Способ получения производственных штаммов вируса клещевого энцефалита

 

Использование: медицинская вирусология , биотехнология. Сущность изобретения: отбор штаммов ведут из свежевыделенных Изобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к способам отбора высокоактивных штаммов вируса для производства инактивированных вакцин и диагностических препаратов. Целью изобретения является разработка способа отбора штаммов вируса клещевого энцефалита с высокой антигенной и биологической; активностью для производства инактивированных вакцин, диагностикумов и биологических реагентов для типирования штаммов (типоспецифических штаммов природной популяции вируса из клещей Ixodes persulcatus, обитающих в наиболее типичных классических очагах клещевого энцефалита восточного антигенного варианта, изученных на II-III пассажах по следующим признакам: нейровирулентность (Ig ЛДэо/мл) при внутримозговом введении в пределах 9,0-11,0; при периферическом введении 8,0-9,72; индекс инвазивности 0,42-1,6; гемагглютинирующая активность штамма при репродукции в моз- .гу мышей в пределах 1:1280-1:10240 в зонах рН 6,0-7,0. индекс биологической нейтрализации с гомогологичной сывороткой в пределах 2,6-3,8; индекс инактивации эфиром 2,5-5,0 (Ig ЛДбо/0,03 мл), индекс терморезистентности (Tso) 0,7-2,8; бляшкообразующая активность (Ig БОЕ/мл) 9,5; S - признак (размер бляшек в мм на 4-7 сутки) 1,0-4,5 соответственно; цитопатическая активность (Ig ТЦД БО/МЛ) 8,2-9,5. В заключительный этап отбора предусматривается соответствие целям: получение вакцин, диагностикумов, биологических реагентов. 2 табл. сывороток и иммунных асцитических жидкостей - ИАЖ). Это достигается тем, что отбор ведут не эмпирическим путем, а на основе популяционного подхода. Он означает многокомпонентный анализ популяции, определение источников выделения штаммов и выбор из охарактеризованного набора штаммов адекватного штамма на основе целей. Отбор ведут из свежевыделенных штаммов природной популяции вируса из клещей I. persulcatus, обитающих в наиболее типичел с оо 00 со 4 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) "4 =НА

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4853821/13 (22) 05.06.90 (46) 30.05.93. Бюл, N. 20 (71) Хабаровский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии и

Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им, Л.А.Тарасевича (72) Л.А.Верета, M.Ñ.ÂoðoáüåBà, О.В.Островская, P.Н,Воробьева, И,П.Ладыженская, А.В. Разгуляева, M.Í. Рас щепкина, С.П. Николаева и Н.M. Пуховская (56) Резепова А.И. Диагностикумы вирусов клещевого энцефалита и американских лошадиных энцефаломиелитов для реакции торможения гемагглютинации. Автореф. дисс. канд. M., 1965, с. 17. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ LLITAMMOB ВИРУСА KflELLIEBQГО ЭНЦЕФАЛИТА (57) Использование: медицинская вирусология, биотехнология. Сущность изобретения: отбор штаммов ведут из свежевыделенных

Изобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к способам отбора высокоактивных штаммов вируса для производства инактивированных вакцин и диагностических препаратов.

Целью изобретения является разработка способа отбора штаммов вируса клещевого энцефалита с высокой антигенной и биологической активностью для производства инактивированных вакцин. диагностикумов и биологических реагентов для типирования штаммов (типоспецифических

„„5U„„1818343 А1 (я)5 С 12 N 7/00, А 61 К 39/12 штаммов природной популяции вируса из клещей Ixodes регзШсамз, обитающих в наиболее типичных классических очагах клещевоl о энцефалита восточного антигенного варианта, изученных на IHII пассажах по следующим признакам: нейровирулентность (Ig ЛД50/мл) при внутримозговом введении в пределах 9,0 — 11,0; при периферическом введении 8,0 — 9,72; индекс инвазивности 0,42 — 1,6; гемагглютинирующая активность штамма при репродукции в мозгу мышей в пределах 1;1280 — 1:10240 в зонах рН 6,0 — 7,0, индекс биологической нейтрализации с гомогологичной сывороткой в пределах 2,6 — 3,8; индекс инактивации эфиром

2,5-5,0 (Ig ЛД5о/0,03 мл), индекс терморези- Я стентности (T5p) 0,7-2,8; бляшкообраэующая активность (Ig БО Е /мл) 9,5; S — признак (размер бляшек в мм на 4-7 сутки) 1,0 — 4,5 соответственно; цитопатическая активность (Ig ТЦД 5p>M>) 8,2 — 9.5. В заключительный этап отбора предусматривается соответствие целям; получение вакцин, диагностикумов, биологических реагентов.

2 табл. сывороток и иммунных асцитических жидкостей — ИАЖ).

Это достигается тем, что отбор ведут не эмпирическим путем, а на основе популяционного подхода. Он означает многокомпонентный анализ популяции, определение источников выделения штаммов и выбор из охарактеризованного набора штаммов адекватного штамма на основе целей.

