Способ приготовления подложки для культивирования клеток заднего эпителия роговицы глаза

 

Использование: биотехнология, медицина В 3%-ный водный раствор желатины вводят N.N.N1 ,Nf -тетраизопропоксиметилдиамид малоновой кислоты (в виде 1 %-ного водного раствора) до конечной концентрации 0,9 х М. Приготовление пленок-подложек в отверстии миллипорового фильтра осуществляют путем погружения его вЗ %- ный водный раствор желатины, затем сушат при температуре 20°С и относительной влажности 65% в течение 30 мин Способ позволяет упростить и ускорить процесс приготовления желатиновых подложек для культивирования клеток заднего эпителия роговицы глаза и их последующей трансплантации 1 табл &

сОюз сОВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕ СКИХ

РЕСПУБЛИК

IsI>s С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) @еЗНАЯ

ХйлЧЕРНЙ1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ЬЭ

4 () (К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4918466/13 (22) 29.11.90 (46) 23,06.93. Бюл, 1Ф 23 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт гриппа. Ленинградский институт киноинженеров, Военно-медицинская академия им. С.М.Кирова и Туркменский государственный медицинский институт (72) К.С.Каранов, Н.H.Hóðìàìåäoâ. П.М.Заелин, М.М.Дронов и Л.Ф.Литвинчук (56) 1. Завлин П.M. и Дьяконов А.Н, ОрганиЧеские соединения в производстве и обработке светочувствительных материалов.

Дубители. Учебное пособие, — Л„1984, 2. Lumblatt М.M. et aI„Ophtalmology, 1980, ч. 29, р. 498-506. (54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПОДЛОЖКИ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ЗАДНЕГО ЭПИТЕЛИЯ РОГОВИЦЫ ГЛАЗА

Изобретение относится к медицине и преимущественно может быть использовано в офтальмологии, в частности для получения сплошного монослоя клеток заднего эпителия in vitro на подложке для его последней трансплантации ln vlvo при различной патологии роговой оболочки глаза.

Целью изобретения является упрощение и ускорение процесса приготовления подложки путем замены используемого в прототипе глутарового альдегида соединением N,N,N,N -тетраизопропоксиметилдиа1 мида малоновой кислоты.

Для достижения поставленной цели в

37ь-ный водный раствор желатины рО

"Свема". Шостка) вводится 0,5-0,9 х 16 М

ЙМЙ,N -тетраизопропоксиметилдиамида

„„59„„1822876 А1 (57) Использование: биотехнология, медицина. В 3$-ный водный раствор желатины вводят N,N,N,N -тетраиэопропоксиметилдиамид малоновой кислоты (в виде 1 (,-ного водного раствора) до конечной концентрации 0,9 х 10 M. Приготовление пленок-под-4 ложек в отверстии миллипорового фильтра осуществляют путем погружения его в3 7ьный водный раствор желатины, затем сушат при температуре 20 С и относительной влажности 65ф в течение 30 мин, Способ позволяет упростить и ускорить процесс приготовления желатиновых подложек для культивирования клеток заднего эпителия роговицы глаза и их последующей трансплантации. 1 табл, малоновой кислоты (в виде 1ф,-ного водного раствора) на 1 г воздушно-сухого жела1ина.

Пример 1, Готовится 3 -ный водный раствор желатины. в который вводится 0,5 х

-4 1

10 M N,N,N,N --тетраизопропоксиметилдиамида малоновой кислоты. Иэ этого раствора, поддерживаемого при 30 С пленки-подложки готовятся так же, как и в прототипе, т.е. в отверстии миллипорового фильтра. Желатиновые подложки сушатся при температуре 20 С и относительной влажности 65 в течение 35 — 40 мин, После промывания в 2 сменах физиологического раствора и в растворе питательной среды по

15 мин пленки укладываются на дно лунок пластикового планшета, куда вводится суспензия клеток заднего эпителия роговицы

1822876 глаза кролика плотностью 500 кл/мл. Инхубация в термостате при температуре 37ОС в атмосфере увлажненного воздуха в 5% СО2, Используемая среда: ДМЕМ (Dulbecco s

modialed Eagle medium) с 15% фетальной сыворотки крупного рогатого скота и смесью антибиотиков. Через 48 ч культивирования 1/3 площади подложки была заполнена активно растущими клетками, форма и размер которых характеризовались выраженным полиморфизмом. Однако было отмечено, что вся поверхность подложки пронизана множеством складок,что по нашему мнению, является результатом недостаточной концентрации структурирующего агента (дубителя), На 5 — 6 сутки культивирования клетками было покрыто 2/3 площади подложки, а на 10-11 сутки культура достигла конфлюентного состояния. Клетки приобрели форму неправильных шестиугольников, но плотного прилегания клеток друг к другу не наблюдалось из-за складчатости подложки.

Таким образом, общее время приготовления подложки составляет 80-85 мин.

