Штамм перевиваемых клеток яичников куколок хлопковой совки неliотнis аrмigеrа (нuвn.) для культивирования вирусов ядерного полиэдроза
Использование: вирусология, получение средств защиты растений от вредных насекомых , в частности вирусных энтомопатогенных препаратов. Сущность изобретения: штамм перевиваемых клеток яичников куколок хлопковой совки Hellothis armlgera (Hubn.) получен трипсинизацией и дроблением яичников куколок с последующим выделением жизнеспособных клеток яичников. Штамм депонирован в коллекции пересеваемых соматических клеток беспозвоночных животных Института общей генетики им. Вавилова АН СССР под номером А-26. Использование вышеуказанного штамма клеток для культивирования вируса ядерного полиэдроза позволяет получить суспензию с титром (4,9-9,0)хЮ6 пол/мл. 1 табл., 6 ил. у Ё
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (191 (! I) ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
1 (21) 5007580/13 (22) 03.09.91 (46) 07.04.93. Бюл. hb 13 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии НаучнопрОизводственного обьединения "Вектор." (72) T.Ä.Колокольцова, Н,Г.Герасимова и А.А.Царева (73) Научно-производственное объединение
"Вектор" (56) Герасимова Н.Г., Окишева К.3, Получение вирусных энтомопатогенных препара. тов в культурах клеток насекомых. Проблемы и перспективы. M., ВНИИ СЭНТИ Минмедбиопрома СССР, 1989, вып. 9-10, Kompier R., Tramper J., Vlak J.Ì. А
continuous process for the production of
Baculovirus using insect-cell cultures, Biothechnol. Lett., 1988, 10, 12; р. 849-854. (54) ШТАММ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОК
ЯИЧНИКОВ КУКОЛОК ХЛОПКОВОЙ СОВИзобретение относится к вирусологии, в частности к культивированию клеток и тканей с целью наработки и изучения энтомопатогенных вирусов, и может быть использовано в сельском хозяйстве для получения энтомопатогенных препаратов.
Целью изобретения является получение стабильного штамма перевиваемых клеток хлопковой совки НеИопЫз armigera (НцЬп,), свободного OT контаминантов культивируемого на доступных питательных средах, продуцирующего ВЯП хлопковой совки и других насекомых, значимых вредителей сельского хозяйства, который может быть
КИ HELlOTHIS ARMIGERA (HUBN.) ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА (57) Использование: вирусология, получение средств защиты растений от вредных насекомых, в частности вирусных энтомопатогенных препаратов. Сущность изобретения; штамм перевиваемых клеток яичников куколок хлопковой совки Hellothis armigera (Hubn,) получен трипсинизацией и дроблением яичников куколок с последующим выделением жизнеспособных клеток яичников. Штамм депонирован в коллекции пересеваемых соматических клеток беспозвоночных животных Института общей генетики им. Вавилова АН СССР под номером А-26. Использование вышеуказанного штамма клеток для культивирования вируса ядерного полиэдроза позволяет получить суспензию с титром (4,9-9,0)х10 пол/мл. 1 табл., 6 ил. использован для наработки биомассы энтомопатогенных вирусов и их исследования. Поставленная цель достигается тем, что получен новый штамм перевиваемых клеток яичников куколок хлопковой совки Heliothis armigera (Hubn.) МБ-ХС-685. Штамм депонирован в специализированной коллекции перевиваемых культур клеток насекомых Института общей генетики им. Н,И,Вавилова АН СССР (r. Москва) под номером В СКК(Б) А-26. -Штамм перевиваемых клеток яичников хлопковой совки МБ-ХС-685, ВСКК (Б) А-26, получают трипсинизацией и механическим дроблением яичников 10-15 куколок хлопко1808010 50 55 вой совки, г;редварительно стерилизованных в течение 10 15 мин в 96" этилоеом спирте, Выделение яичников и дальнейшие операции проводят в стерильном месте с соблюдением правил асептики. Клетки и мелкие кусочки тканей яичникав отмывают в солевом растворе Грейса, содержащем пенициллин и стрептомицин до 1000 ед./мл, После отмыва и центрифугирования осадок клеток и кусочков тканей ресуспендируют в свежей порции питательной среды Грейса с добавлением 10 по объему сыворотки эмбрионов коров и 100 ед./мл канамицина, Подсчитывают количество жизнеспособных клеток, доводят их концентрацию до (4-5) 10" клеток в 1 мл питательной средой. Суспензию клеток переносят в сосуд для культивирования. Миграцию и деление клеток наблюдают почти через б мес покоя клеток. Смену среды осуществ IHK) T 1-2 раза в месяц не