Штамм перевиваемых клеток эмбрионов озимой совки аgrотis sеgетuм sснiff для культивирования энтомопатогенных вирусов

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (1 I) (5()5 С 12 N 5/00, А 01 N 63/00

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТТВО СССР (Г()СПАТЕНТ СССР) ОПИСАН ИЕ И ЗОБ РЕТЕ Н ИЯ

36Б . .13Д.Д 1

К ПАТЕНТУ (2Ф) 5007579/13 (2 ) 03.09.91 (4В) 67.04,93. Бюл. % 13 (7Ф) Веесоюзный научно-исследовательский и (статут молекулярной биологии научно.пф@изввдственйого объединения "Вектор"

Р2) Т.Д.Колокольцева, Н.Г.Герасимова и

А)Щарева

P: ) Научно-производственное объединение

"I(Ie iop" (56} Проблемы и перспективы, M., ВНИИСфНТИ Миймедпром СССР, 1989 . вып, 91ф, "8Iotechriol. Lett." 1988, 10, М 12, 849-854. (54) ШТАММ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОК

Э „бРИОНОВ ОЗИМОЙ СОВКИ AGR0TIS

S GETUM fSCHlFF) ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАЯ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ ВИРУСОВ (57) Использование: яирусология, получение энтомопатогенных вирусов и касается нового штамма перевиааемых клеток эмбрионоа озимой совки. Сущность йзобретения, штамм перевиваемых клеток эмбрионоа оэимой совки Agrotls segetum МБ — ОЗС4 — 781 получен иэ 20 — 50 эмбрионов озимой совк

Изобретение относится к вирусологии, в частности к культивированию клеток и тканей с целью наработки и изучения энтомопзтогенных вирусов, и может быть использовано а сельском хозяйстве для получения энтомопатогенных препаратов.

Для наработки и изучения вирусных агентов обычно используют гусениц, соответствующих штамму вируса вида насекомых. Для этого гусениц ll)-IV возраста т пассиаироаанием на среде Грейса, содержащей 10ф; эмбриональной сыворотки Коров, Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции переаиваемцх культур клеток насекомь)х Института общей генетики им, Н.И, Вавилова АН СССР (г. Москва) под номером

ВСКК(Б)А-28. Культура клеток МБ-03С4788 прошла 60 пассажей и представлена преимущественно длинными фибробластоподобными клетками средних размеров, Встречаются крупные круглые клетки. Ядро округлой или овальной формы с 1 — 2 лдрышками. Клетки формируют сет,атый мойослой на 5 — 7 сутки с островками многослойного роста, Клетки штамма Mb-ОЗС4-788 хранятся в замороженном состоянии при температуре минус 196 С на 5, 10, 20 и последующ11х десятых пассажах. Клетки штамма МБ-.

ОЗС4-788 продуцируют вирус ядерного и цитоплазматического полиэдро зов озимой совки и вирус ядерного полиэдроза капустной совки (Mamestra brasslcae 1.), которые могут быть использованы для получения энтомопатогенных препаратов. 1 табл„3 ил, заражают вирусом через корм, Инфицированных насекомых содержат в лабораторных условиях в течение 5-10 сут до их гибели. Погибших гусениц собирают, гомогенизируют. получают вируссодержащий материал с остатками кутикулы и тканей насекомых, с гемолимфой, с ворсинками и, как правило, эндогенными микроорганизмами, Такал наработка вируса обладает рлдом недостатков, связанных с нетехнологично1808009 стью процесса и его трудоемкостью. Получаемый вирусный материал неоднороден, содержит большое количество посторонних примесей, в том числе и микроорганизмов.

Микроворсинки и остатки кутикулы являются аллергенами, что ограничивает использование полученной вирусной биомассы.

Любые биохимические, генетические и молекулярно-биологические исследования энтомовирусов в насекомых затруднены изза неоднородности получаемого вирусного материала, Альтернативным способом является технология наработки вирусной биомассы с использованием культур клеток насекомых.

