Способ определения антиокислительной активности карнозина

 

Использование: медицинская биохимия . Сущность изобретения: к 1 мл 1 мМ раствора карнозина добавляют 1 мл 5 мМ раствора гипохлорида натрия и спектрофотометрируют при 292 нм. Антиокислительную активность дипептида карнозин определяют по параметру А (А0 - А+)/А0, где Аб - оптическая плотность 2,5 мМ раствора гипохлорида натрия при 292 нм, А+ - оптическая плотность 1 мМ раствора карнозина . Изобретение позволяет упростить и ускорить способ определение антиокислительной активности карнозина.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУВЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4907639/14 (22) 24.1090 (46) 07.04.93, Бюл. М 13 (71) Совместное советско-западногерманское предприятие "Константа" (72) В.Е.Формазюк,.Е.И„Дудина и А.А,Болдырев (56) Бюлл.экспер.биол,мед. 1989, М 12, с. 668-670. (54} СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КАРНОЗИНА (57) Использование; медицинская биохимия. Сущность изобретения: к 1 мл 1 мМ

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской технологии и фармакологии, а именно к способам биологического тестирования различных лечебных препаратов.

Цель изобретения — увеличение точности способа, уменьшение расхода изучаемого вещества, ускорение и упрощение способа, Цель достигают тем, что изучается расход гипохлорида натрия при взаимодействии с различными сериями карнозина.

Согласно современным взглядам на патогенез ряда заболеваний, для которых характерно воспаление и деструкция собственных тканей в очаге поражения, в качестве основного поражающего агента может выступать гипохлорид натрия. Поэтому антивоспалительное, ранозаживляющее действие,и другие терапевтические эффекты карноэина (как и тауфона-таурина} могут в значительной степени быть обусловлены именно способностью нейтрализовать токсическое действие гипохлорид-аниона. Поэ„„БЦ„„1807353 Al (я)ю 6 01 К 21/76, А 61 К 37/02 раствора карнозина добавляют 1 мл 5 мМ раствора гипохлорида натрия и спектрофотометрируют при 292 нм. Антиокислительную активность дипептида карнозин определяют по параметру А = (А0 А+)/Ap, где Ap — оптическая плотность 2,5 мМ раствора гипохлорида натрия при 292 нм, А+— оптическая плотность 1 мМ раствора карнозина. Изобретение позволяет упростить и ускорить способ определение антиокислительной активности карнозина, тому мы считаем, что изучение нейтрализующего действия различных серий каонозина в реакции с гипохлорид-анионом может наиболее г лно отражать его антиокислительную активность. О таком взаимодействии можно судить спектрофотометрически по уменьшению характерного для гипохлорид-аниона поглощенйя при 292 нм, Способ осуществляется следующим об.разом, Карнозин растворяют в дистиллированной воде до конечной концентрации 1 мМ. 6? . При это объем раствора карнозина, требуемый для исследования, составляет 1 мл; это означает, что для тестирования каждой серии требуется всего около 0,2 мг вещества.

Об антиокислительной активности карнозина судят по параметру А - (Ap — А+)/Ар, где

А0 — оптическая плотность 2,5 мМ плотность

2,5 мМ раствора гипохлорида натрия при

292 нм; А+ — оптическая плотность 1 мМ раствора карнозина, к 1 мл которого добавили 1 мл 5 мМ раствора гипохлорида на1807353 трия. Чем выше параметр А, тем выше анти- окислительная активность карнозина.

Пример 1. Для исследования взят карнозин фирмы "Serva" (США), который использовался в исследованиях без какой-ли- 5 бо предварительной очистки, Приготовлено

1 мл раствора карнозина, для чего было взято около 0,2 мг порошка вещества. Затем к полученному раствору добавили 1 мл раствора гипохлорида натрия и сразу после смешения измерялась оптическая плотность смеси двух растворов при 292 нм А+ =

=0,4177. Затем определяли поглощение раствора гипохлорида натрия при 292 нм без добавок) параметр Ао = 1.5671). О биологи- 15 ческой эффективности карнозина судили по параметру А = (Ао — А+)/Ао, которая для коммерческого карнозина фирмы "Serve" (США) была равна 0,32+0,04 относительных единицы. Анализ занял около 5 мин, состоял из 20 двух операций.

