Синтетическая питательная среда для пропитки полиакриламидного геля, содержащего 0,95 мас.% иммобилизированного гемина, для выращивания бактерий fransiella тulаrеnsis

 

Использование: биотехнология, микробиология , диагностика туляремии. Сущность изобретения: твердую основу, содержащую полиакриламидный гель с иммобилизованным гемином, пропитывают .раствором, содержащим L-аргинин HCI, L- гистидин HCI, L-цистейн HCI, L-лизин HCI, О,1 -изолейцин, D.L-метионин, L-треонин, L- пролин, L-лейцин, L-валин, L-тирозин, L-ce- рин, L-аспарагиновую кислоту, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, тиамин хлорид, пантотенат кальция, D-глюкозу, аглицерофосфат и воду. Полученная твердая питательная среда позволяет культивиро- 00 вать единичные клетки туляремийного микроба . 2 табл.QJ Ы &

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„5UÄÄ 1818340 А1 (я)э С 12 N 1/20

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР)

Ф

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ /"» .::-."",. ."" -:

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ а (54) СИНТЕТИЧЕСКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ

СРЕДА ДЛЯ ПРОПИТКИ ПОЛИАКРИЛАМИДНОГО ГЕЛЯ, СОДЕРЖАЩЕГО 0,95

МАС.$ ИММОБИЛИЗИРОВАННОГО ГЕМИНА, ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ БАКТЕРИЙ

FRANSI ELLA TULARENSIS (57) Использование: биотехнология, микрония РглЫагепз1з содержит .-гистидин HCI, 1.-цистеин HCI, 1:лизин HCI, dl-изолейцин, df-метионин, L-треонин, L-пролин, Ь ейцин, L-валин, L-тирозин, (=серин, L-аспарагиновую кислоту, КН2РО4, NazHP04, NAG, MgS04 7HzO, тиамин, пантотенат кальция, глюкозу, dl- -глицерофосфат натрия, а в качестве уплотняющей основы используют полиакриламидный гель с иммобилизованной гемовой частью при следующем количест(21) 4800511/13 (22) 06.03.90 (46) 30.05.93. Бюл. М 20 (71) Всесоюзный научно-исследовательскии институт прикладной микробиологии (72) В.Г.Гавриков, В.Б.Розин, А.Н,Байдусь, В,И.Артюхин и П.В.Бабаева (56) Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследований./Под ред. Биргера M.O. М.: Медицина, 1973, с. 80.

Scharer I.М., II,fein F., Lincoln R.Е. Growth

and metabolism of live vaccine Strain of Тг.

tuIarensIs. AppI. Mlcroblol, 1968, v. 16, N. 6, р. 855-861.

NagIe S.Ñ. et аП//I.Bacteriol, ч. 79, М 2, р, 566-571.

Шишов Н.Н., Басилова Г.И., Некрасов

А.А., Пилипенко B.Ã., Майский В.Г., Пшеничная В.А. Рост различных рас туляремийного микроба на минеральной синтетической . среде. — Болезни с природной очаговостью на Кавказе, Ставрополь, 1982, с. 161.

Авторское свидетельство СССР

N 101347, кл. С 12 N 1/20, 1983.

Изобретение относится к микробиологии и касается плотных синтетических питательных сред для выращивания . туляремийного микроба.

Целью изобретения является повышение чувствительности синтетической плотной питательной среды, обеспечивающей образование колоний Fr, tularensis при засеве единичных клеток.

Это достигается тем, что синтетическая плотная питательная среда для выращивабиология, диагностика туляремии. Сущность изобретения: твердую основу, содержащую полиакриламидный гель с иммобилизованным гемином, пропитывают .раствором, содержащим L-аргинин HCI, 1= гистидин НО, 1=цистеин HCI, (= лизин HCf, )

0,1=изолейцин, ОД:метионин, 1=треонин, 1= пролин, L-лейцин, L-валин, L-тирозин, L-серин, L-аспарагиновую кислоту, калий фосфорнокислый одноэамещенный, натрий хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, тиамин хлорид, пантотенат кальция, О-глюкозу, аглицерофосфат и воду. Полученная твердая питательная среда позволяет культивиро- ОО вать единичные клетки туляремийного мик- а роба. 2 табл. ОО

1818340 венном соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды: !

=аргинин HCI 0,100-0,300 !

=гистидин HCI 1,100-2,000 !

=цистеин HCI 1,000-1,500 !

