Штамм virus нератiтis а номinis для приготовления вакцинных и диагностических препаратов

 

Использование: медицинская вирусология . Сущность изобретения: штамм ГИСК № 213 выделен из фекалий больного и адаптирован к культуре FRhK-4. Инкубационный период внутриклеточного антигена наблюдается в течение 2 сут.;наибольшее количество антигена отмечается на 7-8 сут. и составляет 1:64. Штамм обладает цитопатическим эффектом. Инфекционный титр составляет (3-5)-105 БОЕ/мл. Штамм ГИСК N 213, адаптированный к диплоидным клеткам Л-68, обладает иммуногенной активностью . Титр антител у морских свинок составляет 1:100-1:1000. 1 табл.

СОВХОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) Н Iу (я)л С 12 N 7/00

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

С о вй

)Ю . С) (21) 4942414/13 . (22) 29,04,91 (46) 30.03.93. Бюл, ¹ 12 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Научнопроизводственного объединения "Вектор" (72) А.Г,Майданюк, Е.П.Бондаренко, Ю.В.Немцов, Г,И,Тюнников, В.Б.Конакова, Н.В.Мамаева и В.E.×èæèêîâ (73) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Научнопроизводственного объединения "Вектор" (56) Авторское свидетельство СССР

N 1328376, кл. С 12 N 7/00, 1987.

Авторское свидетельство СССР

¹ 1606533, кл, С 12 М 7/00, 1990.

Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается получения быстрорастущего штамма вируса гепатита А (ВГА).

Этот штамм может быть использован в профилактических и диагностических целях в медицине, Целью изобретения является получение в культуре клеток быстрорастущего штамма

ВГА, способного образовывать бляшки, что значительно упрощает и удешевляет работу при получении диагностических и профилактических препаратов, Штамм ВГА МБ-7 депонирован под

N 213 в коллекции Государственного института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича.

Штамм получен из фекалий больного с клинически выраженными признаками гепатита А в 1988 г. Приготовленную 10% гус(54) ШТАММ VIRUS HEPATITIS А H0MINIS

ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИННЫХ И

ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ (57) Использование: медицинская вирусология. Сущность изобретения: штамм ГИСК

N. 213 выделен из фекалий больного и адаптирован к культуре FRhK-4. Инкубационный период внутриклеточного антигена наблюдается в течение 2 сут.,наибольшее количество антигена отмечается на 7-8 сут. и составляет 1:64, Штамм обладает цитопатическим эффектом. Инфекционный титр составляет(3 — 5) 10 БОЕ/мл. Штамм ГИСК №

213, адаптированный к диплоидным клеткам Л-68, обладает иммуногенной активностью. Титр антител у морских свинок с оста вл яет 1:100-1:1000. 1 табл. пензию фекалий на 0,1 М Na-фосфатном буфере (рН 7,4) ресуспендируют, центрифугируют в течение 10 мин при 1500 — 2000 o6/мин.

Супернатант фильтруют через фильтр

0,22 мкм (производство МИПроге), фасуют по 0,5 мл в стерильные флаконы и хранят при температуре (-70 0.5) С. Полученный супернэтант используют в качестве инокулята для получения штамма ВГА на клетках

FRhK-4.

На сформированный монослой клеток

FRhK-4 наносят инокулят. После адсорбции в сосуд добавляют ростовую поддерживаю".Ую среду. Через неделю после заражения культуральную жидкость сливают, клетки промывают раствором трипсина-версена и отслоившиеся клетки собирают в натрий-солевом фосфатном буфере. Собранные клетки трижды промораживают и клеточный лизат используют в качестве инокулята для

1806190 следующего пассажа. Уже на втором пассаже в клетках FRhK-4 выявляется антиген.

Антиген также выявляется в процессе адаптации полученного штамма к перевиваемой культуре клеток почки зеленой мартышки 4647 и диплоидной культуре клеток легкого человека Л68. Возможна адаптация штамма и к другим клеточным линиям.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Частицы

ВГА, содержащие РНК, по данным электронной микроскопии имеют диаметр 27 нм.

