5'-пиридоксиловые эфиры n-формилпептидов, обладающие хемотаксическими свойствами

 

Назначение: в иммунологии как соединения, обладающие хемотаксическими свойствами. Сущность изобретения: 5'-пиридоксиловые эфиры n-формилпептидов общей формулы 1 Form-Met-Leu-Phe-A-OPyr, где Ia А связь, Pyr, 1б А Lys HBr, Pyr HBr. Реагент 1: 4ʹ-3-0- изопропилиденпиридоксин. Реагент 2а: Bos -Phe-OH или 2б: Bos-Lys- (Z) Он, а процесс ведут в хлороформе в присутствии пиридина, к полученному пиридоксиловому эфиру аминокислоты присоединяют с использованием методов пептидной химии аминокислоты в последовательности, соответствующей целевому n-формилпетиду (1),Ia: C₂₉N₄H₄₀O₇S, мол.м 588,7, т.пл. 163 165°С [α]²_D²-18,4; 16: C₃₈N₆H₅₅O₈S, м. мас. 917,75, т.пл. 171 173°С Пептиды формулы 1 хорошо растворимы в воде. 4 табл.

Предлагаются новые соединения, в частности 5'-пиридоксиловые эфиры N-формилпептидов, обладающие хемотаксическими свойствами, которые могут найти применение в иммунологии. Цель изобретения поиск в ряду пептидов новых производных, водорастворимых и обладающих хемотаксической активностью. Поставленная цель достигается описываемыми 5'-пиридоксиловыми эфирами формилпептидов общей формулы 1 Form-Met-Leu-Phe-A-O-Pyr где, если A связь, Рyr CH (Ia), если A Lys˙HBr, Pyr CH (Iб), обладающие хемотаксическими свойствами. Описываемые пептиды получают ступенчатым наращиванием пептидной цепи методом активированных эфиров. В работе использованы аминокислоты ряд производных аминокислот фирм "Serva" (ФРГ) и "Fluka" (Швейцария). Температуры плавления определяли на столике Кофлера. Углы удельного оптического вращения определяли на приборе: "Shimadzu" (Япония). УФ-спектры снимали на приборе "Ultraspes" (ЛКБ, Швеция). Индивидуальность полученных соединений подтверждали элементным анализом и ТСХ на пластинах "Kleselgel F 254" (Мерк, ФРГ) в системах растворителей: этилацетат (А); этилацетат гексан, 7:3 (Б); этилацетат метанол уксусная кислота 10:1:0,1 (В); н-бутанол уксусная кислота вода, 3:1:1 (Г); 1,4-диоксан ацетон 25%-ный раствор аммиака, 9:9:2 (Д). Пятна на пластинках детектировали в УФ-свете (254 и 366 нм), нингидрином, реактивом Гиббса и раствором хлорного железа. Гидролиз пептидов проводили в 6 н. НСl при 155^оС 50 мин и при 110^оС 2 ч или 48 ч. Используемые сокращения: Form формил, Вос трет-бутилоксикарбонил,
Z бензилоксикарбонил,
Рyr 5'-пиридоксил,
i-Pyr 5'-(4'-3-0-изопропилиден) пиридоксил,
Еt этил,
NSU N-гидроксисукцинимидный эфир,
ВOC₂O ди-трет-бутилдикарбонат,
Ас ацетил,
ДМФА N,N-диметилформамид,
ДМСО диметилсульфоксид,
ЭА этилацетат,
Меt метионил,
Leu лейцил,
Рhе фенилаланил,
Lys лизил,
ГК гексан. П р и м е р 1. Получения формилметиониллейцилфенилаланиллизина 5'-эфира пиридоксина (Iб) дибромгидрата. Получение N α-третбутилоксикарбонил Nε-карбобензоксилизина 5'-эфира-4'-3-0-изопропилиденпиридоксина Вос-Lys(Z) O-i-Pys (III)
К раствору 21,87 г (57,5 ммоль) Вос-Lys-(Z)OH и 10,46 г (50 ммоль) 4'-3-0-изопропилиденпиридоксина в смеси 0,5 мл пиридина и 25 мл СНСl₃ при комнатной температуре и постоянном перемешивании вносят равномерными порциями 16,4 г (75 ммоль) ВОС₂О в течение 1,5-2 ч, оставляют перемешиваться на 60 ч и распределяют между этилацетатом и насыщенным раствором бикарбоната натрия. Органический слой промывают 3%-ным раствором КНSO₄, насыщенным раствором NaHCO₃, водой, сушат с MgSO₄, растворитель удаляют, а остаток кристаллизуют из смеси ЭА-ГК. Получают 27,44 г вещества III. Получение трет-бутилоксикарбонилфенилаланил-Nε -карбобензоксилизина 5'-эфира 4'-3-0-изопропилиденпиридоксина (Вос-Рhe-Lys(Z)O-i-Pys) (IV)