Известны системы получения вирусов ядерного полиэдрона (ВЯП) на определенных линиях клеток. 3то, нзпрймер, использование культур клеток совки Spodoptere

1гц01регдз . для выращивания ВЯП

Autographa californica; или применение линии клеток капустной совки Mamestra

ЬгззМсае для получения биомассы ВЯП А. сз10огп!сз. При этом урожай вирусов может достигать 2 .10 полиэдров на мл в монослое и (2-3) 10 пол/мл в суспензии, Преимущества этого способа в том, что вирусный материал свободен от остатков тканей, ворсинок, кутикулы насекомйх; однороден и свободен от посторонних микроорганизмов-контаминантов.

Озимая совка - значимый вредитель зерновых культур в СССР, однако в настоящее время не существует клеточных технологий наработки специфически действующего на этого вредителя вирусного препарата. Необходима разработка или получение новых высокоэффективных вирусных агентов.

Получение или выбор вирусного агента для озимой совки затруднено беэ системы тщательного анализа вирусного материала и клонирования, поскольку в насекомых продуцируется комплекс вирусов — вирус ядерного полиэдроза, вирус гранулеза и чаcto присоединяется вирус цитоплззматического полиэдроза. Подобные работы возможны только при работе in vitro. Однако в настоящее время в литературе не описаны длительно культивируемые линии клеток озимой совки. Неизвестны также дзнные репродукции вирусов ядерного (ВЯП) и цитоплазматического(ВЦП) полиэдрозов озимой совки s других линиях клеток.

Целью изобретения является получение стабильного штамма перевиваемых клеток озимой совки Agrotis segetum, свободного от контаминантов, культирируемого на доступных средах, обеспечивающего репродукцию вирусов, поражающих гусениц озимой совки.

Поставленная цель достигается тем, что получен новый штамм перевиваемых клеток из тканей эмбрионов озимой соки Agrot

segetum МБ-ОзС4-788, Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции перевиваемых культур клеток насекомых Института

10 общей генетики им, Н.И,Вавилова АН СССР (r. Москва) под номером ВСКК (Б) А-28.

Штамм перевиваемых клеток озимой соки МБ-ОэС4-788 получают трипсинизацией и механическим дроблением 20-50 215 3-дневных эмбрионов озимой совки с соблюдением правил асептики. Отмывают клетки и кусочки тканей эмбрионов от оболочек яиц и трийсина в солевом растворе

Грейса, содержащем пенициллин и стрепто20 мицин в десятикратной концентрации(1®0 ед./мл); Пойле отмыва и центрифугирования осадок клеток i4 кусочков тканей ресуспендируют в свежей порции пи гэтельной среды

Грейса с добавлением 100 ед./мл канзмици25 на и 10 по обьему сыворотки эмбрионов коров энергично пипетируют. Подсчитывают количество жизнеспособйых клеенок, доводят их концентрацию до (4 — 5) 10 клеток в 1 мл средой Грейса. содержащей 10 эм-.

30 бриональной сыворотки коров и 100 ед./мл

«энамицина; Суспенэию «леток переносят в сосуд для культивирования. Миграцию и деление клетрк наблюдают через. 1-1.5 мес после посева клеток. Смену среды осуществляютт 1-2 раза s месяц не болев чем на 30 от объема. После формироаания50-ббпр мо.нослоя клетки ебивают механическим способом в свежей порции среды и переносят на новый культуральный сосуд. Первье5-10

40 пассажей пересевы осуществляют не чаще, чем 1 раэ е 2-3 недели. Начиная с 10-15 пассажа пересев проводят 1 раз в неделю, Кратность paccesa 1:3-1:5. посевная «онцентрация составляет (2-3) 105 кл/мл.