=лизин HCI 0,200 — 0,500

dl-изолейцин 0,100 — 0,200

dl-метионин 0,200-0,500

L-треонин 1,900-2,500

L-пролин 0,900-1,500

L;ëåéöèí 0,200-0,500

L-валин 0,750 — 1,000 (:тирозин 0,100-0,300 (:серин 0,100 — 0,300

L-аспарагиновая кислота 0,100-0,300

КН2Р04 2,600-3,100

NaCI 4,500 — 5,500

MgS04 7Н20 0,030-0,050

Na2HP04 1,500-1,800

Тиамин НС! 0,015-0,025

Пантотенат кальция 0,040-0,060

О-глюкоза 0,01-8,000 а-глицерофосфат натрия 30,00-20,00 гемоглобин (щелочной ,гидролизат) 30,00 — 70,00 вода до 1л, Готовят питательную среду следующим образом.

П ример1, 1.Приготовление растворов аминокислот и добавок для пропитывания дисков.

На аналитических весах взвешивают следующие вещества, г; (=аргинин НС! 0,100

1=гистидин НС! 1,100

1=цистеин НС! 1,000 !

=лизин HCI 0,200

dl-изолейцин 0,100

dl-метионин 0,200 !

=треонин 1,900 !

=пролин 0,900 !

=лейцин 0,200

1.-валин 0,750

1:тирозин 0,100 ! -серин 0,100

L-аспарагиновая кислота 0,100

КН2Р04 2,600

NaCI 4,500

MgSO4 7Н20 . 0,030 йагНР04 1,500

Тиамин HCI 0,015

Пантотенат кальция 0,040

0-глюкоза 0,010 а-глицерофосфат натрия 30,000

Навески КН2Р04 и Na2HP04 растворяют в 750 мл дистиллированной воды. Каждую навеску аминокислот, за исключением L-цистеина, растворяют в 30-40 мл полученного буферного раствора при нагревании (7090 С) и полученные растворы объединяют, Для растворения L-тирозина к навеске этой аминокислоты добавляют 2 мл 1 н. едкого натрия, перемешивают и приливают ЗΠ— 40

5 мл фосфатного буфера и после полного растворения тирозина объединяют со смесью остальных аминокислот. Хлористый натрий и сернокислый магний растворяют в 30 — 40 мл дистиллированной воды и добавляют к

"0 смеси аминокислот. Остатки фосфатного byфера также приливают к смеси и объем ее доводят до 850 мл, проверяют рН и, если необходимо, подтитровывают 0,1 н. раствором кислоты или щелочи до значений рН =

15 =6,8+0,2, Раствор аминокислот и солей стерилизуют 30 минут при 0,5 атмосферах. Каждую из навесок тиамина, цистеина, пантотената кальция, глюкозы и а-глицерофосфата натрия растворяют в 25 — ЗО мл

20 дистиллированной воды и стерилизуют при тех же условиях. Приготовленные растворы могут храниться длительное время (кроме цистеина и пантотената кальция} в холодильнике при 2 С до использования, Перед использованием все растворы сливают, 2. Получение щелочного гидролизата гемоглобина

В 400 мл дистиллированной воды растворяют 25 r гемоглобина и добавля ют 15 мл

30 40 Д-ного раствора едкого натрия, Полученную смесь инкубируют на кипящей водяной бане в течение 60+5 мин, После этого щелочной гидролизат гемоглобина охлаждают до комнатной температуры.

3. Приготовление полиакриламидных (ПАА) дисков

Полученный щелочной гидролизат гемоглобина (п.2) нейтрализуют 207; соляной кислотой до рН 8,5 и доводят объем дистил40 лированной водой до 500 мл, В 110 мл нейтрализованного щелочного гидоролизата гемоглобина последовател ьно растворяют 23,0 г акриламида, 0,7 г персульфата аммония, 0,28 г

N,N-метиленбисакриламида и 0,12 мл

N,N,N,N -тетраметилэтилендиамина (ТЕМЕД). Полученный раствор разливают в формы для получения дисков (например чашки Петри) и проводят полимеризацию при комнатной температуре в течение 3-4 часов.

Приготовленные ПАА-диски помещают в дистиллированную воду из расчета 50-60 мл воды на 1 диск. Процесс отмывки ведут в

55 течение 5 суток при комнатной температуре, меняя воду каждые сутки, В отмывочных водах проверяют наличие аминокислот по реакции с нингидрином, Окончанием отмывки считают получение отрицательной пробы на аминокислоты, Отмытые диски по1818340 мещают в широкогорлую колбу, заливают дистиллированной водой и автоклавируют

20 минут при 1 атмосфере, 4. Пропитка ПАА-дисков раствором жидкой питательной среды и раскладывание в чашки Петри

Стерильные ПАА-диски асептически переносят в стерильный раствор аминокислот со всеми добавками из расчета 20 — 30 мл жидкой питательной среды на 1 диск, Пропитывание ведут при комнатной температуре в течение 18 часов. Затем диски асепгически раскладывают в стерильные чашки Петри. Полученная синтетическая плотная питательная среда хранится при

4 С в холодильнике в течение 3 — 4 недель, 5. Проверка чувствительности полученной синтетической плотной питательной среды микробиологическим способом

Клетки наглы!агелз!э, выращенные на жидких или плотных питательных средах, отмывали питательной среды центрифугированием в физиологическом растворе, а затем суспендировали в этом же растворе, Используя стандарт мутности ГИСК им.