К 27,0 г (47,23 ммоль) соединения III прибавляют 42 мл смеси 1:1:0,1 CF₃COOH-CH₂Cl₂ ацетон, охлажденной до 0^оС, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают в вакууме досуха, остаток промывают высушенным над NaOH эфиром и вносят в охлажденный до 0^оС раствор (17,42 г, 47,23 ммоль) Вос-Рhe-O-NSu в 20 мл СН₂Сl₂. К полученной смеси при 0^оC прибавляют в течение 30 мин 19,7 мл (141,7 ммоль) в 20 мл СН₂Сl₂ и оставляют перемешиваться 16 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривают в вакууме. Остаток растворяют в ЭА и промывают последовательно насыщенным 3%-ным раствором КНSO₄, насыщенным раствором NaHCO₃ и водой, после чего сушат с Na₂SO₄. ЭА отгоняют в вакууме. Полученный остаток перекристаллизовывают из смеси ЭА-ГК, получают 32,25 г соединения IV. Получение трет-бутилоксикарбониллейцилфенилаланил-Nε-карбобензоксилизина 5'-эфира 4'-3-0-изопропилиденпиридоксина (Вос-Leu-Phe-Lys(Z)O-i-Pyr) (V)
К 32 г (44,52 ммоль) соединения IV прибавляют 42 мл смеси 1:1:0,1 CF₃COOH-CH₂Cl₂ ацетон, охлажденной до 0^оС, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают в вакууме досуха, остаток промывают высушенным над NaOH эфиром, прибавляют к охлажденному до 0^оС раствору 14,6 г (44,52 ммоль) Вос-Leu-O-NSu в 20 мл СН₂Сl₂. К полученной смеси при 0^оС прибавляют в течение 30 мин 18,6 мл (133,6 ммоль) Еt₃N в 20 мл СН₂Сl₂ и составляют перемешиваться 16 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривают в вакууме. Остаток растворяют в ЭА, органический слой последовательно промывают насыщенным раствором NaHCO₃, 3% -ным раствором КНСО₃, насыщ. раствором NaHCO₃ и водой, после чего сушат с Na₂SO₄ с последующим удалением растворителя в вакууме. Полученный остаток перекристаллизовывают из смеси ЭА-1К, получают 34,4 г соединения V. Получение трет-бутилоксикарбонилметиониллейцилфенилаланил-Nε-карбобензокси- лизина 5'-эфира 4у'-3-0-изопропилиденпиридоксина
(Вос-Меt-Leu-Phe-Lys(Z)O-i-Pyr) (VI)
К 34 г (40, 9 ммоль) соединения V прибавляют 42 мл смеси 1:1:0,1 CF₃COOH-CH₂-Cl₂ ацетон, охлажденной до 0^оС, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают в вакууме досуха, остаток промывают высушенным над NaOH эфиром и вносят в охлажденный до 0^оС раствор 14,16 г (40,9 ммоль) Вос-Меt-O-NSu в 20 мл СН₂Сl₂. К полученной смеси при 0^оС прибавляют 17,1 мл (122,6 ммоль) Еt₃N в 20 мл СН₂Сl₂ и оставляют перемешиваться 16 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривают от растворителя в вакууме и растворяют в ЭА, затем органический слой последовательно промывают насыщенным раствором NaHCO₃, 3%-ным раствором KHSO₄, насыщенным раствором NaHCO₃ и водой, после чего сушат с Na₂SO₄ с последующим удалением растворителя в вакууме. Полученный остаток перекристаллизовывают из смеси ЭА-ГК, получают 36,9 г соединения VI. Получение формилметиониллейцилфенилаланил-Nε-карбобензоксилизина 5'-эфира 4'-3-0-изопропилиденпиридоксина
(Form-Met-Leu-Phe-Lys(Z)O-i-Pyr) (VII)