Основная масса частиц имеет плавучую плотность 1,34 г/см в градиенте хлористого цезия и коэффициент седиментации 155160 S20w — в градиенте нейтральной сахарозы.

Культуральные свойства. Для культивирования штамма ВГА на клетках FRhK-4 используют поддерживающую среду Игла

МЭМ, содержащую 5 фетальной сыворотки крупного рогатого скота и антибиотики пенициллин и стрептомицин по 100 ед/мл и

100 мгlмл,соответственно. В качестве ростовой среды для клеток используют ту же среду с 10 фетальной сыворотки и указанными выше концентрациями антибиотиков. Культивирование штамма ВГА МБ-7 на клетках FRhK-4 под покрытием, содер- жащим 5 бактоагара, на 11-12 сутки приводит к образованию четких бляшек размером

1-3 мм.

Реакцию нейтрализации проводят на уровне пятого пассажа с нейтрализуемым отраслевым стандартным образом (OCO ) и иммуноглобулинами, содержащими специфичные антитела к вирусу гепатита А (lgG).

В течение 1,5 ч каждое разведение вируса в равных объемах инкубируют с эмбриональной сывороткой плодов коров, с ОСО и

° фракцией сыворотки реконвалесцента, содержащей иммуноглобулины класса G(lgG).

Затем по 0,2 мл каждого комплекса наносят на слитный монослой клеток FRhK-4 и инкубируют 1,5 — 2 ч при комнатной температуре, После адсорбции клетки культивируют под покрытием, содержащим 5 бактоагара.

Через 10-12 суток на монослое появляются бляшки.

В результате реакции нейтрализации антитела, содержащиеся в OCO и IgG, нейтрализуют часть вирусных частиц в препарате, в результате чего титр вируса в образцах, содержащих ОСО+ и IgG на порядок отличается от титра исходного вируса.

При иммунизации животных очищенным вирусом отмечается нарастание специфических антител в титрах 1:100-1;1000.

С целью исследования данного штамма на молекулярном уровне был проведен анализ кДНК, полученный на матрице вирусной

РНК, с помощью метода амплификации

ДНК. Затравками в процессе амплификации служил набор олигонуклеотидов, выбранных и синтезированных на основе теоретического анализа наиболее консервативных участков РНК нескольких известны- штам10 мов ВГА, Такой анализ, проведенный с по. мощью термостабильной ДНК полимеразы, обнаружил наличие небольшого фрагмента размером около 270 н,п„аналогично фрагменту в составе рекомбинантной плазмиды, 15 содержащей ген белка VP 1 вируса HAS- I5, Гибридизационный анализ этого участка с соответствующими мечеными праймерами, а также с ник-транслированным фрагментом гена VP 1 в составе рекомбинантной

20 плазмиды дал положительный ответ. Анализируя в ПАА-SDS геле высо:.;оочищенный

ВГА штамм МБ-7, выявили при окраске по методу Кумасси три полипептида с относительнйм . мол. массами 34000 (V1 1), 25500

25 (VP 2) и 23000 (VP 3).

Электронно-микроскопическое исследование с помощью негативного контраста позволило обнаружить час-,ицы вируса гепатита А в клеточном лизате, культуральной

30 жидкости, сконцентрировачной в 100 раз.и культуральной жидкости, очищенной в градиенте CsCI.

Вирусные частицы имеют типичную морфологию и представляют собой сфери35 ческие частицы с диаметром 25-28 нм. Концентрация в клеточном лизате составляет

10 в.ч,/мл, а в очищенной культуральной

7 жидкости — 10 в.ч,/мл. Следовательно, по

g ° физико-химическим и антигенным свойст40 вам штамм не отличается от естественного циркулирующего в природе ВГА и штамма

HAS-15, адаптированного к перевиваемой культуре клеток 4647. Приведенные примеры подробно раскрывают сущность изобре45 тения.

Пример 1. Получение штамма ВГА

МБ-7.