Через 10-15 пассажей клетки подвергают обследованию. Проводят контроль контаминации клеток с помощью методов— окраски флюорохромами и высевом нз селективные среды, морфологический в кари- 0 ологический анализ. электронно-мИкросконическое исследование.

Морфологические свойства. 8 культура клеток М Б-ОзС4-788 преобладают фиброб55 ластоподобные клетки средних размеров. встречаются круглые, гемоцитоподобные клетки. Ядро округлой формы. Ядрышки различной величины и формы 1-2 в ядре (фиг.

1).

1808009

Контроль контаминации. flo данным зиюцентрифугируют,осадокресуспендируЗлектронно-микроскопического айалиэа, ют в свежей ростовой среде, подсчитывают изучения под люминесцентным микроско- . общее количество клеток, долю жизнеспо. пом препаратов, окрашенных ДНК-флюо- собных клеток, и разводят ростовой средой рохромами; выделения на селективных 5 до концентрации жизнеспособных клеток средах — клетки свободны От вирусной, ми- (2,5-3) ° 10 кл,/мл и помещают в культукоплазмекной, грибковой и бактериальной ральный сосуд, контаминацйи..: Вирусологические свойства, ПолученКариологические свойства. Распреде- ный штамм пере виваемых клеток озимой соление Числа хромосом определяют йодсче- 10 ки .продуцирует вирус ядерного и том хромосом в 1ОО метафазных цитоплазматического полиэдрозов озимой пластинках. На фиг. 2, 3 представлены мик- .. сйки (ВЯПОэС4 и ВЦПОзС). Он продуцируфофотографии метафазной пластинки и по- ет также и другиЕ вирусы, например вирус кэзано- распределение числа хрбмосом в . ядерного полиздроза капустной совки клетках штамма Мб-ОэС4-788 на 60 пасса-. 15 штаммов ВЯПКС-3 и ВЯПКС вЂ” 10, ПродуциЖе, Кариологический анализ показал, что руемые клетками вирусы по морфологичеклетки штамма МБ-ÎýÑ4-788 имеют набор ским признакам идентичным исходным иэ Е0-220 мелких голоцемтрических хромо- .. вирусам; наработанным в гусеницах соотфом, характерных для клеток чешуекрылых ветствующего вида насекомых. насекомых. — : - . 20 1 ак как в литературе нет сведений о

Культуральные свойства, Клетки штам- продукции зйтомопатогенных вирусов, по.... ма выращивавт в мойослое при 28 С в сре- ражающих совку Ацгобз зеце1шт, в переви::::дФ Грейса с. добавлением 10 сйворотки ваеМых линиях клеток, то полученный эмбрионов коров. Тип роста — смешанный, штамм перевиваемых клеток озимой совки

11осевная:концентрации - (3-5) 10 кл/мл; -25 Мб-СзС4-788 является единственным, просиимают механическим встряхиванием ли- дуцирующим ВЯПОзС и ВЦПОзС и, следо бо М®Фированием, пересевают через 5-7 вательно, обладает существенными

Ц(Т культИВИрОВйния. :: . Отличиями.