Параллельно определению расхода гипохлорида для карнозина фирмы "Serve" (США) проводили определение антиокислительной активности препарата согласно 25 способу-прототипу.

Для этого получали сыворотку крови крысы, на что уходило 50 мин, добавляли 0,2 мл ее к 10 мл дистиллированной воды. Затем 5 мг карнозина, растворенного в дис- 30 тиллированной воде, вносили в полученный раствор сыворотки. Такой раствор с добавленным карнозином ставили на магнитную мешалку и активировали окисление сыворотки внесением в систему 1 мл 60 мМ рас- 35 твора FeS04, Через каждые 20 мин отбирали по 0,8 мл и смешивали с таким же объемом

20 ь-ной трихлоруксусной кислоты, спустя

20 мин от смешения каждую пробу центрифугировали в течение 20 мин при 10000 g, к 40 полученному супернатанту добавляли 0,5 . раствора тиобарбитуровой кислоты (ТБК) и кипятили полученный раствор в течение 60 мин. Количество ТБК-активных водорастворимых продуктов перекисного окисления 45 оценивали по их флуоресценции в области

530-580 нм, Для возбуждения флуаресцеиции использовали свет с длиной 515 нм, ширина щели — 3 нм.

В качестве контроля использовали 50 окисление той же сыворотки без добавления карнозина, Об эффективности препарата судили по величине подавления им в описанной системе ТБК-активных прадук55 тов перекисного окисления: Rj Fi/Fi+)/п, где

Š— интенсивность флуоресценции контроля за i-тый промежуток времени окисления, Fi+ — интенсивность опытного образца (с 2,2 мМ карнаэина) за i-".ûé промежуток времени окисления, п — количество измерений, Чем выше эта сумма, тем больше биологическая эффективность препарата карназина.

Точность данного метода зависит от времени проведения анализа: для статически достоверных различий достаточно уже взять четыре пробы, т.е. достаточно проводить окисление в присутствии карнозина в течение 80 мин, Для карноэина фирмы "Serva" (США), каторсчй использовали в исследованиях беэ какой-либо предварительной очип, . стки Z =1,81й0,3.

Суммарный расход карноэина для такого анализа составлял 5 мг, ингибирующая концентрация в суммарном растворе сыворотки и FeS04 — 2,2 мМ, время анализа — 3,4 ч, количество операций — 5.

Пример 2. Для исследования взят карнозин фирмы "Serve" (США), который использовался в исследованиях с предварительной очисткой (одна перекристаллизация), Приготовлено 1 мл 2 мМ раствора карноэина, для чего было взято около 0,2 мг порошка субстанции, Затем к полученному раствору добавили 0,8 мл ðàñтвора гипахларида натрия и сразу после смешения измеряли параметр А также, как в примере 1. Этот пример был равен

0,33+0,03 относительных единицы, Анализ занял около 5 мин, состоял иэ двух операций.

Для этой же серии карназина так же, как в примере 1, проводили определение антиакислительной активности препарата согласно способу-прототипу. Параметр Zj, отражающий антиакислительную активность был равен 1,21+0,2.

Суммарный расход карназина для такого анализа составлял 5 мг, ингибирующая концентрация в суммарном растворе сыворотки и FeSO4-2,2 мМ, время анализа — 3,5 ч, количество операций — 5, Пример 3, Для исследования взят карнаэин фирмы "Serve" (США), который использовался в исследованиях с предварительной очисткой (три перекристаллизации). Приготовлено 1 мл 2 мМ раствора карнозина, для чего было взята около 0,2 мг порошка субстанции, Затем к полученному раствору добавили 0,8 мл раствора гипохлорида натрия и сразу после смешения измеряли параметр А также, как в примере 1, Этот параметр был равен

0,35+0;03 относительных единиц.