более чем на 30О/ от объема, После формирования 5060,— нога монослоя через б мес после посадки клетки сбивают механическим способом в свежей порции среды и переносят на новый культуральный сосуд. Первые 5-10 пассажей пересевы осуществляют чаще. чем 1 раз в 2-3 недели. Начиная с 10 пассажа, пересев проводят.1 раз в неделю. Кратность рассева 1:3-1:б, Через 15-20 пассажей клетки подвергают обследованию. Проводят морфологический и кариологический анализы, контроль видовой идентичности с помощь1о сравнительного анализа изоферментов глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы (ГбФДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ), контроль контаминации проводят с помощью методов окраски ДНК флюорохромами и электронно-микроскопического анализа. Морфологические свойства. КульТура клеток МБ-XC-685, ВСКК(Б) А-26 полиморфна. Преобладают эпителиоподобные клетки средних размеров. Ядро округлой формы с 1-2 ядрышками. Клетки формируют монослой с островами многослойного роста (фиг.1). Контроль контаминации. Па данным электронно-микроскопического анализа, изучения культуры клеток под люминесцентным микроскопом после окрашивания ДНК.-флюпрохромами. микробиологического контроля путем высева на набор селективных сред было выяснено, что клетки штамм;э свободны QT вирусной. микоплазменной, грибковой и бактериальной контаминации. Кариологическая характеристика Рас пределениг чис I3 хромосом определяя 1 подсчетом хп1!<0 .с в 100 ме афазн, ол:. от инках, На фиг.2, 3 г)редставлены микрофоtoI рафия метафазной пластинки и показано распределение числа хромосом в клетках шгамма, Кариологический анализ показал, что клетки штамма МБ-XC-685 ВСКК(Б) А-26 имеют набор из 100-125 мелких голоцентрических хромосом. Идентификация штамма. На фиг. 4 представлены данные, характеризующие изоферментный состав глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в исследуемых клетках и исходных насекомых (гусеницы хлопковой совки V возраста). Показана идентичность изоферментного состава, что доказывает видовую специфичность и принадлежность к Hellothis armlgera, полученного штамма клеток — МБХС-685, ВСКК(Б) А-26. Культуральные свойства, Клетки штамма выращивают в монослое при 28 С в среде Грейса с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров. Тип роста — смешанный, посевная концентрация — (3-5) .10 кл/мл; 5 снимают механическим встряхиванием либо пипетированием, пересевают через 5-7 сут культивирования, Криоконсервация и хранение, Клетки штамма хранятся в ампулах в замороженном состоянии при температуре жидкого азота (при-196 С). Ампулы заложены на хранение в коллекции клеточных культур HflO "Вектор" (и. Кольцово, Новосибирской обл.) и во Всесоюзной коллекции культур клеток насекомых Института общей генетики АН СССР (r.Ìîñêâà). Режим замораживания. Снятые со стекла в свежей среде Грейса клетки центрифугируют и ресуспендируют в новой порции ростовой среды, содержащей 10 эмбоиоHBilbHOI>I сыворотки ПЛОДОВ KOpOBbl, ДОВОДЯ концентрацию клеток до 5-10 млн.кл. в 1 мл. Медленно, при постоянном перемешивании, добавляют равный объем свежей ростовой среды, содержащей 10 сыворотки и 20/ глицерина. Суспензию разливают в ампулы, замораживают в смеси спирта и жидкого азота, понижая температуру со скоростью 1% в минуту до минус 40 С с последующим погружением в хранилище биопродуктов с жидким азотом. Восстановление культуры клеток осуществляют следующим образом: ампулу с клетками извлекают из жидкого азота и помещают в водяную баню с температурой 30-35"С. постоянно переворачивая. ампулу оттаивают, Ампулу с клетками вскрывают, соблюдая правила асептики. суспензию размороженных клеток перенос г л центрифуж ую пробирку. Пог и ., 00ь10чнно (!Ррiч.1<,виьая с инт l!!I 1808010 ляют ростовую среду в количестве, составляющем 0 5; 0 5; 1; 2; 3 мл. Суспензию центрифугируют, осадок ресуспендируют в свежей ростовой среде, подсчитывают общее количество клеток, долю жизнеспособных, разводят ростовой средой до концентрации жизнеспособных клеток (2,5-3) .10 кл/мл и помещают в куль5 туральный сосуд. Полученный штамм перевиваемых клеток МБ-ХС-685 продуцирует вирусы ядерногО полиэдроза хлопковой и капустной совок (ВЯП ХС-1 и ВЯП КС-3). Продуцируемый клетками ВЯП идентичен исходному вирусу, полученному в гусеницах соответствующего вида насекомых, имеет типичную для ВЯП КС-3 и ВЯП ХС-1 морфологию, патогенен для гусениц соответствующего вида насекомых. Поскольку полученный штамм клеток хлопковой совки Heliothis armlgera является единственным продуцирующим ВЯП Н. эгт1цега с одиночным включением вирионов в пучки и в литературе нет сведений о других линиях клеток, продуцирующих данный вирус, то предложенное изобретение (предложенный штамм) обладает существенными отличиями. На фиг.1 приведена фотография клеток линии МБ-XC-685, В СКК(Б) А-26 (нефиксированные и неокрашенные клетки ув.