Л.АХарасевича, готовили 1 млрд суспенэию клеток в 1 мл, а также 10-кратные ее разведения в физиологическом растворе. Полученные разведения на чашки с предлагаемой синтетической питательной средой и чашки с плотной питательной средой на основе сернокислотного гидролизата рыбной муки из расчета 10, 100, 1000 клеток на чашку, После инкубирования чашек при 37ОС в течение 3 — 5 суток проводили подсчет выросших колоний, Результаты этих экспериментов приведены в табл.1.

Из приведенных данных видно, что предлагаемая синтетическая плотная питательная среда по чувствительности не уступает, а даже несколько превосходит плотную питательную среду сложного состава, обычно используемую для определения количества жизнеспособных клеток данного микроорганизма.

Пример 2. Приготовление синтетической плотной питательной среды.

1. Приготовление раствора аминокислот и добавок для пропитки дисков.

На аналитических весах взвешивают следующие вещества, г:

1=аргинин HCI 0,300 ! -гистидин НС! 2,00

L-цистеин HCI 1,500

1..-лизин HCI 0,500

dl-изолейцин 0,200

dl-метионин 0,500

1=треонин 2,500

L-п роли н 1,500 ! -лейцин 0,500!

=валин 1,000

L-ти розин 0,300 !

=серин 0,300

L-аспарагиновая кислота 0,300

5 KH2P04 3,100

NaCl 5,500

Mg SO4 7Н20 0,050

Na2HP04 1,800

Тиамин HCI 0,025

10 Пантотенат кальция 0,060

О-глюкоза 8,000 а-глицерофосфат натрия 20,000 дистиллированная вода до 1 л.

Порядок растворения аминокислот и

15 добавок такой же как в примере 1.

Остальные операции по приготовлению плотной синтетической питательной среды проводят, как в примере 1, и. 2,3,4.

2. Проверка чувствительности получен20 ной плотной синтетической питательной среды микробиологическим способом

Суспензию клеток и их разведения готовят, как в примере 1 и также высевают 10, 100, 1000 клеток на две питательные среды.

25 Результаты экспериментов отражены в табл.2.

Полученные данные указывают на то, что предлагаемая среда не уступает по своей чувствительности сложной питатель30 ной среде.

Пример 3. Приготовление плотной синтетической среды с использованием для пропитки дисков жидкой синтетической среды по прописи Майского и соавторов.

35 1. Жидкую питательную среду готовили, как описано в примере 1 или 2, пропитывали жидкой синтетической питательной средой, Микробиологическую проверку чувствительности проводили, как описано выше.

40 Использование для пропитки ПАА-дисков жидкой синтетической питательной среды по прописи Майского и соавторов не приводит к увеличению чувствительности синтетической плотной питательной среды.

45 Формула изобретения

Синтетическая питательная среда для пропитки полиакриламидного геля, содержащего 0,95 мас.$ иммобилизированного гемина для выращивания бактерий

50 Fransiella tularensls, отличающаяся тем, что, с целью увеличения чувствительности среды, обеспечивающей рост из единичных колоний, она содержит следующие компоненты, г/л:

55 !=аргинин HCI 0,100 — 0,300 !

=гоистидин НС! 1,100 — 2,000

L-цистеин НС! 1,000-1,500

L-лизин HCI 0,200-0,500

D,L-изолейцин 0,100 — 0,200

ОЯ=метионин 0,200 — 0,500

1818340

Таблица1

Средние числа выросших колоний Fr. tularensis на чашках с предлагаемой синтетической средой и средой на основе сернокислотного гидролизата рыбной муки (ГРМ)*) Таблица2

Сравнение числа выросших колоний Fr. Ыагепз1з на чашках с предлагаемой синтетической средой и ГРМ ) Составитель В.Гавриков

Техред M.Моргентал Корректор М,Ткач

Редактор

Заказ 1925 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

L-треонин

L-пролин

L-лейцин

L-валин (.-ти розин

1=серин

L-аспарагиновая

КНгРОд

NaO

1,900-2,500

0,900-1,500

0,200-0,500

0,750-1;000

0,100-0,300 5

0,100-0,300 кислота 0,100-0,300

2,600-3,100

4.500 — 5,500

MgS04 7Нг0 йщН Р04

Тиамин HCI

Пантотенат кальция

D-глюкоза а -глицерофосфат вода

0,030 — 0,050

1,500-1,800

0,015 — 0,025

0,040-0,060

0,000-8,00

30,000-20,000 до1л.