К 30 г (31,15 ммоль) соединения VI прибавляют 42 мл смеси 1:1:0,1 CF₃COOH-CH₂Cl₂ ацетон, охлажденный до 0^оС, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают в вакууме досуха, остаток промывают CF₃COOH-CH₂Cl₂ ацетон, охлажденной до 0^оС, выдерживают 20 мин при комнатной температуре и упаривают в вакууме досуха, остаток промывают высушенным над NaOH эфиром и вносят в охлажденный до 0^о предварительно приготовленный раствор 8,47 г (124,6 ммоль) НСОО^-Na⁺ в 11,75 мл (311,5 ммоль) 98%-ной НСООН т 14,7 мл 155,7 ммоль) Ас₂О. Смесь выдерживают при 0^оС в течение 45 мин и при комнатной температуре 45 мин, после чего выливают в 250 мл сушеного с NaOH эфира. Образовавшийся кристаллический осадок промывают на стеклянном фильтре минимальным количеством охлажденного до 10^оС насыщенного раствора КНСО₃ и охлажденной водой и высушивают под вакуумом, получают 25 г соединения VII. Получение формилметиониллейцилфенилaланиллизина 5'-эфира пиридоксина (Iб) дибромгидрата. В раствор 5 г (5,61 ммоль) соединения VII в смеси 20 мл СНСl₃ и 2 мл безводного ацетона при 0^оС пропускают НВr-газ в течение 40 мин, растворитель удаляют в вакууме, остаток промывают 150 мл сушеного с NaOH эфира. Эфирный слой декантируют, остаток высушивают в вакууме. Полученный продукт растворяют в 50 мл 10%-ного НСООН, раствор упаривают в вакууме досуха, остаток промывают сушеным диэтиловым эфиром, высушивают от эфира в вакууме и получают целевой продукт с количественным выходом в виде соли (бромистоводородной). П р и м е р 2. Получение N-формилметиониллейцилфенилаланина 5'-пиридоксилового эфира (1a). Получение трет-бутилоксикарбонилфенилаланина 4^I-3-0-изопропилиден-5^I-пиридоксилового эфира (Вос-Рhe-O-i-Pys) (VIII)
Соединение VIII получено аналогично соединению III, выход 92%
Получение трет-бутилоксикарбониллейцилфенилаланина 4'-3-0-изопропилиден-5'-пиридоксилового эфира (Вос-Leu-Phe-O-i-Pyr) (IX)
К 2,28 г (5,0 ммоль) соединения VIII прибавляют 20 мл смеси 1:1:0,1 CF₃COOH-CH₂CH₂ ацетон, охлажденной до 0^оС, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают в вакууме досуха, остаток промывают высушенным над NaOH эфиром и вносят в охлажденный до 0^оС раствор 1,14 г (5,0 моль) Вос-Leu-O-NSu в 10 мл СН₂Сl₂. К полученной смеси при 0^оС прибавляют в течение 30 мин 2,09 мл (15 ммоль) Еt₃N в СН₂Сl₂ и оставляют перемешиваться ≈16 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривают от растворителя в вакууме и распределяют в смеси насыщенный раствор NaHCO₃ ЭА, органический слой промывают последовательно 3%-ным раствором, насыщенным раствором NaHCO₃ и водой, после чего высушивают с МgSO₄ с последующим удалением растворителя в вакууме. Полученный остаток перекристаллизовывают из смеси ЭА-ГК, получают 2,71 г соединения IX. Получение трет-бутилоксикарбонилметиониллейцилфенилаланина 4'-3-0-изопропилиден-5'-пиридоксилового эфира. К 2,71 г (4,8 ммоль) соединения IX прибавляют 20 мл смеси 1:1:0,1 CF₃COOH-CH₂Cl₂ ацетон, охлажденной до 0^оС, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают в вакууме досуха, остаток промывают сушеным с NaOH эфиром и вносят в охлажденный до 0^оС раствор 1,66 г (4,8 ммоль) Вос-Меt-O-NSu в 5 мл СН₂Сl₂. К полученной смеси при 0^оС прибавляют 2 мл (14,4 ммоль) ЕtN в СН₂Сl₂ и оставляют перемешиваться 16 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривают от растворителя в вакууме и растворяют в ЭА, органический слой промывают последовательно насыщенным раствором NaHCO₃, 3% -ным раствором КНSO₄, NaHCO₃, насыщенным раствором и водой, после чего высушивают с МgSO₄ с последующим удалением растворителя в вакууме. Полученный остаток перекристаллизовывают из смеси ЭА-ГК, получают 3,20 г соединения Х. Получение формилметиониллейцилфенилаланина 5'-эфира 4'-3-0-изопропилиденпиридоксина. К 3,2 г (4,6 ммоль) соединения Х прибавляют 20 мл смеси 1: 1: 0,1 CF₃COOH-CH₂Cl₂ ацетон, охлажденной до 0^оС, выдерживают 20 мин при комнатной температуре, упаривают в