Отбор ведут иэ свежевыделенных штаммов природной популяции вируса из клещей

i. persuIcatus, обитающих в наиболее типич1818343 ных классических очагах клещевого энцефа- Ig ЛД5о/мл), геммаглютинирующая активлита восточного антигенного варианта, изу- ность штамма при реп при репродукции в мозгу мыченных на втором — третьем пассажах через шей в пределах 1:1280 — 1:10240 в зонах рН мозг нелинейных белых мышей массой 6 — 8 6 0 — 7 0 индекс био о г, по следующим признакам: нейровирулен- 5 ции штамма с гомологичной сывороткой в тность при внутримозговом введении бес- пределах 2,6-3,8 (в I ЛД ), — в g Д5о), индекс термопородным белым мышам должна быть в резистентности в пределах 0,7-2,8, индекс пределах 9,0 — 11,0, при периферическом инактивации штамма эф ш мма эфиром — в пределах введении — 8,0 — 9,72 Ig ЛД5о/мл индекс 2,5 — 5,0. инвазивности в пределах 0,42 — 1,6 (в Ig 10 При отборе штаммов вируса для произД5о/мл), гемагглютинирующая активность водства диагностических ких препаратов кроме штамма при репродукции в мозгу мышей в того учитывают наиболее раннее появление пределах 1:1280 — 1:10240 в зонах рН 6,0 — 7,0; гемагглютинирующей активности в исходантигенная активность, выраженная в и ных пассажах, ндексе нейтрализации штамма с гомологич- 15 Пример. Ш И ! тамм r! !xodlcl ной сывороткой — в пределах 2,6 — 3,8 (в Ig encephalitldls hl. 7 выделен в мае 1985 года

Д5о/м,); индекс инактивации штамма эфи- из самок клеща !. persulcatus, обитающих в ром — в пределах 2,5-5,0; индекс терморези- зоне хвойно-широколиственных лесов райстентности (T5o) в пределах 0,7 — 2,8; она им. Лазо Хабаровского края. бляшкообраэующая активность 8,1 — 10,1 Ig 20 Штамм выделен 8

Б / — тамм выделен на день после заражеI Т

ОЕ/мл,цитопатическаяактивность8,2 — 9,5 ния в мозг мышей сус — мышей суспензий клещей, на 1

g ЦД5о; S — признак (диаметр бляшек в пассаже-инкубация — 6 дней, Изучение мм) — на 4 — 7 сутки 1,0 — 4,5 мм, соответствен- штамма проведено на уровне 2 — 3 пассажа но. через мозг мышей по следующим признаПри отборе штаммов вируса для произ- 25 кам; нейровирулентность при внутримоэговодства диагностических препаратов кроме вом введении беспородным белым мышам в того учитывают наиболее раннее проявле- Ig ЛД5о/ — 9 12 — 95 I ЛД.

» —, —, g Д50/» при инкубание гемагглютинирующей активности в ис- ционном периоде 4-5 ходных пассажах на мышах. вирулентность при подкожном введении в

Способ отбора осуществляется следую- 30 !9ЛД5о/» — 8,0 Ig ЛД5о/„: при инкубационщим образом: берут 50 — 70 штаммов при- ном периоде проявления клиники — 5— родной популяции вируса клещевого 6 дней, индекс инваэивности (!!) — I,12-1,5 энцефалита, выделенных из клещей 1. Ig ËÄ5o/», индекс нейтрализации(Щ-3,5persulcatus в классическом очаге клещевого 3 8 tg ЛД5о гема

I 5о, гемагглютинирующая. активэнцефалита восточного антигенного вари- 35 ность 1:2560 в зоне рН вЂ” 6,2-6,7; энта и на 2 — 3 пассаже через мозг белых чувствительность по отношению к эфиру— мышей изучают основные признаки анти- 2 8 Ig ЛД5о/ооз инде ! 50 о,o3, индекс терморезистентногенной и биологической активности. В ча- сти (Т5о) — 0,72 !9 ЛД

"5O/O.О3. стности инфекционную активность Штамм хорошо размножается в пе р деляют по неировирулентности при 40 ваемой культуре клеток СПЭВ, вызывая внутримозговом и экстраневральном введе- цитодеструкцию клеток на 4 — 5 сутки, титр—