Пример 2. Готовится 3%-ный водный раствор желатины, в который вводится 0,7 х

10 M N,N,N,N --тетраиэопропоксиметилдилмида малоновой кислоты. Пленки готовятгя аналогично примеру 1, но в оТличие от него высыхают на 5-10 мин скорее, т.е. в течение 30 — 35 мин, После промывания в 2 сменах физиологического раствора и в растворе питательной среды по 15 мин пленки использовались в качестве подложки для культивирования клеток заднего эпителия роговицы глаза кролика, Через 48 ч культивирования 1/3 площади подложки была заполнена распластанными и активно растущими клетками, форма и размер которых также характеризовались выраженным полиморфизмом; подложка выглядела гладкой и равномерно растянутой на всем протяжении. На 5 — 6 сутки культивирования клетками было покрыто 2/3 площади подложки. Большинство клеток сохраняло отросчатую форму, но их полиморфизм был менее выражен. На 7 — 8 сутки культивирования культура достигла конфлюентного состояния: клетки приобретали шестигранную форму и плотно прилегали друг к другу.

Общее время приготовления подложки составляет 75-80 мин.

Пример 3. Готовится 3%-ный водный раствор желатины, в который вводится 0.9

-4 1 х10 M N,N,N,N-тетраизопропоксиметилдиамида малоновой кислоты. Пленки готовятся аналогично примеру 2, но высыхают они на 5 -10 мин скорее т.е. в течение 25 30 мин. После промывания в 2 сменах физиологического раствора и в растворе питательной среды по 15 мин пленки использовались в качестве подложки для культизирования клеток заднего эпителия роговицы глаза

5 кролика. Состояние подложки, а также динамика роста клеток и скорость образования монослоя аналогичны примеру 2, однако морфология клеток резко отличалась, Культура характеризовалась резко выраженным полиморфизмом и по достижению конфлюентного состояния. а в некоторых клетках выявлялись цитоплазматические вакуоли, что свидетельствовало о некоторой токсичности под"5. ложки.

Общее время приготовления подложки составляет 70-75 мин.

Таким образом, существенным отличием предлагаемого изобретения является замена используемого в прототипе глутарового альдегида на формальдегидный дубитель N,N,N,N -тетраизопропоксиметилдиамид малоновой кислоты, обладающий меньшей восстановительной активностью, чем глутаральдегид, Подобное решение задачи является оригинальным и не вытекает иэ известного уровня знаний, поскольку N,N.N,N --тетраизопропоксиметиламид малоновой кислоты использован в

30 совершенно отличной от медицины сфере, а именно в качестве дубителя в производстве фотопленок в концентрации 1 х 1О М на 1г воздушно-сухого желатина, Использование заявляемого способа позволяет упростить и ускорить процесс приготовления желатиновой подложки для культивирования клеток заднего эпителия роговицы для их последующей трансплантации In vlvo более чем в 10 раз (см,таблицу).

40 Выбранная концентрация дубителя от 0,5 до

0,9 х 10 M является оптимальной, что под-4 тверждается результатами экспериментов, представленных в таблице.

Формула изобретения

45 Способ приготовления подложки для культивирования клеток заднего эпителия роговицы глаза, включающий погружение имеющего отверстие миллипорового фильтра в 3%-ныл водный раствор желатины при

50 температуре 30 С, введение сшивающего агента с последующим высушиванием при

20 С и относительной влажности 65, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения и ускорения приготовления подложки, в качестве сшивающего агента используют

0,5--0,9 х 10 М N,N,N,N тетраизопропок симетилдиамида малоновой кислогы, хоторыи вводят в виде 1 ного водного раствора.

1822876

Хврвкгериотмкэ предлагаемпгО и поотогиплагО С оСпбое.

Параметры

П згвеыые способ

Прототип

Желвгммв +

0.9 10 М дуб»тела

Желкэтнна +

1.0 10- M Луб»талл бл

Желатине T

0.7 10 М дубе»еле

Желатина + Жвлатина +

0,1 10 М дуб»та- 0,5 10 М дуб лл лв

665 ымм

65-70 мггк

75-60 ммн

70-75 егин

Нар»эльм»я ыггно слое образуегсг на 5 сутки

Нормальные ион слоЯ образуетсе на 7.6 сутки

Составитель К. Каранов

Техред M,Mîðãåíòàë Корректор U.Þðêîâåöêãÿ

Редактор

Заказ 2173 Тираж Подписное и тк ытиям и и ГКНТ СССР

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при Г

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4(5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина 101

Общее време пр»готовленил подлоакм

Морфологии клеTOII клетки осодвгот.

peo llIIeC TIJ ee OTC1, но ыонослоя ме

Форьгмрувтсл из-за лркблости подлоОтсутствует плот»ое прмлегание клеток друг R дру гу. »омослое образуетсл не 10-11 сутки

Резко выразкатгмыв полиморфизм

°леток. наличие цитоплэзматмче скмк ввкуолед, MoIIooIIoÀ форккиру. ктсв ма 7-6 сутки

Збф клеток oT оосевмое ко»центра. цгчг ocotte»I.. расо лес ты вэ кгтсе. но на 54 сутки дегемермрукгтсв, °

íв 5 пгкреплккттсв ог по оикм