Способ получения инсулина

 

Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности, а именно к способам получения инсулина. Цель изобретения - повышение выхода специфической активности целевого продукта и упрощение способа. Поставленная цель достигается тем, что в качестве сырья используют ткань поджелудочной железы 14-28-недельных эмбрионов человека, культивируют ее в питательной среде Игла с добавлением 10% сыворотки крови человека в ротационной установке в течение 3-25 дней, смесь центрифугируют 5 мин при 500 об/мин, надосадочную жидкость собирают, замораживают при минус 18°С, размораживают, повторно центрифугируют 30 мин при 15000 об/мин с последующей лиофилизацией замороженных супернатантов.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИ Ч Е СКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (21) 4838918/14 (22) 14.06.90 . (46) 07.04.93. Бюл, М 13 (71) Ереванский филиал Всесоюзного научного центра хирургии AMH СССР (72) М.Е.Басмаджян и В,И.Геворкян (56) Авторское свидетельство СССР

М 552972, кл. А 61 К 37/26, 1977, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА (57) Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности, а именно к способам получения инсулина. Цель изобретения — повышение выхода специфичеИзобретение относится к медицине, именно к эндокринологии, и может быть использовано в биотехнологии при получении лекарственных препаратов инсулина.

Цель изобретения — повышение выхода человеческого инсулина и чистоты препарата, путем его накопления в среде процессом культивирования инсулинсинтезирующих эмбриональных клеток поджелудочной железы человека.

Поставленная цель достигается следующим образом: поджелудочную железу эмбрионов человека 14-28 недельного возраста извлекают стерильно, измельчают на фрагменты и культивируют fn vitro a питательной среде в ротационной установке. Ростовую среду с синтезированным в ней, растущими

Р-клетками поджелудочной железы инсулином центрифугируют для удаления шлаков, супернатант отделяют. С целью стабилизации инсулина от разрушения, супернатант замораживают при температуре -18 С. Супернатанты собирают неоднократно в те„„Я „„1806751 А1 (я)5 А 61 К 37/26, 35/39 ской активности целевого продукта и упрощение способа, Поставленная цель достигается тем, что в качестве сырья используют ткань поджелудочной железы 14-28-недельных эмбрионов человека, культивируют ее в питательной среде Игла с добавлением 10 сыворотки крови человека в ротационной установке в течение 3-25 дней, смесь центрифугируют 5 мин при 500 об/мин, надосадочную жидкость собирают, замораживают при минус 18 С, размораживают, повторно центрифугируют 30 мин при 15000 об/мин с последующей лиофилизацией замороженных супернатантов, чение всего периода культивирования до физиологической гибели клеток (20-25. дней). Все супернатанты размораживают, объединяют и радиоиммунологическим методом определяют в нем содержание инсулина. Супернатант вновь замораживают и лиофилизируют. Полученный сухой порошок и является целевым продуктом, Перед употреблением содержимое флаконов разводят дистиллированной водой и целевой продукт употребляют в нативном виде.(В зависимости от задач исследований супернатант может быть разлит по флаконам с заведомо известным содержанием инсулина). В лиофилизированном состоянии целевой продукт можно хранить и испольэовать в течение года, Способ осуществляют следующим образом; поджелудочную железу эмбрионов человека 14-28-недельного возраста извлекают стерильно, измельчают на фраг- . менты величиной 2-3 мм и культивируют в ростовой среде, в объеме 3-5 мл, состоящей

1806751 из среды Игла с 10Я сыворотки крови человека. Среда Игла содержит набор аминокислот на сбалансированном солевом растворе и оптимально приближена к биологической среде клеток организма, Все это потребляется клетками для своей жизнедеятельности в процессе роста. Культивирование проводят в ротационной установке (в аппарате для культивирования тканей во вращающихся пробирках). Ростовую среду собирают после осаждения фрагментов поджелудочной железы путем центрифугирования при скорости 500 об/мин в течение

5 мин. Супернатанты отделяют, а к осадку фрагментов поджелудочной железы добавляют 3-5 мл свежей питательной среды для дальнейшего культивирования. Ростовую среду с растущих культур собирают многократно, каждые 3-4 дня, во время реновации среды в культурах, в течение всего периода культивирования (20-25 дней) и хранят при температуре-18 С. Супернатанты размораживают, объединяют и центрифугируют при

15000 об/мин в течение 30 мин для осаждения шлаков и элементов разрушенных клеток. Радиоиммунологическим методом в супернатанте определяют содержимое инсулина набором (CIa-ire-Sorln) Франция. Супернатант с известным содержанием инсулина разливают по флаконам, вновь эамораживают и лиофилизируют. От одной поджелудочной железы в течение 25-днев ного культивирования можно получить сухого вещества 246-250 мг с активностью ИРИ от 300-500 мед/мг инсулина. Неиспользованные клетками компоненты ростовой среды, вошедшие в сухой целевой продукт, во внимание не принимают, т.к., являясь оптимально приближенными к биологической среде клеток организма, они не могут вызывать побочных явлений. Перед употреблением содержимое флаконов с заведомо известным содержанием инсулина разводят дистиллированной водой, в зависимости от задач исследований, и употребляют в нативном виде.

В опытах было использовано 11 поджелудочных желез плодов человека разного возраста. Сливы с культур брались в динамике роста культур.

Пример 1. Культура N 2 от

25/IV-89 г.