Криоконсервация и хранение. Клетей Йа фиг. 1 изображена и представлена

Штамма Мб-ОзС4-788 хранятся в заморо- 30 фотография клеток культуры озимой совки женном состоянии в жидком аздте при ми- МБ-ОзСд — 788(нефиксированные и неокра йус 1960С, Режим замораживания: снятые шенные клетки при увеличении х 400); на состекла.всвежей среде Грейса клетки цен- фиг, 2 изображена микрофотография мета -tpM$yitipyI0t и ресуспендйруют s новой фазнай пластинки клеток штамма МБпорции растовбй среды, содержащей 1О 35 ОзС4- 788, окраска азур-зозином; на фиг. 3 эмбриональной сыворотки коров, доводя изображенадиаграммараспределениячискОйцейчфацию клеток до (8-10) 10 клеток лз хромОсОм в клетках штамма МБ-ОзС .. н t мл, Затем медлеййо, при постоянндм 788 на 60 пассаже, йерЖгейивании, добавляют. равный обьем . Пример 1; Получение первичной свежей ростбеой среды. содержащей 10ф 40 культуры клеток из эмбрионов озимой совки .. фъйн>ритки и 26g, глицерина. Суспензию - Agrotls segetum и поддержание полученно- . разливэют по ампулам и:замораживаат s. го штамма. сйебйспир аижидко оазоы,йонйжаятем-: - Яйца озимой совки аккуратно снимают йературу со скоростью 1 в минуту до тем- с подложки, ОтмываЮт СтЕрильной дистилйературы минус 40 С с последующим 45 лированнойвддОй, памещаютВ Стерильный погружением в хранилище биопродуктов с флакон из дратв. Стерилизуют s течение жидким Ьэотом....: . 7-10 мин 0.5 -ным раствором йода в 70

Восстановление культурй клеток осу- этиловом спирте. Отмывают От стерилизую: Ществляют следующим образом . ампулу с щего раствора пятикратным обьемом соле Клетками извлекают из жидкого аэота-и по- 50 вого раствора Грейса, Стерильные яйца

Мещан В водяную баню с температурой помещаютвтермостатпри24-25 Сдля раэплюс (30-35) С, постоянно меняя положе-- вития до начала выхода гусениц. Контаминие ампулы, оттаивают, Ампулу с клетками нированный материал выбраковывают.

Вскрывают, соблюдая правила асептики, Эмбрионы гусениц, т.е. яйца на стадии насуспенэйю размороженйых клеток перено- 55 чала выхода гусениц, измельчаютмеханиче . сят в центрифужную пробирку. Порциями, ски в гомогенизаторе в волевом растворе йостоянно перемешивая с интервалом в 1-2 Грейса с добавлением 100 ед,/мл канамицимин, добавляют ростовую среду в колйчест- на. Отцентрифугированные клетки и кусочве,составляющем 05; 05; 1: 2: Змл. Суспен- ки тканей ресуспендируют в ростовой питательной среде, содержащей 90;ь среды

1808009

7 8

Грейса, 10 сыворотки эмбрионов с добав- ским полиэдрозом гусениц озимой совки на лением 100 ед./мл канамицина и энергично 3-5 сутки после заражения, Для этого гусепипетируют. Подсчитывают количество ниц механически гомогенизируютв солеаом жизнеспособных клеток, доводят их кон- растворе Грейса, насыщенном фенилтиомоцентрацию до (4-5) 10 клеток на 1 мл 5 чевиной, s соотношении 200 мг гусениц на 1

5 ростовой средой и переносят в сосуд для мл раствора. Титр вирионов определяют на культивирования. Миграцию и деление кле- ТООщ, используя метод обработки результок наблюдают через 2,0-2,5 мес. Смену татов Рида-Менче. в 96-ячеистых пластикосреды осуществляют через 10-15 сут не бо- . вых плашках фирмы "Flow Laboratories" лее чем на 30 . После формирования 50- 10 (Англия).

60, монослая клетки снимают со стекла в Через 60мин послезаражения культуры свежей порции ростовой среды и переносят клеток вирусную суспензию сливают, внов новый культуральный сосуд. Начйная с сят свежую питательную среду и культиви10-15 пассажей пересевы проводят2 раза руют при 28 .С: s термостате. Анализ неделю, Кратность рассева 1:3-1:5, посев- 15 продукции ВЦП проводят через 7 от под ная концентрация (2 — 3) 10 кл/мл. световым микроскопом а фазовом контр5

Полученный штамм клеток культивиру- асте или с помощью окраски пикриновой .. ют при 28 С в питательной среде, состоя- кислоты фиксированных мазков по наличию щей из 90 среды Грейса и 10ф, сыаоротки - телец включений в цитоплазме инфицироэмбрионов коров с добавлениеМ 100 ед./мл 20 ванных клеток, канамицина. При посевной концентрации ПродуктйвноСть клеток определяют в (3-4) 10 кл./мл:клетки формируют сетча- подсчетом среднего количества полиэдроа