вакууме, досуха, остаток промывают высушенным над NaOH эфиром и вносят в охлажденный до 0^оС предварительно приготовленный раствор 7,28 г (80 ммоль) НСООNa в 7,55 мл (200 ммоль) 98%-ной НСООН и 9,43 мл Ac₂О. Смесь выдерживают при 0^о в течение 45 мин и при комнатной температуре 45 мин, после чего выливают в 100 мл высушенного над NaОН эфира. Образовавшийся кристаллический осадок промывают на стеклянном фильтре минимальным количеством охлажденного до 10^оС, насыщенного раствора КНСО₃, охлажденной водой и высушивают под вакуумом, получают 2,75 г продукта ХI, который растворяют в 50 мл 10%-ной НСООН, раствор упаривают в вакууме досуха, остаток промывают высушенным с NaОН диэтиловым эфиром, высушивают от эфира в вакууме и получают целевой продукт (Ia) с количественным выходом. Физико-химические характеристики целевых и промежуточных продуктов представлены в табл. 1-4. Следующие примеры иллюстрируют биологическую активность предложенных соединений. П р и м е р 3. Проведение анализа хемилюминесценции нейтрофилов периферической крови. Во флаконы сцинтилляционного счета добавляют по 2 мл раствора Хенкса без фенолового красного, содержащего 0,05% ЧСА, 2 мм НЕРЕS (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфокислоты) и 1 ˙ 10^-6 М раствор люминола. Затем во флаконы вносят суспензию нейтрофилов так, чтобы конечная концентрация составляла 0,5 ˙ 10^-6 на 1 мл. Перемешивают содержимое флаконов, помещают их в счетчик и проводят измерение хемилюминесценции при 37^оС в 0,1-минутные интервалы на протяжении 90-120 мин. Разливание среды во флаконы, разведение и добавление клеток выполняют в красном свете. Обычно через 45-60 мин после начала измерения заканчивается прилипание клеток на стекло, интенсивность хемилюминесценции приближается к исходному уровню, в этот период в те же флаконы вносят 20 мкл раствора формилпептида Ia. Параллельно добавляют пептиды Iб (растворы получают разведением 1 мМ раствора формилпептида в ДМСО раствором Хенкса до концентрации 10^-6 М) и снова измеряют хемилюминисценцию, фиксируя число импульсов в минуту на протяжении 30 мин. Результат хемилюминесценции оценивается по максимальному значению на кинетической кривой. П р и м е р 4. Проведение анализа хемотаксина и спонтанной миграции нейтрофилов периферической крови. В стерильную деионизованную воду (можно бидистиллированную) добавляют агарозу в концентрации 12 мг/мл, кипятят на водяной бане до 50^оС. Десятикратную среду МЕММ ("Miles"), содержащую 20% фетальной телячьей сыворотки (конечная концентрация), предварительно подогревают на водяной бане до 50^оС, смешивают с агарозой (1:9) и разливают в стерильные полистироловые чашки Петри 60х15 мм. После застывания агарозного геля при комнатной температуре чашки дополнительно выдерживают 30 мин при 4^оС. Далее с помощью пробойника делают в агарозе лунки диаметром 3 мм, расстояние между ними 3 мм. В качестве хемоаттрактанта применяют соединение II (Form-Met-Leu-Phe-OH) (параллельно соединения Ia, Iб), который вначале разводят до конечной концентрации 10^-3 М (6 мг соединения II в 13,7 мл ДМСО), затем растворяют в растворе Хенкса без Са²⁺ и Мо²⁺ до конечной концентрации 1 ˙ 10^-7 М, разливают на аликвоты по 0,5 мл или 1 мл и хранят при -70^оС. Концентрацию нейтрофилов, выделенных из периферической крови на градиенте фиколла и верографина, доводят в полном растворе Хенкса (с содержанием 0,5% БСА и 2 мМ НЕРЕS) до 5 ˙ 10⁷ на мл. Результаты оценивают следующим образом. В центральную лунку