Л нии штаммов вируса белым мышам (Ig 90 — 95 Ig ТЦД б

5о/мл, о разует на 4 сутки

p5o/») и инвазивности; гемагглютинирую- бляшки на культуре СПЭВ и под агаровым щую активность в РГА в различных зонах рН покрытием, титры штамма по бляшкообрасреды. Исследуют также физико-химиче- 45 зующей активности 9,5 Ig БОЕ/мл; размер ские признаки: терморезистентность (Т5о), бляшек (S-признак) — 1,0-1.5 мм, к 7 суткам устойчивость по отношению к эфиру. Анти- размер бляшек — 2 5-4 5 я к —, —, мм; морфологичегенную активность определяют по уровню ская характеристика бляшек: округлой фортитров антител в РБН; тест нейтрализации мы, с диффузным краем, применяют также для идентификации изу- 50 Штамм имее б меет лизкое антигенное роди восточным антигенными чаемых штаммов. Антигенные связи штам- ство с западным и во т мов изучают в РТГА и PCK с набором вариантами вир с ми вируса клещевого энцефалиантисывороток к западным и восточным ва- та, риантам вируса, Оценку производят по вы- Штамм f4 7 испо, раженности показателей (табл.1). 55 эталонной иму о использован для получения алонной имунной асцитической мышиТак нейровирулентность при внутри- ной жидкости(ИАЖ) и для получения типомозговом введении нелинейным белым мы- специфических сыво РТГ сывороток для ТГА и РСК, шам должна быть в пределах 9.0 — 11,0. при применяемых для серодиагностики и иденперифрическом введении — 8,0-9,72, ин- тификации штаммов в и штаммов вируса клещевого эндекс инваэивности — в пределах 0,42-1,6 (e цефалита.

1818343

Таблица 1

Признаки отбора штамма вируса клещевого энцефалита с высокой антигенной и биологической активностью (штамма ¹ 7) Признаки, по которым производил- Предел колебаний пося отбор штаммов казателей для отбора №№ пп

Штамм для приготовления гипоспецифических сывороток и

ИАЖ

Нейровирулентность при мозговом пути введения (lg ЛД5о/мл)

Нейровирулентность при периферическом пути введения (Ig ЛД о/)

Индекс инвазивности (Ig ЛД5о/мл)

Индекс нейтрализации (Ig ЛД1о/мд)

Индекс инактивации эфиром (Ig ЛДьо/о,оз)

Индекс терморезистентности (Т50) lg ЛД50/0,03

Бляшкообраэующая активность (lg БОЕ/мл)

S ïðèçíàê

9,12 — 9,5

9,0 — 11,0

8,0 — 9,7

0,42-1,6

2,6-3,8

8,0

1,12 — 1,5

3,5-3,8

2,5-5,0

2,8

0,7-2,8

0,72

8,1-10,1

На 4 — 7 сутки соответственно 1,0-4,5 мм

9,0-9,5

1,0 — 4,5

9,0-9,5

1:2560

6,2-6,7

Цитопатическая активность на культуре СПЭВ (Ig ТЦДьо/)

Гемагглютинирующая активность

8,2-9,5

1:1280

1:10240

6,0-7,0

Зоны Н

Перечисленные признаки штамма № 7 укладываются в параметры схемы отбора (табл.1) и характеризуют его, как наиболее активный среди штаммов изученной популяции, Преимущество предлагаемого способа отбора по сравнению с известными состоит в том, что популяционный подход позволяет оценить полно практически всю совокупность генофонда природной популяции в очагах, где возникают тяжелые паралитические формы клещевого энцефалита, и выбрать наиболее вирулентные штаммы, отличающиеся высокой репродуктивной способностью при размножении в мозге мышей и в культуре ткани куриного эмбриона — свойств, полезных для производства.

Имеется возможность направленного отбора штаммов с определенными характеристиками — например, штамм № 7, отличающийся активностью преимущественно по антигенным свойствам.

Спектр антигенной активности штаммов должен быть достаточен для образования антител по отношению к восточному и западному вариантам вируса КЭ. что свойственно отобранному штамму № 7.

В перекрестной РТГА и РСК с использованием гипериммунных сывороток и ИАЖ выявлено тесное антигенное родство штамма № 7 с западными и восточными штаммами вируса КЭ (табл.2), Формула изобретения

5 Способ получения производственных штаммов вируса клещевого энцефалита, включающий первичное выделение изолятов вируса из клещей Ixodes persulcatus u отбор штаммов по биологическим характе10 ристикам, отличающийся тем, что, с целью повышения репродуктивности и иммуногенной активности, отбор штаммов осуществляют на 2 — 3-м пассаже после первичного выделения по следующим биологи15 ческим характеристикам: нейровирулентность при внутримозговом введении—

9,0 — 11,0; то же при периферическом введении — 8.0 — 9,72; индекс инвазивности — 0,42—

1,6; гемагглютинирующая активность при

20 репродукции в мозгу мышей 1:1280 — 1:10240 при рН 6.0 — 7.0; индекс биологической нейтрализации с гомологичной сывороткой— . 2,6-3,8; индекс инактивации эфиром 2,5 — 5,0 (lg ЛДы /0,03 мл), индекс терморезистент25 ности при 50 С вЂ” 0,7 — 2,8; размер бляшек на

4 — 7-е сутки после заражения клеток — 1,04,5 мм; бляшкообразующая активность не ниже 9,5 БОЕ/мл и цитопатическая активность 9,0 — 9,5 ед. ТЦД5о/мл.

1818343

Таблица 2

Антигенная характеристика штамма N- 7 (по данным РТГА и РСК) *) титры даны в обратных величинах н/и — не исследовали

Составитель Л. Верета

Техред М.Моргентал Корректор П, Гереши

Редактор О. Павлова

Заказ 1926 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". r. Ужгород, ул.Гагарина 1.01