х400); на фиг.2 представлена микрофотография метафазной пластинки клеток линии МБ-XC-685 (окраска азур-эоэином); на фиг.3 изображена диаграмма распределения числа хромосом в клетках культуры МБ-XC-685 на разных пассажах; на фиг.4 приведена диаграмма изоферментного анализа штамма перевиваемых клеток хлопковой совки линии МБ-ХС-685; 1 — контроль — гусеницы хлопковой совки; ll — клетки линии МБ-ХС-685; 1И— контроль — клетки Hela, а — Г6ФДГ; б — ЛДГ; на фиг.5 приведена фотография клеток хлопковой совки, инфицированных ВЯП хлопковой совки (ВЯП XC-1) (нефиксированные и неокрашенные клетки, ув х 400); на фиг.6 представлена фотография клеток хлопковой совки, инфицированных ВЯП ка. пустной совки (ВЯПКС-3) (нефиксированные и неокрашенные клетки, ув. х 400). Пример 1, Получение первичных культур клеток из яичников куколок хлопковой совки и поддержание их в культуре, Куколки хлопковой совки разделяют по половым признакам. 10-15 куколок-самок отмывают стерильной дистиллированной водой от остатков корма и экскрементов. Отмытые куколки помещают в сосуд с 96 этиловым спиртом на 10-15 мин, Из стерильных куколок, соблюдая правила асептики, выделяют яичники, отмывают их в солевом растворе Грейса с добавлением 300 ед./мл канамицина. Отмытые яичники механически измельчают и трипсинизируют в течение 10-15 мин, Отмывают клетки и кусочки тканей от детрита и трипсина в солевом растворе Грейса с кэнамицином, После отмыва и центрифугирования осадок клеток и кусочков ткани ресуспендируют в порции 10 50 во, Новосибирской области) штэммов ВЯП XC-1 и ВЯП KC-З. Для изучения вируспродукции берут культуру клеток, прошедшую не менее 40 пассажей с момента ее получения. Перед 55 инфицированием клетки культивируют, кэк в примере 1, пересевают с концентрацией 5 10 кл./мл в У мл питательной среды в культуральные сосуды объемом 50 мл ii noпитательной среды Грейса с добавлением 10 по объему сыворотки эмбрионов коров и энергично пипетируют. Подсчитывают количество жизнеспособных клеток, доводят 15 их концентрацию до(4-5) 10 клеток на1 мл средой Грейса, содержащей 10 сыворотки и 100 ед./мл канамицина. Суспензию клеток переносят в сосуд для культивирования, Смену среды осуществляют 1-2 раза в ме20 сяц не более чем íà 30, Миграцию и деление клеток наблюдают через 4-4,5 мес после посева клеток, После формирования 50-60 монослоя клетки сбивают механическим способом в свежей порции пита25 тельной среды и переносят на новый культуральный сосуд. Первые 5-10 пассажей пересевы осуществляют через 15-20 дней, Начиная с 10-15 пассажа, пересев проводят 1 раз в неделю, Кратность рассева клеток составляет 1:3-1:5, посевная концентрация 30 (2-3) 10 клеток в1 мл. ° Полученный штамм клеток культивируют при 28 С в питательной среде, состоящей из среды Грейса, 10 . сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота фирмы 35 "Flow" и 100 ед./мл канамицина. При посевной. концентрации (3-4) 10 кл,/мл клетки формируют плотный монослой с островками многослойного роста к концу 7 суток роста (фиг.1), После снятия клеток мягким пипети40 рованием в свежей питательной среде клетки пересевают. Клетки идентифицируют с помощью изоферментного (фиг.4) и кариологического анализа (фиг.2 и 3), 45 Пример 2, Продукция вирусов ядерного полиэдроза (ВЯП) клетками штамма М Б-ХС-685. Для анализа используют вирусы из коллекции ВНИИ МБ НПО "Вектор" (и. Кольцо1808010 20 50 мещают в термостат при 28 С. Через 2 сут питательную среду сливают, а клетки снимают со стекла в свежей порции питательной среды. Пересевают клетки в концентрации 3 10 кл,/мл в новые культуральные сосуды, Через сутки роста среду сливают, на образовавшийся монослой наносят вирусную суспензию в количестве 0,1 мл, содержащую 10 TClDgo/мл вируса, на 3 см рабочей поверхности культурального сосуда, покрытого монослоем клеток, В качестве вирусной суспензии используют