вносят по 10 мкл клеточной суспензии, а в боковые 10 мл формилпептида Iа, Iб (1 ˙ 10^-7 М) или контрольную среду. Чашки инкубируют в течение 1 ч при 37^оС во влажной атмосфере (5% СО₂ и 95% воздуха), затем заливают на 40 мин 2,5% глютаровым альдегидом на фосфатном буфере (рН 7,2). После такой фиксации клеток агарозу удаляют, чашки промывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Миграцию клеток оценивают с помощью окулярмикрометра и увеличения микроскопа в 25 раз. Измеряют следующие параметры: А-миграцию клеток к хемоаттрактанту, В-миграцию клеток в контрольной лунке, С-спонтанную миграцию клеток; определяют хемотактическую разницу (А В). П р и м е р 5. Проведение анализа хемилюминесценции в микрообъеме неразделенной крови. Забирают из пальца кровь в гепаринизированные стеклянные капилляры объемом 60-75 мкл. Переносят кровь в отечественные пластиковые пробирки типа "Эппендорф" объемом на 1,5 мл, содержащие 75 мкл полного раствора Хенкса без индикатора, перемешивают и хранят до момента использования при 4^оС. В другие пластиковые конические пробирки типа "Эппендорф" вносят по 50 мкл водного раствора формилпептида (Iа или Iб), добавляют из пробирки с разделенной кровью 100 мкм последней, тщательно перемешивают. Как и ранее, все процедуры выполняют при красном свете. Пробирки с суспензией клеток и соответствующим пептидом закрывают пробкой и просчитывают на счетчике (Бэта-2, СССР). Данные по оценке биологической активности пептида Iа и Iб представлены ниже. Оба препарата практически в равной мере индуцируют хемотаксическую активность фагоцитирующих клеток, что свидетельствует о наличии у синтезированных пептидов специфической активности. Проведенный хемилюминесцентный анализ на человеческих нейтрофилах показал, что оба исследуемых пептида обладают значительной активностью в данном тесте. Одновременно выявлены важные положительные свойства данных пептидов, в значительной степени отличающих их от традиционно используемых хемоаттрактантов. Вновь синтезированные пептиды оказались хорошо растворимыми в водных растворах, тогда как обычно используемые в экспериментальной и клинической практике хемотаксические пептиды растворяют в ДМСО. Эти свойства пептидов позволяют использовать их в хемилюминесцентном микротесте с использованием неразделенной крови человека. Если в случае использования стандартного хемоаттрактанта не удается зарегистрировать респираторный ответ нейтрофилов в цельной крови (это происходит за счет тушения хемолюминесценции большим количеством ДМСО, в котором растворен пептид), то в случае использования 5'-пиридоксилового эфира N-формилметиониллейцилфенилаланина или 5-пиридоксилового эфира N-формилметиониллейцилфенилаланиллизина, приготовленных на буферном растворе, регистрируется полноценный хемилюминесцентный ответ нейтрофилов, содержащихся в цельной крови. Таким образом, синтезированные пептиды обладают высокой функциональной активностью в тестах хемотаксиса и хемилюминесценции, также как и стандартные пептиды, причем выявлены важные преимущества полученных реагентов за счет растворимости их в водных растворах. За счет этого они могут быть использованы для массового клинического анализа хемилюминесцентной активности нейтрофилов в неразделенной крови.

Формула изобретения

5'-Пиридоксиловые эфиры N-формилпептидов общей формулы
Form-Met-Leu-Phe-A-O-Pyr,
где, если A связь,
если A Lys · HBr,
обладающие хемотаксическими свойствами.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2