Одну поджелудочную железу эмбриона человека 14 недельного возраста извлекают стерильно, измельчают на фрагменты величиной 2-3 мм, и культивируют в питательной среде Игла, содержащей 10; человеческой сыворотки в объеме 3 мл в ротационной установке. Каждые 4-е сутки культивирования центрифугированием при

500 оборотов в минуту в течении 5 мин супернатант отделяют и замораживают при температуре -18 С, а к осадку добавляют 3 мл свежей питательной среды для дальнейшего культивирования фрагментов поджелудочной железы, За 25 сут культивирования, во время реновации среды в культурах фрагментов поджелудочной железы, было собрано и заморожено 5 супернатантов. Собранные супернатанты размораживались, объединялись и центрифугировались при 15000 об/мин в течении 30 мин, после чего радиоиммунологическим методом определяли в нем

5 содержание инсулина. Супернатант с известным содержанием инсулина замораживают и лиофилизируют, После лиофилизации супернатанта с одной поджелудочной железы всего получено сухого порошка 246 мг с

20 активностью ИРИ 295 мед/мг.

Пример 2. Культура N. 1 от 5/XII-89 г.

Поджелудочную железу эмбриона человека 28-недельного возраста извлекают стерильно, измельчают на фрагменты величиной 2-3 ммз и культивируют в питательной среде Игла, содержащей 10 человеческой сыворотки в объеме 3 мл в ротационной установке. Каждые 4-е сутки культивирования супернатант, центрифуги- .

30 рованием 500 об/мин в течение 5 мин, отделяют и замораживают при температуре

-18 С, а к осадку добавляют 3 мл свежей питательной среды для дальнейшего культивирования фрагментов поджелудочной

35 железы. За 25 сут культивирования собрано и заморожено 5 супернатантов. Собранные супернатанты размораживались, объединялись и центрифугировались при 15000 об/мин в течение 30 мин, после чего радио40 иммунологическим методом определяли в нем содержание инсулина. Супернатант с известным содержанием инсулина замораживают и лиофилизируют.

После лиофилизации супернатанта все45 го получено сухого порошка 250 мг с активностью ИРИ 480 мед/мг.

Как видно из примеров, количество инсулина, синтезированного одной поджелудочной железой, колебалось, что, 50 по-видимому, связано с возрастом плода и величиной поджелудочной железы.

Данный способ дает возможность получить от одной поджелудочной железы целевой продукт в виде сухого порошка с

55 активностью инсулина до 500 мед/мл, что в

10000 раз превышает активность препарата по известному способу, кроме того, предла-. гаемый способ не требует очистки препарата, который может быть использован в нативном виде, 1806751

Составитель М. Басмаджян

Техред М,Моргентал Корректор А. Мотыль

Редактор С. Кулакова

Заказ 1344 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Сухое вещество, полученное из супернатанта подвергали биологическому тестированию на инсулин, который при введении животным снижает сахар в крови, вызывает гипогликемические судороги и гибель животных, Судорожный тест был поставлен на 20 белых мышах и на 10 крысах с аллоксановым диабетом, у которых сахар крови составлял 300-400% мг. Лиофилизированный порошок предварительно разводили дистиллированной водой до концентрации инсулина 40000-50000 мкед/мл, которая вызывала четкий судорожный эффект и гибель животных. Гипогликемический эффект наблюдался у крыс с аллоксановым диабетом при введении им целевого продукта в количестве 5000-6000 мкед/мл, что еще раз явилось подтверждением наличия инсулина в порошке, обладающего биологической активностью, Таким образом, в 1 мг,. получаемом по данному способу сухом порошке, активность человеческого инсулина в 10000 раз выше, чем по известному способу. Биологическое тестирование и радиоиммунологические данные подтвердили это.

Человеческий инсулин, полученный данным способом, может быть использован как препарат в нативном виде, т.к. незначительные примеси, являясь компонентами ростовой среды, максимально приближенные к биологической среде организма, не могут вызывать побочные явления в организме человека, по сравнению с известными препаратами инсулина.

Заявленный способ может быть использован; при изготовлении стандартных форм инсулина человека для радиоиммунологических наборов; технология данного способа может быть использована в лабораторных условиях для получения инсулина всех видов животных; полученный данным способом лиофилизированный порошок, содержащий инсулин, может быть использован без очистки в

5 нативном виде, как биостимулятор в клинической практике при заживлении ран; возможность получения гормоноактивных временных линий из эмбриональных поджелудочковых желез, установленная в

10 той же лаборатории, позволит,в перспективе накапливать человеческий инсулин, применение которого позволит избежать осложнений и сложных иммунологических

15 реакций в организме больного, присущих применяемым сейчас, представленным препаратам инсулина.

Предлагаемый способ прост и доступен, не требует сложного оборудования, ценного

20 продукта — крови человека, исключает процесс очистки.

Формула изобретения

Способ получения инсулина из поджелудочной железы человека путем измельче25 ния исходного сырья, очистки, охлаждения с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем. что, с целью упрощения способа, повышения выхода и специфической активности целевого про30 дукта, в качестве сырья используют ткань поджелудочной железы 14-28 недельных эмбрионов человека, культивируют ее в питательной среде Игла с добавлением 10 ной сыворотки крови человека в

35 ротационной установке в течение 3-25 дней, смесь центрифугируют 5 мин при 500 об/мин, надосадочную жидкость, содержащую целевой продукт, собирают, замораживают при температуре -18 С, 40 размораживают, повторно центрифугируют

30 мин, при 15000 об/мин и лиофилизируют замороженные супернатанты.