Анализ занял около 5 мин, состоял из двух операций.

Для этой же серии карназина так же, как в примере 1, проводили определение анти1807353

О, Батдиева ентал Корректор М. Керецман

Заказ 1374 Тираж Подписное

8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 окислительной активности препарата сои, гласно способу-прототипу. Параметр Xi, отражающий антиокислительную активность был равен 1,0+6,3.

Суммарный расход карнозина для такого анализа составлял 5 мг, 507ь ингибирующая концентрация в суммарном растворе сыворотки и FeSO< для этой серии образцов не достигалась даже для 100 мМ концентрации карнозина, время анализа — 3,5 ч, количество операций — 5.

Пример 4. Для исследования взят карнозин, выделяемый из мяса крупного рогатого скота по оригинальной методике, разработанной на кафедре биохимии МГУ и внедренной на Ленинградском заводе медпрепаратов мясокомбината им.С.M,Êèðîâà.

Следует отметить, что по сравнению с коммерческим выпускаемым дипептидом, продукт из мяса обладает рядом особенностей, которые позволяют его считать более чистым, лишенным примесей от реагентов химического синтеза. Приготовлено 1 мл 2 мМ раствора карнозина, для чего было взято около 0,2 мг порошка субстанции, Затем к полученному раствору добавили 1 мл раствора гипохлорида натрия и сразу после смешения измеряли параметр А также, как в примере 1, Этот параметр был равен 0,31 + 0,06 относительных единиц.

Анализ занял около 5 мин, состоял из двух операций.

Параллельно определению расхода гипохлорйда для карнозина из мяса проводи ли биалбггйческое тестирование препарата согласйб способу-прототипу. Для этого также как,Ь-примepe 1 определяли параметр и, Zi = 0,8 =М,2, характеризующий эффектив- ность подавления карнозином образования вторичных перекисных продуктов. Суммарный расход карнозина для такбго анализа составлял 5 мг, 50 ингибирующая концентрация в суммарном растворе сыворотки к

FeSO< для,этой серии образцов не достигалась даже для 100 мМ концентрации карнозина, время анализа — 3,5 ч. .Из приведенных примеров 1-4 можно убедиться, что карнозин, выделяемый иэ мяса крупного рогатого скота, или перекриСоставитель

Редактор С. Кулакова Техред М.Морг. сталлизованный коммерческий препарат фирмы "Serva" (США) демонтстрировал согласно способу-прототипу даже меньшую антиокислительную активность по сравнению с неочищенным препаратом фирмы

5 "Яегча" (США). С другой стороны, новый способ тестирования дает величины А =

=0,32+0,04, 0,33 0,03, 0,35» 0,03 и

0,31 +0,06 относительных единиц для разных серий карноэина, что реально отражает

10 его антиокислительную активность, так как неочищенные коммерческие образцы содержат, согласно данным нашего анализа, более высокое содержание химически реак15 тивных компонентов — антиоксидантов, которые блокируют окисление в способе-прототипе. По мере очищения синтетического коммерческого карнозина путем перекристаллизации происходит

20 и уменьшение параметра Zi, который оценивается в способе-прототипе, но нет статистически значимых изменений параметра А согласно новому способу, Следовательно, использование способа-прототипа не позволяет с достаточной точностью определять а нтиокислительную а4тивность карнозина разного происхождения или разных серий. Напротив, по сравнению со спо3р собом-прототипом новый способ обладает большей точностью, позволяет уменьшить расход изучаемого вещества (0,2 мг в новом способе и 5 мг в способе-прототипе согласно примерам 1-4), ускорить (5 мин в новом

35 способе и 3,5 ч в способе-прототипе) и упростить способ (2 в новом способе и 5 процедур в способе-прототипе согласно примерам 1 — 4), 40 Формула изобретения

Способ определения антиокислительной активности карноэина путем добавления окислителя к раствору карнозина с последующей регистрацией оптических

45 свойств пробы, о тли ч а ю шийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, регистрируют изменения оптической плотности пробы, при 292 нм в качестве окислителя используют гипохлорид на50 трия