Штамм ВГА МБ-7 получают из фекалий больного с. клинически выраженными при50 знаками гепатита А. Готовят 10 суспензию фекалий на 0,1 М натрий-солевом фосфатном буфере (рН 7,4), центрифугируют в течение 10 мин при 1500-2000 об/мин.

Профильтрованный через фильтр с диа55 метром пор 0,22 мкм (МПИроге) супернатант фасуют и замораживают с последующим использованием в качестве инокулята.

Культивирование клеток FRhK-4 до формирования монослоя осуществляют на среде. Игла М3М с 10 фетальной сыворотки и

1806190

Продукция антигена ВГА в клетках FRhK-4, определенная в реакции ИФА

* Средние арифметические значения внутриклеточного антигена . водятся по 3 независимым пробам в о.е, ** Оценка стандэргного среднеквадратичного отклонения ср=-днегс: ифметического значения. антибиотиками пенициллином и стрептомицином в количестве 100 ед/мл и 100 мг/мл среды, соответственно.

На предварительно сформированный слитный монослой перевиваемых клеток почки эмбриона макаки резус(FRhK-4) наносят профильтрованную 10 суспензию фекалий и инкубируют при (37й0,5) С в течение двух часов. Инокулят сливают, монослой промывают раствором Эрла и добавляют поддерживающую среду. Через неделю культуральную. жидкость сливают, клетки промывают трипсином-версеном дважды и добавляют 0,1 М натрий-солевой фосфатный буфер (рН 7,4). Суспензию клеток трижды промораживают при -70 1,0) С для более полного разрушения клеток и клеточный лизат используют в качестве инокулята для следующего пассажа.

Очищенный вирус получают после трехкратного замораживания и оттаивания культуральной жидкости вместе с клетками.

Дебрис удаляют низкоскоростным центрифугированием (2000 об/мин, 0,5 — 1 ч), добавляют сульфат аммония в расчете 24 г на

100 мл супернатанта, Осадок формируют в холодильнике в течение суток при (4+6,5) С, далее центрифугируют при 8000 g a течение

1 — 2 ч. Осадок ресуспендируют в необходимом объеме 0,1 M натрий-солевого буфера с рН 7,4. Вирус гепатита А осаждают через подушку 20 раствора сахарозы с последующим центрифугированием в градиенте хлористого цезия, Пример 2, Культивирование штамма и получение вирусного антигена.

Для культивирования штамма М 213 на клетках FRhK-4 используют среду Игла

МЭМ, содержащую 5 эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и антибиотики, как в примере 1.

Достаточное для определения количестBQ внутриклеточного энтигена (f10 данным

ИФА) в клетках FRhK-4 появляется уже на

3 сутки (таблица). Наибольшее количест5 во антигена в этой системе выявляется на

7 — 8 сутки и составляет 1;64, что сопоставимо с параметрами для системы FRhK-4НА$-15, Особенностью заявляемого штамма яв10 ляется способность образовывать крупные бляшки, что значительно упрощает работу, Для получения бляшек штамм культивируют на клетках FRhK-4. Для этой цели клетки выращивают на плоских флаконах объемом

15 50 мл до формирования слитного монослоя, отмывают раствором Эрла, наносят инокулят, Через два часа монослой отмывают и наносят покрытие. В качестве покрытия используют среду Игла МЭМ, 2 фетальной

20 сыворотки и 5 бактоагара. Флаконы инкубируют две недели в термостате при температуре (36,5+0,5) С, затем манослой окрашивают 0,05 раствором кристалла виолета, отмывают в течение 1 — 2 мин проточ25 ной водой и подсчитывают бляшки.

Инфекционный титр ВГА нэ уровне 5-ro пассажа составляет (3 — 5) 10 БОЕ/мл, Таким образом, результаты эксперимента показали, что заявляемый штамм

30 (быстрорастущий и обладающие цитопатическим эффектом) может быть использован при получении вакцинных пр эратов, а также при получени ; —:игена в необходимом количес " дл и пользования в раз35 личных тест-сис емэх.

Формула изобретения

Штамм virus hepatitis А hominis ГИСК hh

40 213 для приготовления вакцинных и диагностических препаратов.