоторастворимый антиген необходим для разработки специфической иммунодиагностики рака яичников.

При отработке отдельных этапов способа проверены и обоснованы параметрические значения концентраций, время, температуры, рН, ионной силы и т,д.

Пример 1. 100 мл экстракта аденокарциномы яичников, содержащим 30 мг КРАГ, заливают в колбу и помещают в водяную баню, которую разогревают до кипения.

Экстракт в колбе периодически перемешивают и замеряют температуру непосредственно в экстракте. При подъеме температуры в экстракте до 95 — 97 С нагрев подол>кают в течение 5 мин, Колбу с экстрактом извлекают из бани, охлаждают до 18 С и приливают равный объем 5 трихлоруксусной кислоты. Тщательно перемешивают, осадок отделяют центрифугированием и доводят рН кислоторастворимой фракции с помощью 2,0М едкого натра до рН 7,0. Добавляют сухую соль сульфата аммония из расчета 210 г/л, через 30 мин после полного растворения соли осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 10 мл дистиллированной воды и наносят на колонку с сефадексом Ж-100. Объединяют фракции, содержащие КРАГ, добавляют сульфат аммония до концентрации 210 г/л, инкубируют 1 ч, центрифугируют, осадок растворяют в 5 мл дистиллированной воды и подвергают повторной гель-фильтрации на сефадексе

Ж-200 в летучем аммоний-ацетатном буфере (0,05 М, рН 5,0). Объединяют фракции с молекулярной массой 52-58 кД и лиофилизируют. После лиофилизации получено 7,1 мг белкового порошка, По данным дискэлектрофореза в полиаркиламидном геле чистота препарата КРАГ составила 70 .

Следовательно, из 7,1 мг белкового порошка на долю КРАГ приходится 5 мг, что составляет 16,6/ выхода, Пример 2. 100 мл экстракта аденокарциномы яичников, содержащим 30 мг КРАГ, заливают в колбу и помещают в водяную баню, которую разогревают до кипения, Экстракт перемешивают и замеряюттемпературу непосредственно в экстракте, При подъеме температуры до 95 — 97 С нагрев продолжают в течение 15 мин. Экстракт охлаждают до 18 С и приливают равный объем

10 трихлоруксусной кислоты. Перемешивают осадок отделяют центрифугированием и доводят рН до 8,0. Добавляют сульфат аммония 270 г/л, после полного растворения соли осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 10 мл дистиллированной воды и наносят на колонку с сефадексом Ж-100, Объединяют фракции, содержащие КРАГ, добавляют сульфат аммония (270 г/л), инкубируют 1 ч, центрифугируют, осадок растворяют в 5 мл дистиллированной воды и наносят на колонку с сефадексом Ж-200 в летучем аммоний-ацетатном буфере (0,1 М, рН 6,0), Объединяют фракции с молекулярной массой 52-58 кД и лиофилизируют. После лиофилизации пол20 учено 7,5 мг белкового порошка, По данным диск-электрофо реза в пол иакриламидном геле чистота препарата КРАГ составила

80 . Следовательно из 7,5 мг белкового порошка на долю КРАГ приходится 6 мг, что составляет 20/ выхода.

Пример 3. 100 мл экстракта аденокарциномы яичников, содержащим 30 мг КРАГ, заливают в колбу и нагревают, как в примерах 1 и 2, После охлаждения экстракта к нему приливают равный объем 15/ трихлоруксусной кислоты, К полученной кислото, растворимой фракции добавляют сульфат аммония из расчета 300 г/л и полученный осадок, растворенный в 10 мл дистиллированной воды, хроматографируют на колонке с сефадексом Ж-100. Объединяют фракции, содержащий КРАГ, осаждают его сульфатом аммония (300 г/л), осадок растворяют в 5 мл дистиллированной воды и хроматографиру40 ют на сефадексе Ж-200 в летучем аммонийацетатном буфере (0.2 М, рН 7). Собирают фракции с молекулярной массой 52-58 кД и лиофилизируют. После лиофилизации получено 11,5 мг белкового порошка, По дан45 ным диск-электрофореза в полиакриламидном геле чистота препарата

КРАГ составила 65, Следовательно из 11,5 мг белка на долю КРАГ составила 65 /. Следовательно, из 11,5 мг белка на долю КРАГ приходится 7,5 мг, что составляет 25/ выхода, Пример 4, 100 мл экстракта из ткани метастазов первичного рака яичников в сальник, содержащим 20 мг КРАГ, заливают в колбу и подвергают нагреванию. Далее все этапы аналогичны приведенным в примере 2. После лиофилизации получено 5 мг белкового порошка. По данным электрофореза в поилакриламиднам геле чистота препарата КРАГ составила 80, 1808333

Составитель П.Прокопенко

Тех ред M. Moð ãå Hòàë Корректор С Пекарь

Редактор

Заказ 1231 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Следовательно, из 5 мг белкового порошка на долю КРАГ приходится 4 мг, что составляет 20 выхода.

Данный способ может быть применен для выделения КРАГ и из сыворотки крови.

Однако концентрация его в сыворотке крови больных раком яичников составляет всего лишь 0,02 — 0,08 мг/л и выделение его из сыворотки крови представляет интерес скорее теоретический, исключительно для аналитических целей. Другого биологического материала, из которого можно было бы его получать, пока не найдено, Контроль за чистотой препарата на этапах выделения осуществляли иммунохимичес кими методами и с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

Количественное определение КРАГ проводили иммунохимическими методами, Опыты по получнию моноспецифических антисывороток при использовании в качестве антигена препарата КРАГ, выделенного по описанному способу, показали, что препарат обладает достаточной нативностью, высокой иммуногенностью, а полученные антисыворотки — высокой специфичностью, Предлагаемый способ позволяет в обычных лабораторных условиях с помощью доступных реактивов получать новый онкоовариальный кислоторастворимый белок человека. КРАГ необходим для получения к нему моноспецифических антисывороток, которые будут использованы для

5 разработки специфических методов иммунодиагностики рака яичников и исследований в области экспериментальной онкологии и медицины.

Формула изобретения

10 Способ получения онкоовариального кислоторастворимого альфа-2-глобулина, включающий предварительное прогревание при температуре 95-97 С экстрактов из опухолевой или метастатической ткани пер15 вичной аденокарциномы яичников в течение 5 — 20 мин, осаждение балластных белков 2,5 — 7,5 трихлоруксусной кислотой, внесение в кислоторастворимую фракцию сульфата аммония в концентрации 210 — 300

20 г/л. растворение образовавшегося осадка в минимальном количестве дистиллированной воды и проведение гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-100, сбор фракций, содержащих альфа-2-глобулин, повторную

25 обработку сульфатом аммония в той же концентрации, проведение гель-фильтрации растворенного осадка на сефадексе G-200 в летучем аммоний-ацетатном буфере, сбор фракций с мол.м. 52-58 кД и лиофизирова30 ние.