гомогенат больных ядерным полиэдрозом гусениц хлопковой совки (для наработки ВЯП ХС-1) либо капустной совки (ВЯП КС-З), Гомогенат получают следующим образом, через 5 сут после заражения больных гусениц гомогенизируют в соле-, вом растворе Грейса, насыщенном фенилтиомочевиной, добавляя на 200 мг гусениц 1 мл раствора, Титр вирионов определяют по TCIDgp с использованием метода обработки результатов Рида-Менча в 96-ячеистых пластиковых плашках фирмы "Flow" (Англия). Через 60 мин после заражения клеток вирусную суспензию сливают, вносят свежую ростовую среду. Анализ продукции ВЯП проводят через 7 сут под световым микроскопом с помощью фазового контраста по наличию телец включений в ядрах инфицированных клеток, Для определения доли зараженных клеток подсчитывают среднее количество полиэдров в ядрах 100 зараженных клеток, Биоиспытания как вирионов, так и полиэдров проводят на гусеницах соответствующего вида насекомых. Для определения инфекционности вирионов 20 мкл культуральной жидкости, содержащей вирионы, вводят в гемоцель 100 гусениц 5 возраста через ложноножку. Для определения инфекционности полиэдров наносят суспензию клеток, содержащих полиэдры, на кусочки корма. Каждой из 100 гусениц скармливают 10 зараженных клеток на 7 сутки после заражения. Причину гибели определяют, делая мазки-отпечатки погибших насекомых, под световым микроскопом, Результаты репродукции ВЯП XC-1 и ВЯП КС-3 в клетках изучаемого штамма МБХС-685, ВСКК(Б) А-26, представлены в таблице и на фиг,5,6, Показано, что штамм клеток МБ-ХС-685 ВСКК(Б) А-26 способен продуцировать ВЯП ХС-1 и КС-3 с сохранением вирулентности для насекомых соответствующих видов в количестве, достаточном для наработки вирусной биомассы. Преимуществом полученного штамма перевиваемых клеток хлопковой совки НеПой!з armlgera линии МБ-XC-685 является то, что он способен продуцировать промышленные штаммы вирусов ядерного полиэдроза совки Н.armigera — наиболее опасного вредителя хлопчатника, Данный вирус не продуцируется ни в одной из линий клеток насекомых, имеющихся в СССР или за рубежом. Штамм может служить системой в экспериментальных исследованиях при получении, клонировании и отборе наиболее патогенных или вирулентных штаммов ВЯП, а также для генно-инженерных исследований и для наработки рекомбинантных ВЯП; Использование охарактеризованных, проверенных на наличие контаминантов перевиваемых культур клеток — продуцентов данной группы вирусов позволяет контролировать процесс наработки вирусного материала, получать его с однородными показателями, без посторонних микроорганизмов, а отсутствие остатков кутикулы и уменьшение количества балластных белков уменьшает аллергенность и, значит, увеличивает экологическую чистоту получаемого препарата как при его производстве, так и при его применении. Кроме того, возможность сохранять клетки насекомых при температуре жидкого азота длительное время позволяет начинать и прекращать производство препарата в любое удобное время года, что значительно увеличивает мобильность производства. Полученный штамм может использоваться для наработки биомассы энтомопатогенных вирусов промышленных штаммов ВЯП ХС-1 и ВЯП КС-3. В настоящее время подобную биомассу получают на соответствующих гусеницах согласно опытно-промышленным регламентам, разработанным во ВНИИ МБ НПО "Вектор" (ОПР 123.017-90 на производство Вирина-ХС, смачивающийся порошок и ОПР 123,016-90 на производство Вирина-КС, смачивающийся порошок) и используют в сельском хозяйстве. Формула изобретения Штамм перевиваемых клеток яичников куколок хлопковой совки Heliothis armlgera (Hiibn.) ВСКК(Б) М А-26 для культивирования вирусов ядерного полиэдроза, lH080l0 Штамм ВЯГ1 Доля зараженных клеток,, Продуктивность клеток, пол/кл* Выход вируса. пол/мл 10 14,4+ 1,4 24,5» 2,3. 5,4+0,5 8,5+.0,5 ХС-1 КС-3 92+3 65+6 * Среднестатистическое число полиэдров на 1 ядро зараженных клеток, определенное по 100 клеткам. ФиР. Ф ф е Ф Ф у Ф е ® е ®е р Е Ф Ф е ®® 4 Ф ®а р аер р„e Ф Ф ф аю уу ф6 Фар Ф ", (M7+ ipL, ®®У е е Э В ф е ф р в Ф ф е Ф Ф ° р Ф ФФ в ев Е ар ®а р Ф Ф Ф ® ФИГ. 2 М ! А 1808010 Составитель Т.Колокольцова Техред М.Моргентал Корректор П, I åðåøè Редактор Л.Волкова Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101 Заказ 1394 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС(:Р 113035. Москва, Ж-35., Раушская наб„4/5