5 тый монослой с островками многослойного а цитоплазме 100 инфицированных клеток. роста к концу 5-7 суток (фиг. 1). После сня.- Долю заряженных клеток определяют по сотия клеток мягкйм пипетированием в сае- 25 отношению кОличества зараженных клеток жей питательной среДе рассеаают а сполиэдрамикобщемучислуклеток.Выход. пропорции 1:3-1:4, Видбвое соотаетствйе вируса. определяют подсчетом количестве штамма клеток подтверждают сраанитель- полйэдроа а культуральной жидкости. Для ными анализами кариотйпрв клеток гусениц: этого инфицированную клеточную культуру::, исходного вида насекомых и клеток пол- 30 дважды эамораживают и оттайаают для осученного штамма (фиг, 2 и 3);:-: .. вобождения анутриклеточного вируса в подПример 2. Продукцйя вируса циклоп-: держиаающую среду и определяют титр лазматического полиэдроза озимой совки .: .вируса в к мерв Горяева. Титр равен 13,6 клетками озимой совки штамма МБ-ОзСд-: (10.61; 16,67) 10 пол/мл. . 6

788. — : .. -..: .::,: .: - 35 Для определения инфекционности пол-"

Для тестирования использовали ВЦП ученного вируса суспензию клеток; содерозимой совки иламма ВЦПОзС йз коллек- жащую полиэдры, наносят на корм. Каждой ции ВНИИ молекулярной биологии;НПО из100гусеницйеозрастаскармливают10

"Вектор", пос. Кольцово, Новосибирской . зараженных клеток, взятых через 7 сут пообласти; - -:: ". - -::: 40 сле их инфицирования. Причину гибели опКлетки озимой совки культивируют, до разделяют, делая мазки- отпечатки погибших

30 пассажа, как описано а примере 1. Пере-. насекомых, под световым микроскопом. севаютi концентрации 5 10 кл./мл в 7 мл Пример 3. Продукция вируса ядарнопитательной среды в культуральные сосуды .: го полиэдроза озимой совки клетками озиобъемом 50 мл и помещают в термостат при 45 мой совки штамма МБ-ОзС4-788.

28 С. Через 2сутроста питательную среду Для тестирования использовали ВЯП сливают, клетки снимают со стекла в свежей озимой совки штамма ВЯПОзС иэ коллекпорции питательной среды и пересевают в ции ВНИЙ молекулярной биологии Hf10 новые культуральные сосуды в концентра- "Вектор", Новосибирской области, ции (3-4) 10 кл/мл. Через сутки роста 50- Клеткйштамма МБ-ОзС4-788 культивисреду сливают, на образовавшийся моно- рот,какописаноапримере1,пересевают,, слойнаносятвируснуюсуспензию ВЦПОзС -готбвят к заражению и инфицируют, как из расчета 0,1 мл суспензии, содержащей описано в примере 2. используютдля зара(1 — 2) - 10 ТС10цо инфекционных вирионов . жейия суспензию, содержащую (1-5) ° 10 в l мл, на 3 см рабочей поверхности куль- 55 ТС106оlмл вирионоа ВЯП озимой совки.турааьного сосуда, покрытого монослоем: Анализ продукции ВЯП проводят через клеток. 7-8 сут под световым микроскопом в фазо8 качестве вирусной суспензии исполь- вом контфбсте пб наличию телец включений зуют гомогенат больных -цитоплазматиче- в ядрах f00 инфицированных клеток, Ана1808009

10 лиз инфекционности проводят, как описано в примере 2.

Анализ результатов репродукции виру. сов ядерного и цитоплазматического полиэдрозов озимой совки в культуре клеток озимой совки МБ-ОзС4-788, представленных в таблице, показал, что полученный штамм клеток можно испольэовать для наработки биомассы бакуловирусов, поража-. ющих опасного вредителя полей — озимой совки. Полученная вирусная биомасса однородна, без примесей чужеродного..вируса, что позволяет проводить биохимические, генетические и молекулярно-биологические исследования ВЯПОзС и ВЦПОзС, П р и и е р 4. Продукция вирусов ядерного пблиэдрона капустной совки клетками .озимой совкй штамма ME-ОэС4-788.

Для тестирования испольэовали ВЯП капустной совки штаммов ВЯП КС-3-86 и

ВЯП Ке-10 из коллекции ВНИИ молекулярной биологии, НПО "Вектор", Новосибирской области.

Клетки штамма IVlE-ОзС4-788 культивируют, как описано в примере 1, пересевают. готовят к заражению и инфицируют, как описано в примерах 2 и 3. Анализ продукции

ВЯП проводят, как описано в примерах 2 и

Результаты репродукции ВЯП КС-3 и

КС-10 в культуре клеток МБ — ОзС4-788 представлены в таблице.

- . Таким образом показано, что полученный штамм клеток М6-ОэС4-788 способен прОдуцировать различные бакуловирусй (ВЯПОзС, ВЯПКС вЂ” 3 — 86. ВЯПКС-10 и

ВЦПОэС) в количестве, достаточном для на.. работки вирусной биомассы для исследования в научных .исследованиях биохимического, генетического,молекуляр но-биологического и вирусологического направлений. Преимуществом полученного штамма перевиваемых клеток озимой совки А. . segeturn является то, что он способен продуцировать вирусы (ВЯП и ВЦП), поражаю-. щие гусениц озимой совки — опасного вредителя сельского хозяйства. Данные вирусы не продуцируются ни одной иэ имеющихся линий клеток насекомых ни в СССР, ни за рубежом.

Штамм может служить системой в экс5 периментальных исследованиях при получении, клонировании и отборе наиболее патогенных или вирулентных штаммов вирусов, а также для молекулярно-биологических и генноинженерных исследований и

10 для наработки рекомбинантных ВЯП и ВЦП.

Исследование охарактеризованных, . проверенйых на наличие контаминантов пе. ревиваемых культур клеток-продуцентов данной. группы вирусов, позволяет контро15 лировать процесс наработки вирусной биомассы, облучать ее с однородными свойствами, без посторонних микроорганизмов, Отсутствие остатков кутикулы и, уменьшение количества балластных белков

20 уменьшает аллергенность, а значит, увеличивает зкблогическую чистоту получаемого .препарата как при его производстве, так и при его применении, Технологичность. а, главное, мобильность производства обеспе25 чивается возможностью сохранять клетки при температуре жидкого азота длительное время, что позволяет начинать процесс наработки вирусной биомассы в любое время.

Полученный штамм перевиваемык кле30 ток озимой совки А, segetum может также использоваться для наработки биомассы промышленного штамма энтомопатогенно: го вируса ядерного полиэдроза капустной совки ВЯПКС-3-.86, Вирус эадепонирован

35 во всесоюзной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д,И. Ивановского под номером ГКБ 2155 от 12,09.88 г. и применяется для получения энтамопатогенного пре. парата Вирин-КС (регламент ОПР

40 123.017-90 на производство препарата разработан во ВНИИ молекулярной биологии

НПО "Вектор" ).

Формула изобретения

45 Штамм перевиваемых клеток эмбрионов озимой совки Agrotls segetum (Schlff) М BCKK А-28 для культивирования знтомопатогенных вирусов.

3808009

Продолжение таблицы

1808009

Ed 100 !00 МУ0 220 260

480-630 л)3 ОМОсОи

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Редактор

Заказ3344

Составитель Т. Колокольцова

Техред ММоргентал Корректор С.Юско

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-36, Раушская наб., 4/5